黑米花青素提取与纯化工艺研究

黑米花青素提取与纯化工艺研究张文佳;张昊琛;鲍康胜;范广伟【摘要】[目的]研究黑米花青素的提取及纯化工艺.[方法]以黑米为原料,采用水提法提取黑米花青素,通过单因素试验和正交试验,确定花青素的最佳提取工艺；并采用D101大孔吸附树脂对花青素进行纯化.[结果]花青素的最佳提取工艺为料液比1∶8,提取温度50℃,pH 3.2,提取时间120 min;用体积分数为95％的乙醇洗脱,花青素的纯度最高,达95.48％.[结论]该研究为黑米的深加工和花青素的规模化生产提供了依据.%[ Objective] The aim was to study the extraction and purification technology of anthocyanin from black rice. [ Method] Anthocya-nin was obtained from black rice by water extraction. The optimum extraction technology of anthocyanin was determined by single factor experiment and orthogonal experiment. And then the anthocyanin was purified byD101 macroporous adsorption resin. [Result] The results showed that the optimum extraction conditions were as follows; solid-liquid ratio 1: 8, extraction temperature 50 ℃, pH value 3.2, extraction time 120 min . The highest purity reached 95.48% when anthocyanin eluted by 95% ethanol. [Conclusion] The study provided a basis for deep processing of black rice and scale production of anthocyanin.【期刊名称】《安徽农业科学》【年(卷),期】2011(039)036【总页数】3页(P22561-22563)【关键词】黑米;花青素;大孔树脂;提取;纯化【作者】张文佳;张昊琛;鲍康胜;范广伟【作者单位】安徽省合肥市第六中学,安徽合肥230001;安徽省合肥市第六中学,安徽合肥230001;安徽省合肥市第六中学,安徽合肥230001;安徽省合肥市第六中学,安徽合肥230001【正文语种】中文【中图分类】S511黑米是稻米中的珍贵品种，营养丰富，又具有一定的保健作用，被认为是滋补佳品［1］。

《本草纲目》记载，黑米具有滋阴补肾、健脾暖肝、明目活血的功效，又有“补血米”、“长寿米”、“神仙米”的美称［2］。

黑米含有丰富的蛋白质、人体所必需的氨基酸、不饱和脂肪酸、维生素C及钙、铁、锌等矿物营养元素［3］，还含有药用价值很高的黑米花青素，花青素在食品、化妆品、医药、保健等领域有着巨大的应用潜力［4－6］。

天然色素因其直接取自于自然界中的动植物及微生物中，更为安全可靠，开发天然色素取代人工合成色素作为食品着色剂是必然的发展趋势［7－9］。

目前，国内外学者对黑米色素的提取及纯化工艺进行了相关研究。

邓开野等先将黑米粉碎10 min左右，采用含有0.5%苹果酸的70% ～80%乙醇溶液为萃取剂，在70℃的条件下，不断搅拌萃取，离心得大量色素分离液［10］;薛晓丽采用HPLC法测定黑米中花青素的主要成分是矢车菊素-3-葡萄糖苷，其平均含量为41.8%［11］;张名位等采用二次浸提法提取黑米色素，得出最佳工艺条件为采用60%乙醇溶液、料液比1∶4、提取温度60℃、提取时间4 h，在该条件下，第1次浸提黑米色素的得率达71.40%，第2次的浸提率达13.63%［12］;赵权等确定黑米色素最佳提取条件为采用75%乙醇溶液，料液比1∶8，提取温度30℃，提取时间30 min，提取2次，最后黑米花色素苷的浸提率达94.40%［13］;侯方丽等通过5种大孔树脂对黑米皮花色苷的吸附纯化效果比较得出，AB-8大孔树脂对黑米皮花色苷的吸附和解吸能力最强［14］。

笔者采用低碳环保的水提法提取黑米花青素，利用纳滤膜对花青素样品进行分离、浓缩。

通过单因素试验及正交试验，研究提取温度、提取时间、料液比及pH对花青素提取率的影响，得出黑米花青素的最佳提取工艺条件，再采用D101大孔吸附树脂纯化，确定乙醇溶液最佳洗脱浓度，旨在探索一种绿色、环保、高效的花青素分离、纯化工艺。

1 材料与方法1.1 材料1.1.1 供试原料与试剂。

黑米购自合肥市合家福超市。

无水乙醇、95%乙醇、75%乙醇、磷酸氢二钠、柠檬酸、盐酸等均为分析纯。

1.1.2 主要仪器。

722E型可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司);BSZ-100型自动部分收集器(上海精科实业有限公司);HH-2型数显恒温水浴锅(江苏金坛市杰瑞尔电器有限公司);FA1004型电子天平(上海精科天平有限公司);HL-2S恒流泵(上海泸西分析仪器厂);DHP-9162型电热恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司);ACQUITY型液相色谱仪(美国Waters公司)。

1.2 方法1.2.1 花青素的提取及纯化工艺流程(图1)。

1.2.2 操作要点。

①原料选择及处理。

先将黑米中的杂质去除，再用高效粉碎机粉碎，然后过60目筛，得黑米粉末。

②提取。

分别将黑米粉搅拌均匀，在不同的提取温度、时间、料液比、pH下进行提取。

③抽滤。

用布氏漏斗、抽滤瓶和真空泵将反应好的料液抽滤。

④分离。

将抽滤后的提取液放入3 000 Da的膜分离设备中，控制操作压力为0.2 MPa，采用流动水冷却，保持溶液处于室温下，去除残留的低聚糖、多糖、淀粉等成分，得截留液。

⑤吸附。

将经过膜分离的提取液加入一装有大孔树脂的层析柱中，加入体积为树脂体积的4倍，控制流速为2 BV/h。

⑥洗脱。

用不同浓度的乙醇洗脱大孔树脂。

⑦乙醇回收。

将洗脱液放入200 Da的膜分离设备中，控制操作压力为0.2 MPa，采用流动水冷却，保持溶液处于室温下，通过膜分离回收洗脱液中的乙醇。

⑧干燥。

采用冷冻干燥法干燥，得花青素。

图1 黑米花青素的提取及纯化工艺流程Fig.1 The technique process of extraction and purification of black rice anthocyanin1.2.3 单因素试验。

1.2.3.1 料液比对花青素提取率的影响。

精确称取5份3.0 g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1∶4、1∶6、1∶8、1∶10、1∶12的比例分别加入纯净水，常温提取120 min。

抽滤后将滤液定容至250 ml，并在波长530 nm处测其吸光度值。

1.2.3.2 提取温度对花青素提取率的影响。

精确称取5份3.0 g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1∶10加入纯净水，然后将锥形瓶分别放入30、40、50、60及70℃的水浴锅中，保温提取120 min，抽滤后将滤液定容至250 ml，并在波长530 nm处测其吸光度值。

1.2.3.3 提取时间对花青素提取率的影响。

精确称取5份3.0 g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1∶10加入纯净水，然后将锥形瓶放入50℃的水浴锅中，分别提取80、100、120、140 及160 min，抽滤后将滤液定容至250 ml，并在波长530 nm处测其吸光度值。

1.2.3.4 pH对花青素提取率的影响。

精确称取5份5.0 g的黑米粉，放入锥形瓶中，按料液比(W/V)1∶10加入pH分别为 2.8、3.2、3.6、4.0、4.4 的磷酸氢二钠－柠檬酸缓冲液，将锥形瓶放入50℃水浴锅中，保温提取120 min，抽滤后将滤液定容至250 ml，并在波长530 nm处测其吸光度值。

1.2.4 正交试验。

在单因素试验的基础上，考察料液比、提取温度、pH、提取时间对黑米中花青素提取率的影响。

进行L9(34)正交试验(表1)，以提取液的吸光度值为评价指标，确定黑米花青素的最佳提取工艺。

表1 黑米花青素提取工艺的正交试验因素与水平Table 1 The orthogonal test factors and level of extraction technique process of black rice anthocyanin水平Level因素Factor料液比(A)Solid-liquid ratio∥g/ml 温度(B)Temperature∥℃ pH(C)时间(D)Time∥min 1 1∶8 40 2.8 100 2 1∶10 503.2 120 3 1∶12 60 3.6 1401.2.5 标准曲线的制作。

取20 mg/ml花青素标品，用双蒸水分别配成浓度为50、100、250、400、500、600 和 750 ng/ml的标准溶液，取1 μl标准溶液，将其进行HPLC检测。

以花青素的浓度(x)为横坐标，峰面积(y)为纵坐标，绘制标准曲线。

1.2.6 花青素的纯化工艺。

采用D101大孔树脂，选择55%、65%、75%、85%和95%5种不同体积分数的乙醇溶液洗脱，样品流速(1.2～1.5 ml/min)，洗脱液通过纳滤膜分离、浓缩，截留液经冷冻干燥得花青素固体样品。

采用HPLC法确定乙醇的最优洗脱体积分数。

2 结果与分析2.1 标准曲线的确定计算得线性回归方程为y=8.592 9x+412.57(R2=0.991 5)，表明花青素样品浓度与峰面积之间呈良好的线性关系(图2)。

图2 花青素标准曲线Fig.2 The standard curve of anthocyanin2.2 单因素试验结果2.2.1 料液比。

从图3可看出，料液比在1∶4～1∶10时，随着料液比的增加，花青素的得率逐渐增加;当料液比达到1∶10时，吸光度最大，说明花青素的浓度达到最大。

随着料液比的进一步提高，吸光度值减小，原因是稀释倍数增大，花青素的浓度变小。

故初步确定料液比为1∶10时的提取效果最好。

图3 料液比对花青素提取率的影响Fig.3 Effects of solid-liquid ratio on extraction rate of anthocyanin2.2.2 提取温度。

从图4可看出，随着提取温度的升高，花青素得率呈先上升后下降的趋势。