大片段DNA的克隆
基因工程课后习题答案
2．质粒DNA和病毒（噬菌体）DNA作为载体的主要特征是什么为外源基因提供进入受体细胞的转移能力；为外源基因提供在受体细胞中的复制能力或整合能力；为外源基因提供在受体细胞中的扩增和表达能力；具有多种单一的核酸内切酶识别切割位点，具有合适的选择标记3．如何理解质粒的不相容性及其在DNA重组克隆过程中的运用意义质粒的不相容性：具有相同或相似复制子结构及调控模式的两种不同的质粒不能稳定存在于同一受体细胞内.4．列举表达质粒、穿梭质粒、探针质粒和cos质粒的不同用途表达质粒:在多克隆位点的上下游分别装有两套转录效率较高的启动子、合适的核糖体结合位点序列（SD）序列以及强有力的终止子结构，使得克隆在合适位点上的任何外源基因均能在受体细胞中高效表达。
穿梭质粒：质粒分子上含有两个亲缘关系不同的复制子以及相应的选择性标记，能在两种不同的受体细胞中复制并检测。
探针质粒：用来筛选克隆基因的表达调控元件。
通常含有报告基因，但缺少相应的调控序列（如启动子或终止子），只有含有启动子或终止子的调控序列被克隆进入载体后，报告基因才能别表达，表达量的大小直接反应了克隆进入的调控元件的强弱。
cos质粒：人工构建的含有λDNA的cos位点序列和质粒复制子的特殊类型的质粒载体。
具有大的装载量，可以用于构建基因组文库。
5． II类限制性核酸内切酶的主要酶学特征是什么分子量较小的单体蛋白，双链识别和切割活性仅需Mg2+，识别位点为4-6个bp的回文序列，切割位点在识别序列中或靠近识别序列7． KLenow酶与大肠杆菌DNA聚合酶I在结构和功能上的主要区别DNA聚合酶I包括大片段(klenow片段)和小片段功能上：DNA聚合酶I比klenow酶多了5’→3’核酸外切酶活性，两者都具有5’→3’DNA聚合酶活性和3’→5’核酸外切酶活性。
8．影响限制性核酸内切酶活性的主要因素有哪些？温度、盐度等物理因素，DNA样品纯度，DNA甲基化程度，限制性核酸内切酶的缓冲液性质，甘油和微量的金属离子会抑制限制性内切酶的活性9.如何理解粘性末端比平头末端更容易连接在退火条件下，粘性末端的连接为分子内反应，平头末端是分子间反应，平头末端的连接反应更加复杂，速度也慢。
pMD19-T载体说明书
TaKaRa Code：D102ApMD®19-T Vector宝生物工程(大连)有限公司目录内 容 Page●制品说明 1●制品内容 1●保 存 1●纯 度 1●用 途 1●pMD®19-T Vector的结构 1 ●实验操作 2■Control DNA片段的克隆实验2■一般DNA片段的克隆实验2●相关说明 3 ●使用注意 4 ●Q&A4●制品说明pMD ®19-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。
本载体由pUC19载体改建而成，在pUC19载体的多克隆位点处的Xba I和Sal I识别位点之间插入了Eco R V识别位点，用Eco R V进行酶切反应后，再在两侧的3＇端添加“T”而成。
因大部分耐热性DNA聚合酶进行PCR反应时都有在PCR 产物的3＇末端添加一个“A”的特性，所以使用本制品可以大大提高PCR产物的连接、克隆效率。
由于本载体以pUC19载体为基础构建而成，所以它具有同pUC19载体相同的功能。
此外，本制品中的高效连接液Solution I 可以在短时间内（约30分钟）完成连接反应，其连接液可以直接用于细菌转化，大大方便了实验操作。
本制品中的Control Insert（500 bp）还可以用于Control 反应。
本载体与pMD ®18-T Vector 相比，本制品的 β-半乳糖苷酶的表达活性更高，菌落显示蓝色的时间缩短，菌落显示的蓝色更深。
因此，克隆后更容易进行克隆体的蓝白筛选。
●制品内容pMD ®19-T Vector（50 ng/μl） 20 μl×1支 Control Insert（50 ng/μl）10 μl×1支 Solution I*75 μl×2支* 使用时请于冰中融解。
●保存： -20℃●纯度■ Control Insert 经克隆后的白色菌落中，有90%以上含有Insert DNA 片段。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。
其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。
载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。
主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。
载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。
细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。
质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。
最常用的质粒是pBR322。
基因库的建造含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。
其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。
cDNA库的建造是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。
cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。
特异基因的筛选常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。
核酸序列测定DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。
扩增较大片段DNA的PCR方法
PCR技术（八）：扩增较大片段DNA的PCR方法一般PCR方法在扩增大片段DNA时的局限性：通常所用的PCR方法都在两个方面有局限，即目标产物精确程度和合成片段的大小。
Pfu(Pyrococcus furiosus)DNA聚合酶，具有完整的3'外切酶校读活性（3'-editing-exonuclease），可以将每个循环中碱基的错配率由10*-4降到10*-3，从而提高PCR产物的准确性。
但它在扩增1.5-2.0kb片段时，效率比Klentaq l(Taq DNA聚酶N-末端缺失突变体，类似于E.coli DNA聚合酶ＩKlenow片段）或Ampli Taq（全长的Taq DNA聚合酶）等聚合酶差；在扩增5.0-7.0kb片段时亦不比各种形式的Taq DNA聚合酶（如Ampli Taq、Klentaq 1、Klentaq 5等N-末端缺失的变异株）有明显优越之处。
因而以往的P CR反应产物限制在5.0kb以内。
超出这一范围，PCR扩增反应效率将明显下降，同时产物会降解。
即使将延伸时间定为30分钟（10倍于通常所需）亦无改进。
利用两种DNA聚合酶进行较大片段DNA的扩增美国华盛顿大学医学院的Barnes WM等对前述问题进行了深入系统的研究，认为：PCR反应效率低最主要的原因是由于错配的碱基阻碍了延伸反应的正常进行，Pfu DNA聚合酶虽然可以通过“校读”功能纠正错配的碱基，但亦可能降解引物，尤其是在较长反应时间下；酶浓度较高时，反应效果更差。
因此必需将Pfu DNA聚合酶的浓度控制在较低状态，同时配合使用Klentaq l等DNA聚合酶，这样既可以有效地去除错配，又可以使Klentaq l等催化的延伸反应顺畅进行。
实验证实，按15:1 的比例混合使用Klentaq l和Pfu DNA聚合酶，引物大小为27-33nt,即可使反应有效进行。
当然，对于各种不同条件的反应，两种类型酶的最佳配比需要具体考虑。
第四章克隆载体的特征及类型
吸附
LamB受体 注入
复制
包装
噬菌体或病毒DNA
大肠杆菌的 l 噬菌体DNA
受体细胞内，pBR322以多拷贝存在，一般一个细胞内可达到 50-100个，而在蛋白质合成抑制剂存在条件下，如氯霉素， 可达到1000-3000拷贝。 缺点： 有被动迁移的可能，不够安全。 抗生素标记插入失活筛选为负筛选法，比较麻烦。
Amp Tet
pBR322
插入片段
Tet平板
Amp平板
质粒
重要的大肠杆菌质粒载体
ColE1、pMB1 拥有相似的复制子结构，彼此不相容 p15A及其衍生质粒拥有相似的复制子结构，彼此不相容 亲缘关系密切的质粒；野生型质粒与其衍生的重组质粒。
质粒的基本特征
质粒
质粒的不相容性：分子机制
两种含有不同复制子结构的不同质粒，在复制时各受自己的 拷贝数控制系统的调节，致使两种质粒的最终拷贝数恒定， 因此在经过若干复制周期和细胞分裂周期后仍能共处于同一 细胞内(亲和性质粒) 两种含有相似复制子结构的不同质粒，在复制时受到同一种 拷贝数控制系统的干扰，致使两种质粒的最终拷贝数不同， 其中拷贝数多的质粒在以后的细胞分裂周期中更具优势
质粒的基本特征
4. 质粒的重组性
质粒
由rec基因控制，使质粒整合到染色体基因组上。 在基因工程应用的是重组缺陷型（rec–）的质粒和菌株。
质粒的基本特征
质粒
5. 携带特殊的遗传标记
野生型的质粒DNA上往往携带一个或多个遗传标记基因，这
使得寄主生物产生正常生长非必需的附加性状，包括：
物质抗性 抗生素、重金属离子、毒性阴离子、有机物
黏性末端
cos
DNA合成控制基因
阻遏基因 早期控制基因
基因工程名词解释
基因工程名词解释1、基因工程：对不同的遗传物质在体外进行剪切、组合和拼接，使遗传物质重新组合，然后通过载体转入微生物、植物和动物细胞内，进行无性繁殖，并使所需的基因在细胞中表达，产生人类所需的产物或新生物类型。
2、重组DNA技术：是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后再转入另一个生物体（受体）内，按照人们的意愿稳定遗传并表达新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。
3、基因xx：经无性繁殖获得基因许多相同拷贝的过程。
通常是将单个基因导入宿主细胞中复制而成。
（包括把来自不同生物的基因同有自主复制能力的载体DNA在体外人工连接，构建成新的重组的DNA，然后送入受体生物中去表达。
从而产生遗传物质和状态的转移和重新组合。
）4、限制性内切核酸酶：一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸水解酶。
5、修饰酶：体内有些酶可在其他酶的作用下，将酶的结构进行共价修饰，使该酶活性发生改变，这种调节称为共价修饰调节(covalentmodificationregulation)，这类酶称为修饰酶(prosessing enzyme)。
6、同裂酶：识别相同序列的限制酶称同裂酶，但它们的切割位点可能不同。
（同序同切酶、同序异切酶、“同功多位”等）7、同尾酶：切割不同的DNA片段但产生相同的粘性末端的一类限制性内切酶。
8、位点偏爱：某些限制酶对同一底物中的有些位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同切割效率。
9、星星活性：极端非标准反应条件下，限制酶能够切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性。
10、甲基化酶：原核生物甲基化酶是作为限制与修饰系统中的一员，用于保护宿主DNA不被相应的限制酶所切割。
11、DNA聚合酶：以DNA为复制模板，从将DNA由5'端点开始复制到3'端的酶。
DNA聚合酶的主要活性是催化DNA的合成（在具备模板、引物、dNTP等的情况下）及其相辅的活性。
实验操作ControlDNA片段的克隆实验
●实验操作■ Control DNA片段的克隆实验A）操作方法■一般DNA片段的克隆实验1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl。
1）在微量离心管中配制下列DNA溶液，全量为5 μl pGala-T Vector1 1μl pGala-T Vector1 1 μl Control Insert2 1μl Insert DNA3 0.1 pmol～0.3 pmol dH2O 3μl dH2O up to 5 μl 2）加入5 μl（等量）的Solution I。
2）加入5 μl（等量）的Solution I。
3）16℃反应30分钟。
3）16℃反应30分钟。
注：①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
注）①室温（25℃）也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
②5分钟也能正常进行连接反应，但反应效率稍微降低。
4）全量（10 μl）加入至100 μl JM109或其他感受态细胞中，冰中放置30分钟。
③长片段PCR产物（2 kbp以上）进行DNA克隆时，连接反应时间请延长5）42℃加热45秒钟后，再在冰中放置1分钟。
至数小时。
6）加入890 μl SOC或LB培养基，37℃振荡培养60分钟。
4）全量（10 μl）加入至100 μl JM109或其他感受态细胞中，冰中放置30分钟。
7）在含有X-Gal、IPTG、Amp的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
计数白5）42℃加热90秒钟后，再在冰中放置1分钟。
色、蓝色菌落。
6）加入890 μl SOC培养基，37℃振荡培养60分钟。
8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
7）在含有X-Gal、IPTG、Amp 的L-琼脂平板培养基上培养，形成单菌落。
计数白B）结果色、蓝色菌落。
使用Control Insert时的连接/转化结果如下，使用的感受态细胞的转化效率为：8）挑选白色菌落，使用PCR法确认载体中插入片段的长度大小。
重组DNA-分子克隆技术
重组DNA技术 Recombinant DNA Techniques
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主要内容
CONTENTS
基本知识
实验流程
实验操作
01
相关问题
02
03
04
克隆与克隆化
01
克隆：指同一副本或拷贝的集合
02
克隆化：获取同一拷贝的过程称为克隆化。
03
分子克隆：为某一研究目的，从众多不同的分子群体中分离的某一感兴趣分子，继而经无性繁殖（扩增）产生的很多相同分子的集合。
粘端连接
CCGG CCGG
GGCC GGCC
CGG C
C GGC
CGG C
C GGC
08
上幸存并形成菌落。
09
标志补救：若克隆的基因能够在宿主菌
01
表达，且表达产物与宿主菌的营养缺陷
02
互补，那么就可以利用营养突变菌株进
03
行筛选，这就是标志补救筛选。
04
01
挑取单菌落，于液体培养基中培养；
03
对质粒进行限制性内切酶酶切；
05
根据酶切产物的大小，鉴定阳性克隆。
02
收集菌体，提取纯化质粒；
在有模板DNA、引物及dNTP存在时，向
DNA合成体系中引入热稳定的Taq DNA聚
合酶。反应体系经变性、退火及扩增循环
自动。反复进行感兴趣DNA片段的酶促合
成，使目的基因按指数增长。
变性、退火、延伸三步曲
变性：双链DNA解链成为单链DNA
退火：部分引物与模板的单链DNA的特定互
补部位相配对和结合
04
琼脂糖凝胶电泳检测；
酶切和电泳
挑取平板上生长的单菌落直接进行PCR；
大片段克隆载体研究进展
BAC 载体系统是在大肠杆菌 F 因子的基础上 发展而来的 , F 因子具有稳定遗传的特点 ,其复制 是严谨型的 ,在每个细胞中仅有 1～2 个拷贝 ,减小 了插入片段发生重组的机率 ,并且 F 因子能够携带 1Mb 的外源片段 。1992 年 ,Shizuya 等[2] 利用 F 因子 的 oriS 、repE 、parA 和 parB 等与复制和调节拷贝数 有关的基因 ,以氯霉素抗性基因为选择标记 ,并利 用电激穿孔转化大肠杆菌 DH10B ,构建了第一个细 菌人工染色体载体 pBAC108L ,它能够克隆约 300kb 的外源片段 ,但是它只有转化选择标记而无重组子 选择标记 ,重组子的选择必需通过杂交进行验证 。 为了进一步方便 BAC 克隆的筛选 ,将 lacZ 基因引 入了 pBAC108L 的克隆位点中 ,构建了pBeloBAC11
Choi 等[6] 将 CreΠloxP 特异位点重组系统引入 BAC 载体 pBeloBAC11 ,构建了 pBACwich 载体 ,为基 因克隆和鉴定提供了一种新载体 。CreΠloxP 特异 位点重组系统使外源基因可以插入到染色体特定 的位点 ,可以在一定程度上消除由于外源基因随机 整合到染色体而引起的“位置效应”。Choi 等[6] 以 pB证明外源 DNA 片段整 合到染色体的特定位点上 。
DNA片段的克隆及常见的问题
TA克隆载体简介 TA克隆载体简介
新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 新开发的快速、高效PCR产物克隆的专用载体 PCR
pCF-T：TA快速克隆载体 ： 快速克隆载体 pCF-Blunt：多克隆位点为平端，不带T，，其他序列与pCF-T 相 ：多克隆位点为平端，不带 ，，其他序列与 ，，其他序列与 适合平末端DNA片段快速连接 同，适合平末端 片段快速连接
主要内容
DNA克隆简介 克隆简介 DNA克隆的操作步骤 克隆的操作步骤 DNA克隆常见问题及解决方案 克隆常见问题及解决方案
TA克隆的流程 克隆的流程
I.高纯度的基因资源
杂交筛选或PCR扩增目的基因 II.杂交筛选或 扩增目的基因
III.目的基因的纯化 III.目的基因的纯化 IV.目的基因与T载体的连接、 IV.目的基因与T载体的连接、转化 目的基因与 V.目的基因的筛选及鉴定 V.
• •
根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA 根据Marker的量及其荧光的强弱，可大致对检测的DNA Marker的量及其荧光的强弱 样品进行定量。 样品进行定量。 使用此法还有一个突出优点， 使用此法还有一个突出优点，即它可令操作者直观地获 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 悉所检测DNA样品的完整性及其大小。 DNA样品的完整性及其大小
反应体系 目的PCR 片段 目的 对照插入片段（ 对照插入片段（700 bp, 50 ng/µl） ） pBS-T载体 载体 Ligase 10×Ligation Buffer × 无菌去离子水 2 – 7 µl —— 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl 阳性对照 —— 1 µl 0.5-1 µl 0.5-1 µl 1 µl 补足到10 补足到 µl
第四章基因克隆的载体、噬菌体载体
溶源周期的主要特征
λ噬菌体的特征： 1、噬菌体的DNA分子注入细菌细胞 2、经过短暂的转录之后，需要合成一种整合酶，于是
转录活性便被一种阻遏物所关闭 3、噬菌体的DNA分子插入到细菌染色体基因组DNA上，
变成原噬菌体 4、细菌继续生长、增值，噬菌体的基因作为细菌染色
体的一部分进行复制。
烈性噬菌体溶菌生长的基本过程：
1、吸附 吸附到位于感染细胞表面的特殊接受器上 2、注入 噬菌体DNA穿过细胞壁注入寄主细胞 3、转变 被感染的细胞成为制造噬菌体颗粒的场所 4、合成 大量合成噬菌体特有的核酸和蛋白质 5、组装 包装了DNA头部和尾部组装成噬菌体的颗粒 6、释放 合成的子代噬菌体颗粒从寄主细胞内释放出来
替换式载体
野生型噬菌体染色体的中段对于噬菌体的感染和复制是非必要的， 外源DNA可以取代这一片段，例如Charon 4A、 λEMBL 3/4、 Charon40等载体，这些载体是用Lac 5（乳糖操纵子的大部分系列， 包括完整的Lac Z）替换入噬菌体的中间区段，同时将Lac5作为选择 标记，使用时用EcoRI水解，去掉中间的片段，再与欲克隆片段在体
2.2λ噬菌体载体
溶菌阶段
(复制和释放)
λ phage
48.5 kb in length Linear or circular genomecos ends(cohesive-end site )
5‘-CGGGGCGGCGACCTCG-3’ 3’-GCCCCGCCGCTGGAGC-5’
外进行重组、包装。而后，感染E.coli使之在E.coli内繁殖，并裂解 E.coli，形成空斑。
spi-选择 λ噬菌体的red和gam基因产物可抑制噬菌体在宿主细菌 中正常生长，red-和gam-突变型λ噬菌体则可正常生长。当置换型载 体的可置换片段中放上red和gam基因后，外源DNA片段取代了置换 片段，则同时除去了red、gam基因，就可在宿主菌中生长，否则就 不能正常生长。
DNA的克隆过程概述
DNA的克隆过程概述DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。
一目的DNA片段的获得DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DN A 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。
二载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。
2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。
同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。
DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。
感染性克隆的发展及应用
F因子的特性使其作为基因组DNA 因子的特性使其作为基因组DNA 的高容量载体具有独特的魅力. 的高容量载体具有独特的魅力.
人工染色体(artificial 人工染色体(artificial chromosome) 的发展为DNA DNA病毒感染性克隆与反向遗 的发展为DNA病毒感染性克隆与反向遗 传操作的建立奠定了技术基础. 传操作的建立奠定了技术基础.
RT-PCR技术 RT-PCR技术
两步法 一步法 超长RT-PCR 超长RTRT
体外、 体外、体内转录技术
体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组 体外转录技术是利用RNA聚合酶将基因组 RNA cDNA拷贝转录成 拷贝转录成RNA cDNA拷贝转录成RNA 体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到 体内转录是将cDNA返回到RNA的过程转移到 cDNA返回到RNA 细胞内完成 人工引入转录终止。 人工引入转录终止。又称为流产转录 transcription),是人为在基因组 （runoff transcription),是人为在基因组 全长cDNA克隆3 端终止RNA聚合酶的合成作用 cDNA克隆 端终止RNA 全长cDNA克隆3’端终止RNA聚合酶的合成作用
E.coli致育因子 致育因子(fertility,F) 致育因子
• F因子是一个约100kb的质粒,编码60多种参 因子是一个约100kb的质粒,编码60多种参 100kb的质粒 60 与复制、 与复制、分配和接合过程的蛋白质 • F+性状作为染色体的标记,可以高效地转移 性状作为染色体的标记, 给受体细胞(F ),提示接合转移需要一个可 给受体细胞(F-),提示接合转移需要一个可 传递的致育因子,该因子被命名为F. 传递的致育因子,该因子被命名为F. • F因子可以整合到宿主染色体中,并且以超 因子可以整合到宿主染色体中, 常的高频率转移遗传标记. 常的高频率转移遗传标记.
dna片段大小筛选方法
dna片段大小筛选方法
DNA片段大小筛选是分子生物学和遗传学研究中常见的实验步骤，用于分离和纯化特定大小的DNA片段。
以下是几种常见的DNA
片段大小筛选方法：
1. 凝胶电泳，这是最常见的DNA片段大小筛选方法之一。
DNA
样品在凝胶中移动，根据片段大小不同而分别迁移，从而实现分离。
琼脂糖凝胶电泳适用于较小的DNA片段（几百至几千碱基对），而
琼脂糖琼脂糖凝胶电泳适用于较大的DNA片段（几千至数十万碱基对）。
2. 聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE），这种凝胶电泳方法适用于较
小的DNA片段（几十至几百碱基对），能够更精细地分离不同大小
的DNA片段。
3. 聚合酶链式反应（PCR）产物纯化，当需要纯化PCR扩增产
物中的特定大小DNA片段时，可以使用凝胶电泳分离后切割目标片段，然后进行凝胶回收或商业化学法纯化。
4. 质粒DNA纯化，在分子克隆实验中，需要纯化特定大小的质
粒DNA片段时，可以使用凝胶电泳或商业化学法进行纯化。
5. 尺寸排除色谱（SEC），这是一种高效液相色谱技术，可以用于分离不同大小的DNA片段。
SEC适用于较大的DNA片段（数千至数十万碱基对）的分离。
6. 磁珠分选法，利用磁珠悬浮液中的特异性结合，可以选择性地富集特定大小的DNA片段，适用于较小的DNA片段（几百至几千碱基对）的筛选。
以上是常见的DNA片段大小筛选方法，实验者可以根据实验需要和样品特性选择合适的方法进行操作。
在进行实验操作时，需要严格按照操作规程进行，并注意安全操作。
三四章分子克隆载体---题目_完_
第三章分子克隆载体（Molecular cloning vectors）一、名词解析二、填空题1.基因工程中有三种主要类型的载体、和。
2.就克隆一个基因来说，最简单的质粒载体也必须包括三个部分和、。
另外，一个理想的质粒载体必须具有低分子质量。
3.如果两个质粒不能稳定的存在已同一个宿主细胞中，则属于群，这是因为他们的所致。
4.pBR 322是一种改造型质粒，它的复制子来源于，它的四环素抗性基因来源于，它的氨苄青霉素抗性基因来源于。
5.Puc18质粒是目前使用较为广泛的载体。
pUC系列的载体是通过和两种质粒改造而来。
它的复制子来源于，Amp抗性基因则是来源于。
6.当λ噬菌体DNA进入宿主细胞以后是靠宿主细胞的和形成封闭的环状的DNA分子的。
7.λ噬菌体是感染大肠杆菌的噬菌体。
8.α-互补是指 lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的阴性的突变体之间实现互补。
9.溶源化的频率和与有关。
10.噬菌体DNA通过其上唯一的整合位点与宿主染色体DNA上的唯一整合位点发生重组，从而整合到染色体中。
11.通过分析大量缺陷型λ噬菌体的 DNA ，发现 J 基因与 Cro 基因之间的 DNA 被或替换后，不影响λ噬菌体裂解生长。
12.对野生型大肠杆菌来说，向溶源和裂解方向的转变是由和决定的。
13.代表性λ噬菌体载体有和14.粘粒的组成包括________，________，________。
15.柯斯质粒(Cosmid)载体：一种由________和_______cos尾巴构建的复合载体。
16.pcos1 EMBL 是设计用于筛选体内重组的重组粘粒文库，通过同源重组过程达到筛选目标克隆的目的。
该载体的复制起点来源于__________质粒，含_________和_________抗性基因。
17.酵母人工染色体由酵母染色体的__________、__________和__________等功能性DNA序列组成。
基因克隆实验手册
【目的DNA片段】 带有限制性内切酶的
酶切末端
In-Fusion克隆
5×In-Fusion® HD In-Fusion酶使 Enzyme Premix 末端15个相同
碱基无缝融合
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
TA克隆
3’ A
A 3’
T载体
T T
限制性内切酶/连接
Bam H Ⅰ
5’ GATC
纯化回收（参考第10页）。
↓ ⑥回收液作为插入DNA片段溶液［A］。
2. 准备载体质粒
①使用限制性内切酶在目的载体质粒（环状）的克隆位点进行酶切反应 【载体的线性化】
载体质粒DNA Hin d Ⅲ Bam H Ⅰ 10 × K Buffer 灭菌水
(≤1 μg) 1 μl 1 μl 2 μl
up to 20 μl(轻弹混合)
10,000 U 10,000 U
1.25 U
灭菌水
up to 50 μl (轻弹混合)
94℃ 1 min. ↓ 98℃ 10 sec. 60℃ 15 sec. 68℃ 30 sec./kb
30 cycles
↓
②PCR扩增产物的纯化 使用TaKaRa MiniBEST DNA Fragment Purification Kit Ver.4.0等 进行PCR扩增产物的纯化（参考第10页）。
利用市面上销售的3’末端附加有 dT的载体。
In-Fusion克隆
利用在引物末端附加与载体末端相同的15个碱基 序列进行目的基因的扩增。
可使用任意载体。仅需限制性内切 酶处理或PCR扩增使载体线性化。
■ 根据使用目的推荐的克隆用试剂盒
实验目的
一.名词解释（100个）
一.名词解释（100个）1.基因工程：指将一种或多种生物体（供体）的基因或基因组提取出来，或人工合成基因，按照人们的的愿望，进行严密的设计，经体外加工重组，转移到另一种生物体（受体）的细胞内，使之能在受体细胞遗传并获得新的遗传性状的技术。
2.遗传工程：凡是人工改造生物遗传性的技术如物理化学诱变、细胞融合、花粉培育、常规育种、有性杂交等，还包括基因工程在内，统称遗传工程。
3.重组DNA技术：它是基因工程的核心内容，指用人工手段对DNA进行改造和重新组合的技术。
4.生物工程：改造生物并生产生物产品的工程技术，是现代生物学中一切工程技术的总称，它包括遗传工程、基因工程外，酶学工程，细胞工程、发酵工程、农业工程等。
5.克隆：是指从一个祖先通过无性繁殖方式产生的后代，或具有相同遗传性状的DNA分子、细胞或个体所组成的特殊的生命群体。
或是指从同一祖先生产这类同一的DNA分子群或细胞群的过程。
6.基因：是遗传的物质基础，是DNA（脱氧核糖核酸）分子上具有遗传信息的特定核苷酸序列的总称，是具有遗传效应的DNA分子片段。
7.基因组：指单倍体细胞中包括编码序列和非编码序列在内的全部DNA分子。
8.限制性核酸内切酶：是一类能识别双链DNA 分子中特异性核苷酸序列并由此特异切割DNA双链结构的水解酶。
9．限制作用：是指一定类型的细菌可以通过限制性酶的作用，破坏入侵的外源DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生物细胞的入侵受到限制.10. 修饰作用：生物细胞(如宿主)自身的DNA分子合成后，通过修饰酶的作用：在碱基中特定的位置上发生了甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶的破坏，这就是限制修饰系统中的含义。
11.粘性末端：是指DNA分子在限制酶的作用之下形成的具有互补碱基的单链延伸末端结构，它们能够通过互补碱基间的配对而重新环化起来。
12．同裂酶(isoschizomers)：有一些来源不同的限制酶识别的是同样的核苷酸靶序列，这类酶特称为。
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大片段DNA的克隆
通常超过3Kb以上的片段不太容易构建到载体上，成功率也是非常的低，根据笔者多年的经验成功克隆过5kb左右的基因片段，
先将一些心得与大家分享：
第一：PCR产物确保正确，扩增长片段往往会出现点突变，缺失插入突变，甚至是并非自己想要的片段，此时就要要求所用的TAQ酶是高质量高保真高前进能力的酶--推荐primerstar，并且保证所设计的引物的特异性，如果有错配的可以尝试不加MCS 的巢式引物，拿第一次PCR产物再用加MCS的引物去扩，可保证起特异性和效率性。
第二：连接要求有效，通常大片段与载体相连接由于空间位阻的原因不太容易得到阳性克隆，所以一定要保证以下几点-目的基因绝对的大量保证在载体的10-15倍摩尔比值；载体最好不要太小，可以直接尝试表达载体；最好使用过夜16度连接（24h以上），快速连接的效果对于大片段来讲并不占优势；连接酶可适当多加。
第三：转化要高效，由于大片段克隆到载体上通常加上载体会比较大，有时甚至超过10-20kb，这时会严重影响转化效率和细菌的生长速度，可以考虑电转或者，300-400ul的感受态细胞，严格按要求转化，使用DH5a时，可能消耗能量的原因，细菌长得
很慢，可以考虑用TOP10,或DH5a多培养一段时间
第四：不轻易放弃，长出来的菌因为质粒很大，去做菌落PCR不一定能检测出来阳性菌，可以考虑照样接种，次日提质粒酶切
鉴定。
也可以多对比几个不同的载体，相信一定能做出来的。
第五：实在是做不出来，将其肢解成多个小片段，每个片段构建到T载上，最后拼接到一起。
第六：克隆大片段真核基因，要保证高质量的RNA，以确保完整的片段，并且需要高质量的逆转录酶，可以将RNA的量加到说明书的上限，保证足够浓度的完整的cDNA片段。
如果大片段的外显子不是很多，还可以考虑用基因组或BAC/YAC来调取目的基因。