最新分子生物学实验设计-蚕豆病课件ppt
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1、血细胞比容比值过低，高铁血红蛋白还原率降低。 应将血细胞比容调整到0.35-0.40
2、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等 应无菌
3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果， 故应2h内送检
4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管 5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏
结果分析方法
1.71~6.84µmol/L
3.42~11.96µmol/L
(－) (－) (－)
少量
意义 ↓ ↓
↑ ↑ ↑
轻度蛋白尿 血管内溶血
－ ↑
主要临床表现：
早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺 乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿， 尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重， 可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时， 出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功 能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏 迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于 1～2日内死亡。
2、设计实验进一步明确诊断。
有和无遗传史 无或有诱因（食用
蚕豆、服用药物、
贫血、黄疸 感染）
体征：脾肿大、黄疸
血常规检查 血清学检查
检查HA的病因
Hb↓、网织红细胞↑ 间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑ 结合珠蛋白↓
怀疑其他HA,相应病因检测结果正常
做1项或2项 高铁血红蛋白还原试验
G6PD筛选试验
G6PD荧光斑点试验
/
0. 1
/ / 0. 01
0. 1
来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h
蒸馏水
10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml
B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度
计算高铁血红蛋白还原率
公式：MHb % = (1 - A/ S) ×100 %
注意事项
正常值：MHb还原率>=75%，脐血>=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：
MHb还原率< 30% 脐血< 40% 杂合子患者：
MHb还原率< 31%~74% 脐血< 41%~76%
实验二
G6PD荧光斑点试验
实验原理
葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸 葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在 340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。 所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0 分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观 察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性
4、为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/L GSSG
分子生物学实验设计-蚕豆 病
案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入
院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、 排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者 的姐姐也曾发生过类似情况。 临床表现：
体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸 40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎 靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人 瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区 无叩击痛，神经系统检查未及异常。
实验室检查：
红细胞 血红蛋白 血清总蛋白 结合胆红素 未结合胆红素 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆原素
病例样本 1.98×1012/L
53g/L
85.5µmol/L
13.7µmol/L
71.8µmol/L
（++） (+) (－) (+)
标准Baidu Nhomakorabea 4.3~4.5×1012/L
170-200 g/L 5.13~18.8µmol/L
1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液
取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂
高铁血红蛋白还原试验操作步骤
试剂
A
B
S
混合试剂/ mL 生理盐水/ mL 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL
0. 01 / /
0. 1
/ 0. 01
实验操作流程
取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀
抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg)
离心沉淀 1000 r/ min 15 min
调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 → 调整后全血（备用）
1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠
1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 → 混合试剂（备用）
亚铁血红蛋白
高铁血红蛋白还原酶
NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体) （实验方向）
高铁血红蛋白
主要试剂和仪器
主要试剂： 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、
0.4mmol/L亚甲蓝溶液 ②、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶 液③、混合液 （等量①+②+③）、生理盐水、抗 凝剂
仪器：
紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支
G6P
G6PD
NADP
6PGA
NADPH
主要试剂和仪器
试剂： 反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、
皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3 份混匀
仪器： 长波紫外灯、滤纸、水浴箱
实验操作流程
取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀， 取一滴于滤纸上（第一斑点 ）→作为对照
将上液置于37℃水浴10min ，再 取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）→实验组
其他筛选试验
确诊溶贫（血管 内溶血）
初诊或确诊 G6PD缺陷症
G6PD确诊试验 做1项 红细胞G6PD活性测定 G6PD基因分析
确诊G6PD
实验名称：
高铁血红蛋白还原试验
G6PD荧光斑点试验
筛选试验
红细胞G6PD活性测定
→确诊试验
实验一
高铁血红蛋白还原试验
实验原理
在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白 氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋 白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中， 高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要 由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上 述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降 （分光光度技术）
晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时 根据结果作出相应诊断
注意事项
1、检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现
2、每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常）作阴 性对照。如可能选用已知G-6-PD缺乏者的标本作 阳性对照
3、如贫血严重取血量应相应加大，或用红细胞混悬液 进行检验
2、细菌污染可产生亚硝酸盐而造成假阳性，试管等 应无菌
3、不稳定Hb、高脂血症等均可出现假阳性结果， 故应2h内送检
4、标本不应有凝血或溶血，故需使用抗凝管 5、在标本内应适当加入葡萄糖，以避免较全血缺乏
结果分析方法
1.71~6.84µmol/L
3.42~11.96µmol/L
(－) (－) (－)
少量
意义 ↓ ↓
↑ ↑ ↑
轻度蛋白尿 血管内溶血
－ ↑
主要临床表现：
早期有恶寒、微热、头昏、倦怠无力、食欲缺 乏、腹痛，继之出现黄疸、贫血、血红蛋白尿， 尿呈酱油色，此后体温升高，倦怠乏力加重， 可持续3日左右。与溶血性贫血出现的同时， 出现呕吐、腹泻和腹痛加剧，肝脏肿大，肝功 能异常，约50%患者脾肿大。严重病例可见昏 迷、惊厥和急性肾衰竭，若急救不及时常于 1～2日内死亡。
2、设计实验进一步明确诊断。
有和无遗传史 无或有诱因（食用
蚕豆、服用药物、
贫血、黄疸 感染）
体征：脾肿大、黄疸
血常规检查 血清学检查
检查HA的病因
Hb↓、网织红细胞↑ 间接胆红素↑尿胆原↑游离Hb↑ 结合珠蛋白↓
怀疑其他HA,相应病因检测结果正常
做1项或2项 高铁血红蛋白还原试验
G6PD筛选试验
G6PD荧光斑点试验
/
0. 1
/ / 0. 01
0. 1
来回摇动15～20 次,置37 ℃水浴箱静置3 h
蒸馏水
10. 00ml 10. 00ml 10. 00ml
B管为空白管, 在波长635 nm处，测定“A”管及“S”管吸光度
计算高铁血红蛋白还原率
公式：MHb % = (1 - A/ S) ×100 %
注意事项
正常值：MHb还原率>=75%，脐血>=77% 临床诊断：纯合子和半合子（XY）患者：
MHb还原率< 30% 脐血< 40% 杂合子患者：
MHb还原率< 31%~74% 脐血< 41%~76%
实验二
G6PD荧光斑点试验
实验原理
葡萄糖-6-磷酸（G6P）在G6PD作用下形成6-磷酸 葡萄糖（6PGA）,同时使NADP转变为NADPH,后者在 340nm波长紫外线照射下产生荧光（反应原理如下图）。 所以将含有G6P和NADP等的混合试剂与血混匀后在0 分钟、5分钟、10分钟分别取1滴血到滤纸上，通过观 察滤纸上有荧光出现时间可判断G6PD活性
4、为提高敏感性可在反应液中加入1份8.0mmol/L GSSG
分子生物学实验设计-蚕豆 病
案例： 患儿，男性，3岁，因面色苍白伴血尿1天入
院。1天前食用新鲜蚕豆后，今日出现恶心、呕吐、 排尿呈酱油样色，面色苍白。据家长反映，患者 的姐姐也曾发生过类似情况。 临床表现：
体格检查：体温38℃，脉搏150次/分，呼吸 40次/分，血压80/60mmHg，呼吸急促，神清，萎 靡，面色苍白，皮肤及巩膜黄染，体型较同龄人 瘦小。心、肺未及异常，肝、脾未触及，双肾区 无叩击痛，神经系统检查未及异常。
实验室检查：
红细胞 血红蛋白 血清总蛋白 结合胆红素 未结合胆红素 尿蛋白 潜血 尿胆红素 尿胆原素
病例样本 1.98×1012/L
53g/L
85.5µmol/L
13.7µmol/L
71.8µmol/L
（++） (+) (－) (+)
标准Baidu Nhomakorabea 4.3~4.5×1012/L
170-200 g/L 5.13~18.8µmol/L
1ml 0.14 mmol/ L 亚甲基蓝液
取试管3 支,标上A、B、S ,按下表加入试剂
高铁血红蛋白还原试验操作步骤
试剂
A
B
S
混合试剂/ mL 生理盐水/ mL 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠0. 28 mol/ L葡萄糖溶液/ mL 经调整的全血/ mL
0. 01 / /
0. 1
/ 0. 01
实验操作流程
取静脉血1. 8mL 于抗凝管，混匀
抗凝管(含0. 2 mL109 mmol/ L抗凝剂+葡萄糖20 mg)
离心沉淀 1000 r/ min 15 min
调整 血细胞∶血浆=1∶1 ，混匀 → 调整后全血（备用）
1ml 0. 18 mol/ L 亚硝酸钠
1ml 0. 28 mol/ L 葡萄糖溶液 混匀 → 混合试剂（备用）
亚铁血红蛋白
高铁血红蛋白还原酶
NADPH(辅酶) 亚甲蓝(递氢体) （实验方向）
高铁血红蛋白
主要试剂和仪器
主要试剂： 0.18mol/L亚硝酸钠-葡萄糖溶液①、
0.4mmol/L亚甲蓝溶液 ②、0. 28 mol/ L 葡萄糖溶 液③、混合液 （等量①+②+③）、生理盐水、抗 凝剂
仪器：
紫外分光光度计水浴箱、离心机、试管3支
G6P
G6PD
NADP
6PGA
NADPH
主要试剂和仪器
试剂： 反应液：G-6-P液1份、NADP液1份、
皂素2份、磷酸盐缓冲液3份和蒸馏水3 份混匀
仪器： 长波紫外灯、滤纸、水浴箱
实验操作流程
取试管，加10μl全血+100μl反应液，混匀， 取一滴于滤纸上（第一斑点 ）→作为对照
将上液置于37℃水浴10min ，再 取一小滴滴于滤纸上（第二斑点）→实验组
其他筛选试验
确诊溶贫（血管 内溶血）
初诊或确诊 G6PD缺陷症
G6PD确诊试验 做1项 红细胞G6PD活性测定 G6PD基因分析
确诊G6PD
实验名称：
高铁血红蛋白还原试验
G6PD荧光斑点试验
筛选试验
红细胞G6PD活性测定
→确诊试验
实验一
高铁血红蛋白还原试验
实验原理
在全血中加入亚硝酸钠，使红细胞中的亚铁血红蛋白 氧化为高铁血红蛋白（MHb）,高铁血红蛋白在高铁血红蛋 白还原酶的作用下又被还原为亚铁血红蛋白。在这过程中， 高铁血红蛋白还原酶不仅需要亚甲蓝作为递氢体，还需要 由G6PD参与磷酸戊糖途径形成NADPH作为辅酶才完成上 述反应。所以，G6PD缺陷症的患者其MHb还原率下降 （分光光度技术）
晾干后，于长波紫外灯下（365nm）观察结果，计时 根据结果作出相应诊断
注意事项
1、检测的第一点作为实验对照应无荧光或弱荧光出现
2、每次试验应用正常标本（已知G-6-PD正常）作阴 性对照。如可能选用已知G-6-PD缺乏者的标本作 阳性对照
3、如贫血严重取血量应相应加大，或用红细胞混悬液 进行检验