圆二色光谱
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❖ CD光谱的测量一般在蛋白质含量相对低(0.01~0.2g/L)的 稀溶液中进行，溶液最大的吸收不超过2。
❖ 溶液浓度的测定：紫外光谱法、定量氨基酸分析；缩二 脲方法、测氮元素的浓度、考马斯亮蓝染料结合比色法、 在完全变性条件下测芳香氨基酸残基的吸收。（《蛋白 质分子基础》高等教育出版社）
❖ 测试条件：环境温度 25℃， 相对湿度60%。
圆二色光谱（CD光谱）
主要内容
1
预备知识
2
圆二色光谱
3
圆二色光谱仪的基本构造
4
CD光谱在蛋白质结构研究中的应用
5
蛋白质CD光谱图的分析
6
CD样品制备及条件选择
预备知识
电场矢量 起偏器
平面偏振光:
振动方向保持不变（只 在一个平面上振动） 振幅发生周期性变化
平面偏振光的产生: 自然光通过起偏器（偏振 片或Nicol棱镜）。
用于拟合的参考蛋白质共有48种，包括有Johnson等报道的29种， Keiderling等报道的5种， Yang等报道的6种及Sreerama等最近报道的3种 球蛋白和5种失活蛋白质。
蛋白质CD光谱分析——定量分析
❖计算方法和拟合程序：
已报道的计算方法和拟合程序较多，按先后分别有： 多级线性回归：拟合程序为G&F，LINCOMB，MLR； 峰回归：拟合程序为CONTIN； 单值分解：拟合程序为SVD； 凸面限制：拟合程序为CCA； 神经网络：拟合程序为K2D； 自 洽 方 法 ： 拟 合 程 序 为 SELCON ； 以 及 最 近 发 展 的 一 种 联 用 方 法，拟合程序为CDSSR 。
❖ 蛋白质的圆二色特征
(1)光学活性基团及折叠结构； (2)250nm以下的光谱区，肽键的电子跃迁引起； (3)250~300nm光谱区，侧链芳香基团的电子跃迁引起； (4)300~700nm光谱区，蛋白质辅基等外在生色基团引起。
蛋Biblioteka Baidu质CD光谱分析——定性分析
分子构象
α-螺旋 （α-helix）
电子跃迁 形式
圆二色光谱
❖ 光学活性物质对左右旋圆偏振光的吸收率之差 是随入射偏振光的波长变化而变化的。以
或有关量为纵坐标，波长为横坐标，得到的图谱。 ❖由于 绝对值很小，常用摩尔椭圆度 来代替，
二者的关系是：
圆二色光谱
❖ 当光学活性化合物对光没有特征吸收时，在谱图 中仅为一条近似水平的直线。
❖ 当光学活性化合物对光存在特征吸收时，通常有 两种情况：当 > 时，得到一个正性的圆二色 光谱曲线；当 < 时，得到一个负性的圆二色 光谱曲线。
蛋白质CD光谱分析——定量分析
SELCON：Sreermna和Woody在原有的一些算法上进行
改进得到，其新的计算程序为SELCON3 程序采用自洽
算法，假设待测蛋白质的二级结构与某种已准确测定结
构的参考蛋白质相同，用测量的CD谱取代参考蛋白质的
CD谱，用单值分解算法(SVD)和多种局部线性化模型，
2
( j N 1 ) 2
1
j 1
蛋白质CD光谱分析——定量分析
CDSSTR： Johnson综合了几种方法的特点，发展起来的 一种新的计算拟合方法。其特点是只需要最少量的参考蛋 白质，就能得到较好的分析结果。拟合计算时，先从已知 精确构象的蛋白质中任意挑选，组成参考蛋白质。每次组 合结果应满足3个基本选择条件：
(1)各二级结构分量之和应在0.95~1.05之间； (2)各二级结构的分量应大于-0.03； (3)实验光谱与计算光谱间的均方根应小于0.25。
最后的拟合结果是能满足以上3个规则所有结果的平 均值。
CD测量的样品准备及条件选择
❖ 测试用的蛋白质样品中应避免含有光吸收的杂质，缓冲 剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查，透明性极好 的磷酸盐可用作为缓冲体系。
n→π﹡ π→π﹡
β-折叠 （β-sheet）
β-转角 （β-turn）
n→π﹡ π→π﹡
n→π﹡ π→π﹡
无规卷曲 (random coil)
π→π﹡
极值的波长
221~222nm(-) 207~210nm(-)
191nm(+)
217~218nm(-) 195~197nm(+)
227nm(-) 弱 200~205nm(+)
α—螺旋
β—折叠
β—转角
P2结构
蛋白质CD光谱分析——定性分析
无 规 卷 曲 向 β 折 叠 转 化
蛋白质CD光谱分析——定量分析
❖ 基本原理：
假设蛋白质在波长λ处的CD信号是蛋白质中各种二 级结构组分的线性加和，则有等式：
C fiCi
假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同，则可利用已知二级结构 的蛋白质或多肽的CD光谱作为参考数据，对未知蛋白质的二级结构进 行拟合计算，能得出α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规线团等结构所占的 比例。
反复计算取代后的收敛性。
CONTIN：由Provencher和Glokner提出，最新的拟合程 序是CONTIN／LL。该方法采用峰回归算法，假设待测 蛋白质的CD光谱是N个已知构象的参考蛋白质CD光谱 的线性组合，进行拟合计算，使下面函数的值最小。
n
N
(C
calc
Cobs ) 2
圆二色光谱仪的基本构造
美国Aviv公司 Model400型圆二色光谱仪
圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用
❖ 蛋白质的圆二色性
(1)由氨基酸通过肽键连接而成； (2)光学活性基团：肽键、芳香氨基酸残基、二硫桥键； (3)蛋白质有多个结构层次，相同的氨基酸序列，因蛋白 质的折叠结构不同，基团的光学活性受到影响。
192.5(-)强
230nm(-) 215~218nm
（+）
195~202nm(-)强
[θ]*103 Deg.cm2/dmol
-38~-40 -36~-40 72~86 -19~-21 28~42
-1.6 1~2 -25~-50
蛋白质CD光谱分析——定性分析
蛋白质CD光谱的波长范围：远紫外区（185-245nm)、近紫外区（245-320nm)
传播方向
预备知识
圆偏振光: 振幅保持不变，而方向周期性变化，电场矢量绕传播方向 螺旋前进。
左右旋圆偏振光：
预备知识
光学活性物质 能使射入物质的平
面偏振光的偏振面旋 转的物质称为旋光性 物质或光学活性物质。 具有手性结构的分子 才有光学活性。 圆二色性
当光通过光学活性物质时，介质对左右旋圆 偏振光的吸收率不同，二者的差称为该物质 的圆二色性（circular dichroism，简写为 CD）。
CD测量的样品准备及条件选择
❖例:
扫描波长范围（Range）250 ~190 nm； 辨析率（Resolution）0.5 nm ； 波长宽度（Band width）1.0 nm； 灵敏度（Sensitivity）20mdeg ； 响应度（Response）0.5 sec； 扫描速度（Speed）200 nm/min； 扫描次数（Accumulation）6。
❖ 溶液浓度的测定：紫外光谱法、定量氨基酸分析；缩二 脲方法、测氮元素的浓度、考马斯亮蓝染料结合比色法、 在完全变性条件下测芳香氨基酸残基的吸收。（《蛋白 质分子基础》高等教育出版社）
❖ 测试条件：环境温度 25℃， 相对湿度60%。
圆二色光谱（CD光谱）
主要内容
1
预备知识
2
圆二色光谱
3
圆二色光谱仪的基本构造
4
CD光谱在蛋白质结构研究中的应用
5
蛋白质CD光谱图的分析
6
CD样品制备及条件选择
预备知识
电场矢量 起偏器
平面偏振光:
振动方向保持不变（只 在一个平面上振动） 振幅发生周期性变化
平面偏振光的产生: 自然光通过起偏器（偏振 片或Nicol棱镜）。
用于拟合的参考蛋白质共有48种，包括有Johnson等报道的29种， Keiderling等报道的5种， Yang等报道的6种及Sreerama等最近报道的3种 球蛋白和5种失活蛋白质。
蛋白质CD光谱分析——定量分析
❖计算方法和拟合程序：
已报道的计算方法和拟合程序较多，按先后分别有： 多级线性回归：拟合程序为G&F，LINCOMB，MLR； 峰回归：拟合程序为CONTIN； 单值分解：拟合程序为SVD； 凸面限制：拟合程序为CCA； 神经网络：拟合程序为K2D； 自 洽 方 法 ： 拟 合 程 序 为 SELCON ； 以 及 最 近 发 展 的 一 种 联 用 方 法，拟合程序为CDSSR 。
❖ 蛋白质的圆二色特征
(1)光学活性基团及折叠结构； (2)250nm以下的光谱区，肽键的电子跃迁引起； (3)250~300nm光谱区，侧链芳香基团的电子跃迁引起； (4)300~700nm光谱区，蛋白质辅基等外在生色基团引起。
蛋Biblioteka Baidu质CD光谱分析——定性分析
分子构象
α-螺旋 （α-helix）
电子跃迁 形式
圆二色光谱
❖ 光学活性物质对左右旋圆偏振光的吸收率之差 是随入射偏振光的波长变化而变化的。以
或有关量为纵坐标，波长为横坐标，得到的图谱。 ❖由于 绝对值很小，常用摩尔椭圆度 来代替，
二者的关系是：
圆二色光谱
❖ 当光学活性化合物对光没有特征吸收时，在谱图 中仅为一条近似水平的直线。
❖ 当光学活性化合物对光存在特征吸收时，通常有 两种情况：当 > 时，得到一个正性的圆二色 光谱曲线；当 < 时，得到一个负性的圆二色 光谱曲线。
蛋白质CD光谱分析——定量分析
SELCON：Sreermna和Woody在原有的一些算法上进行
改进得到，其新的计算程序为SELCON3 程序采用自洽
算法，假设待测蛋白质的二级结构与某种已准确测定结
构的参考蛋白质相同，用测量的CD谱取代参考蛋白质的
CD谱，用单值分解算法(SVD)和多种局部线性化模型，
2
( j N 1 ) 2
1
j 1
蛋白质CD光谱分析——定量分析
CDSSTR： Johnson综合了几种方法的特点，发展起来的 一种新的计算拟合方法。其特点是只需要最少量的参考蛋 白质，就能得到较好的分析结果。拟合计算时，先从已知 精确构象的蛋白质中任意挑选，组成参考蛋白质。每次组 合结果应满足3个基本选择条件：
(1)各二级结构分量之和应在0.95~1.05之间； (2)各二级结构的分量应大于-0.03； (3)实验光谱与计算光谱间的均方根应小于0.25。
最后的拟合结果是能满足以上3个规则所有结果的平 均值。
CD测量的样品准备及条件选择
❖ 测试用的蛋白质样品中应避免含有光吸收的杂质，缓冲 剂和溶剂在配制溶液前最好做单独的检查，透明性极好 的磷酸盐可用作为缓冲体系。
n→π﹡ π→π﹡
β-折叠 （β-sheet）
β-转角 （β-turn）
n→π﹡ π→π﹡
n→π﹡ π→π﹡
无规卷曲 (random coil)
π→π﹡
极值的波长
221~222nm(-) 207~210nm(-)
191nm(+)
217~218nm(-) 195~197nm(+)
227nm(-) 弱 200~205nm(+)
α—螺旋
β—折叠
β—转角
P2结构
蛋白质CD光谱分析——定性分析
无 规 卷 曲 向 β 折 叠 转 化
蛋白质CD光谱分析——定量分析
❖ 基本原理：
假设蛋白质在波长λ处的CD信号是蛋白质中各种二 级结构组分的线性加和，则有等式：
C fiCi
假设溶液态蛋白质与晶体中的二级结构相同，则可利用已知二级结构 的蛋白质或多肽的CD光谱作为参考数据，对未知蛋白质的二级结构进 行拟合计算，能得出α-螺旋、β-折叠、β-转角、无规线团等结构所占的 比例。
反复计算取代后的收敛性。
CONTIN：由Provencher和Glokner提出，最新的拟合程 序是CONTIN／LL。该方法采用峰回归算法，假设待测 蛋白质的CD光谱是N个已知构象的参考蛋白质CD光谱 的线性组合，进行拟合计算，使下面函数的值最小。
n
N
(C
calc
Cobs ) 2
圆二色光谱仪的基本构造
美国Aviv公司 Model400型圆二色光谱仪
圆二色光谱在蛋白质结构研究中的应用
❖ 蛋白质的圆二色性
(1)由氨基酸通过肽键连接而成； (2)光学活性基团：肽键、芳香氨基酸残基、二硫桥键； (3)蛋白质有多个结构层次，相同的氨基酸序列，因蛋白 质的折叠结构不同，基团的光学活性受到影响。
192.5(-)强
230nm(-) 215~218nm
（+）
195~202nm(-)强
[θ]*103 Deg.cm2/dmol
-38~-40 -36~-40 72~86 -19~-21 28~42
-1.6 1~2 -25~-50
蛋白质CD光谱分析——定性分析
蛋白质CD光谱的波长范围：远紫外区（185-245nm)、近紫外区（245-320nm)
传播方向
预备知识
圆偏振光: 振幅保持不变，而方向周期性变化，电场矢量绕传播方向 螺旋前进。
左右旋圆偏振光：
预备知识
光学活性物质 能使射入物质的平
面偏振光的偏振面旋 转的物质称为旋光性 物质或光学活性物质。 具有手性结构的分子 才有光学活性。 圆二色性
当光通过光学活性物质时，介质对左右旋圆 偏振光的吸收率不同，二者的差称为该物质 的圆二色性（circular dichroism，简写为 CD）。
CD测量的样品准备及条件选择
❖例:
扫描波长范围（Range）250 ~190 nm； 辨析率（Resolution）0.5 nm ； 波长宽度（Band width）1.0 nm； 灵敏度（Sensitivity）20mdeg ； 响应度（Response）0.5 sec； 扫描速度（Speed）200 nm/min； 扫描次数（Accumulation）6。