第六章 蛋白质定量和定性分析分解
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4 、用电炉加热,待第一滴蒸馏液从冷凝柱F顶端滴下时起 计时,继续蒸馏5min,然后将锥形瓶放低,使M管离开液面再 蒸馏2min,最后用蒸馏水洗导管外壁.取出锥形瓶,随即将 蒸馏器洗净
四、滴定
用0.01mol/LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止, 记录滴定所用HCl的量
五、蛋白质含量的计算
三 氨的吸收
1 、蒸馏器洗净后,从G加入小瓷片数粒,开放水龙头和P3使 瓷片随水流入A,水放至A球颈处即可.
2 、取150ml锥形瓶,加入2%硼酸20ml(内加2~3滴混合指示 剂),将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层.
3 、准确吸取稀释消化液5ml,由漏斗D注入蒸馏器,少量蒸 馏水冲洗漏斗,加入30%NaOH约5ml,再用少量蒸馏水冲洗, 夹紧螺旋夹并水封,使氨气不会从漏斗处流失.
溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成。
凯氏定氮装置
自动凯氏定氮仪
(三)、实验步骤
一、 消化
称取样品0.5~1g，置于凯氏烧瓶内，不使沾染瓶颈.加入 1gK2SO4,0.5gCuSO4及6ml浓H2SO4，在通风橱内的消化炉上 加热，先用小火,待水分蒸发完后,可用较大的火焰.消化到瓶 内溶液呈透明的蓝绿色为止,但要瓶内无黑点,有则需要瓶内 溶液把它冲洗下去,再加热至澄清为止. 冷却，转入100ml容 量瓶中，以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。
二 蒸馏器清洗
图中所示的蒸馏器使用方法如下:
开放自来水龙头,使水从E进入G, 从K流出,(水不宜开得过大以免水 从G溢出).开放P3使水进入A,从漏 斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指 将G管口掀紧.同时开放P1则B中水 从Y型管中冲出.随后A中水经K流 出.一般情况下,如此重复洗涤两次 即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加 入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml 后蒸馏一次方可使用.
第六章 蛋白质定量和定性分析
(Qualitative and quantitative analysis of protein)
本章内容
第一节 蛋白质含量测定 第二节 蛋白质分子量的测定 第三节 蛋白质纯度分析 第四节 糖蛋白中糖含量分析 第五节 蛋白质序列分析 第六节 生物质谱技术与蛋白质鉴定
第一节 蛋白质含量测定
试样中蛋白质的含量=(V1-V2) ×HClmol/L× 0.014× 20× 6.25×100% /W
V1:滴定试样时用去的HCl的ml数 V2:滴定空白时用去的HCl的ml数 mol/L:HCl的摩尔浓度 W:试样的重量 0.014:氮的毫摩尔 6.25: 氮换算成蛋白质的系数 20: 稀释倍数
A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管 M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相 通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F 为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进 消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的 水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被 酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法
目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法, 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) ， Folin- 酚 试 剂 法 (Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍 使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法 (Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏 度高，比紫外吸收法高10-20倍，比 Biuret 法 高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准 确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方 法的标准蛋白质。
来自百度文库
e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有 特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨 酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分 解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较 深绿色.
3. 再用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算 出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
(NH4)3BO3 + 3HCl→3NH4Cl + H3BO3
实验试剂与仪器
实验试剂 • 浓硫酸 • 硫酸钾（提高沸点）沸点由330℃提高到400℃加
速了消化过程。 • 硫酸铜 （催化剂） • NaOH溶液(30%) • 硼酸溶液(2%) • 盐酸标准溶液（0.01 mol/L ） • 指示剂 :溶于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10ml和
蛋白质含量 = 含氮量×6.25
（二）实验原理
1. 有机物中的氮在强热和CuSO4、浓H2SO4 作用下，消化生成 (NH4)2SO4
含氮有机物+H2SO4→(NH4)SO4 +CO2+H2O+‥‥
2. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于 H3BO3 溶液中。
(NH4)SO4 +NaOH→Na2SO4+2NH3·H2O NH3·H2O-蒸馏→NH3+H2O NH3+H3BO3→(NH4)3BO3
一、微量凯氏定氮法
一、原理
蛋白质的主要组成元素C,H,O,N,S，各种蛋白质中含氮量 恒定在13%-19%，平均为16%。每100克蛋白质中含氮约为16 克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生 物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热 消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后 碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴 定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算出蛋白质含量。
(四)、注意事项
a.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液 体样要混合均匀。
b.样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，以免被 检样消化不完全，使结果偏低。
c.样品中若含脂肪或糖较多,消化过程中易产生大量 泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小 火加热,并时时摇动。
d.当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却, 加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化.
四、滴定
用0.01mol/LHCl滴定锥形瓶内溶液至淡紫色或灰色为止, 记录滴定所用HCl的量
五、蛋白质含量的计算
三 氨的吸收
1 、蒸馏器洗净后,从G加入小瓷片数粒,开放水龙头和P3使 瓷片随水流入A,水放至A球颈处即可.
2 、取150ml锥形瓶,加入2%硼酸20ml(内加2~3滴混合指示 剂),将锥形瓶置于M下并使管口接触至硼酸溶液底层.
3 、准确吸取稀释消化液5ml,由漏斗D注入蒸馏器,少量蒸 馏水冲洗漏斗,加入30%NaOH约5ml,再用少量蒸馏水冲洗, 夹紧螺旋夹并水封,使氨气不会从漏斗处流失.
溶于95%乙醇的0.1%甲基红2ml混合而成。
凯氏定氮装置
自动凯氏定氮仪
(三)、实验步骤
一、 消化
称取样品0.5~1g，置于凯氏烧瓶内，不使沾染瓶颈.加入 1gK2SO4,0.5gCuSO4及6ml浓H2SO4，在通风橱内的消化炉上 加热，先用小火,待水分蒸发完后,可用较大的火焰.消化到瓶 内溶液呈透明的蓝绿色为止,但要瓶内无黑点,有则需要瓶内 溶液把它冲洗下去,再加热至澄清为止. 冷却，转入100ml容 量瓶中，以少许蒸馏水冲洗烧瓶数次，洗液并入容量瓶中， 加水至刻度，摇匀。
二 蒸馏器清洗
图中所示的蒸馏器使用方法如下:
开放自来水龙头,使水从E进入G, 从K流出,(水不宜开得过大以免水 从G溢出).开放P3使水进入A,从漏 斗D中加蒸馏水约10ml入B,用拇指 将G管口掀紧.同时开放P1则B中水 从Y型管中冲出.随后A中水经K流 出.一般情况下,如此重复洗涤两次 即可.若蒸馏器内有氨存在,则应加 入5ml蒸馏水和30%NaOH溶液2ml 后蒸馏一次方可使用.
第六章 蛋白质定量和定性分析
(Qualitative and quantitative analysis of protein)
本章内容
第一节 蛋白质含量测定 第二节 蛋白质分子量的测定 第三节 蛋白质纯度分析 第四节 糖蛋白中糖含量分析 第五节 蛋白质序列分析 第六节 生物质谱技术与蛋白质鉴定
第一节 蛋白质含量测定
试样中蛋白质的含量=(V1-V2) ×HClmol/L× 0.014× 20× 6.25×100% /W
V1:滴定试样时用去的HCl的ml数 V2:滴定空白时用去的HCl的ml数 mol/L:HCl的摩尔浓度 W:试样的重量 0.014:氮的毫摩尔 6.25: 氮换算成蛋白质的系数 20: 稀释倍数
A为蒸气发生器,P3为其进水开关,B为蒸馏室,与出气管 M相通,H为装有定量酸液的锥形瓶,B有Y型管,一端与A相 通,另一端经P4与漏斗D相连,可经此将样品及试剂加入B,F 为指形冷凝管,E为进入管,水经F,G,K而流出,蒸馏时B装进 消化好的样品及NaOH,二者反应生产氨,A因加热而产生的 水蒸气经Y管进入B,将氨一起带出,经M管进入锥形瓶中被 酸吸收,蒸汽经冷凝管F周围被冷却,便于被酸液吸收
微量凯氏定氮法 Folin-酚试剂法 紫外光吸收法 考马斯亮蓝法
目前常用的有四种古老的经典方法:定氮法, 双 缩 脲 法 (Biuret 法 ) ， Folin- 酚 试 剂 法 (Lowry 法)和紫外吸收法.另外还有一种近十年才普遍 使用起来的新测定方法,考马斯亮蓝法 (Bradford法)。其中Bradford法和Lowry法灵敏 度高，比紫外吸收法高10-20倍，比 Biuret 法 高100倍以上。凯氏定氮法比较复杂，但较准 确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方 法的标准蛋白质。
来自百度文库
e.一般消化至透明后,继续消化30min即可,但对于含有 特别难以消化的氮化合物的样品,如赖氨酸、组氨 酸、色氨酸等时,需适当延长消化时间.有机物如分 解完全,消化液呈蓝色或浅绿色,但含铁量多时,呈较 深绿色.
3. 再用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCl消耗的量计算 出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。
(NH4)3BO3 + 3HCl→3NH4Cl + H3BO3
实验试剂与仪器
实验试剂 • 浓硫酸 • 硫酸钾（提高沸点）沸点由330℃提高到400℃加
速了消化过程。 • 硫酸铜 （催化剂） • NaOH溶液(30%) • 硼酸溶液(2%) • 盐酸标准溶液（0.01 mol/L ） • 指示剂 :溶于95%乙醇的0.1%溴甲酚绿溶液10ml和
蛋白质含量 = 含氮量×6.25
（二）实验原理
1. 有机物中的氮在强热和CuSO4、浓H2SO4 作用下，消化生成 (NH4)2SO4
含氮有机物+H2SO4→(NH4)SO4 +CO2+H2O+‥‥
2. 在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于 H3BO3 溶液中。
(NH4)SO4 +NaOH→Na2SO4+2NH3·H2O NH3·H2O-蒸馏→NH3+H2O NH3+H3BO3→(NH4)3BO3
一、微量凯氏定氮法
一、原理
蛋白质的主要组成元素C,H,O,N,S，各种蛋白质中含氮量 恒定在13%-19%，平均为16%。每100克蛋白质中含氮约为16 克。而且生物组织中的氮主要存在于蛋白质中，因此测定生 物组织中的氮含量可计算出蛋白质含量。
蛋白质是含氮的有机化合物。食品与硫酸和催化剂一同加热 消化，使蛋白质分解，分解的氨与硫酸结合生成硫酸铵。然后 碱化蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后再以硫酸或盐酸标准溶液滴 定，根据酸的消耗量乘以换算系数计算出蛋白质含量。
(四)、注意事项
a.样品应是均匀的，若是固体样品应事先研细，液 体样要混合均匀。
b.样品放入凯氏烧瓶时，不要黏附瓶颈上，以免被 检样消化不完全，使结果偏低。
c.样品中若含脂肪或糖较多,消化过程中易产生大量 泡沫,为防止泡沫溢出瓶外,在开始消化时应用小 火加热,并时时摇动。
d.当样品消化液不易澄清透明时,可将凯氏烧瓶冷却, 加入30%过氧化氢2-3mL后再继续加热消化.