原核表达
原核表达
将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位及功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不及哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株及与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测。
一、试剂准备1、LB培养基。
2、100mM IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于100ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
（三）获得含重组表达质粒的表达菌种1、将连接产物转化大肠杆菌DH5α，根据重组载体的标志（抗Amp或蓝白斑）作筛选，挑取单斑，碱裂解法小量抽提质粒，双酶切初步鉴定。
原核表达步骤
Chi l 原核表达基本试验步骤将克隆化基因插入合适载体后导入大肠杆菌用于表达大量蛋白质的方法一般称为原核表达。
这种方法在蛋白纯化、定位与功能分析等方面都有应用。
大肠杆菌用于表达重组蛋白有以下特点：易于生长和控制；用于细菌培养的材料不与哺乳动物细胞系统的材料昂贵；有各种各样的大肠杆菌菌株与与之匹配的具各种特性的质粒可供选择。
但是，在大肠杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性与构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用，原核表达载体通常为质粒，典型的表达载体应具有以下几种元件：（1）选择标志的编码序列；（2）可控转录的启动子；（3）转录调控序列(转录终止子，核糖体结合位点)；（4）一个多限制酶切位点接头；（5）宿主体内自主复制的序列。
原核表达一般程序如下：获得目的基因－准备表达载体－将目的基因插入表达载体中（测序验证）－转化表达宿主菌－诱导靶蛋白的表达－表达蛋白的分析－扩增、纯化、进一步检测，其中包括：一、试剂准备（1）LB培养基。
（2）1M IPTG（异丙基硫代-β-D-半乳糖苷）：2.38g IPTG溶于10ml ddH2O中,0.22μm滤膜抽滤，-20℃保存。
CCY的IPTG是1M的，用时进行1000倍稀释。
二、操作步骤（一）获得目的基因1、通过PCR方法：以含目的基因的克隆质粒为模板，按基因序列设计一对引物（在上游和下游引物分别引入不同的酶切位点），PCR循环获得所需基因片段。
2、通过RT-PCR方法：用TRIzol法从细胞或组织中提取总RNA，以mRNA为模板，逆转录形成cDNA第一链，以逆转录产物为模板进行PCR循环获得产物。
（二）构建重组表达载体1、载体酶切：将表达质粒用限制性内切酶（同引物的酶切位点）进行双酶切，酶切产物行琼脂糖电泳后，用胶回收Kit或冻融法回收载体大片段。
2、PCR产物双酶切后回收，在T4DNA连接酶作用下连接入载体。
原核蛋白表达流程
原核蛋白表达是一种常用的蛋白质生产方法，可以通过大肠杆菌等原核细菌表达目标蛋白。
以下是一个典型的原核蛋白表达流程：1. 选择表达系统和载体：选择适合的原核表达系统和载体。
常用的原核表达系统包括大肠杆菌系统（如E.coli），常用的载体包括pET、pGEX等。
2. 构建重组质粒：将目标基因克隆到选定的表达载体上，通常采用限制性内切酶切割和连接方法，确保目标基因正确插入载体。
3. 转化宿主菌：将构建好的重组质粒转化入宿主菌中，一般选择适当的大肠杆菌菌株，如BL21(DE3)等。
4. 培养菌液：将含有重组质粒的宿主菌接种到适当的培养基中，进行菌液的培养。
培养条件可根据所选的菌株和载体进行优化，包括温度、培养时间、培养基成分等。
5. 诱导表达：在适当的生长阶段，向培养基中加入适量的诱导剂，常用的诱导剂包括异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）。
6. 细胞破碎：经过一定时间的表达后，收集培养菌液并将细菌进行破碎，释放目标蛋白。
破碎方法可以选择超声波破碎、高压破碎等。
同时添加适量的蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解。
7. 蛋白纯化：通过一系列的蛋白纯化步骤，如亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤层析等，分离纯化目标蛋白。
此步骤可以根据目标蛋白的特性和需求进行优化。
8. 鉴定和确认：对纯化得到的蛋白进行鉴定和确认，如SDS-PAGE凝胶电泳、Western blot等。
确保表达的目标蛋白符合预期。
9. 储存和应用：将纯化好的目标蛋白进行适当的保存和储存，确保其稳定性和活性。
根据需要，可以进行后续的功能研究、结构分析、制备抗体等应用。
需要注意的是，原核蛋白表达流程可以根据实验目的和具体要求进行调整和优化。
不同的表达系统和载体可能需要适应性调整。
此外，对特定蛋白的表达可能需要进一步优化培养条件和蛋白纯化步骤。
原核表达系统的工作原理
原核表达系统的工作原理原核表达系统是指利用原核生物（如大肠杆菌等）来表达外源蛋白质的工具，在生物技术和基因工程领域应用十分广泛。
原核表达系统通过重组DNA技术将目标基因插入原核细胞的表达载体中，并利用细胞自身的代谢机制，将目标蛋白质大量表达出来。
本文将详细介绍原核表达系统的工作原理。
1. 原核表达系统的基本构成原核表达系统的基本构成包括表达载体和宿主细胞两部分。
表达载体是一种重组DNA分子，通常包括以下基本组成成分：（1）起始位点（起始密码子）：在大肠杆菌中通常为AUG。
（2）表达基因：包括编码目标蛋白质的DNA序列和转录启动子、转录终止子等序列。
（3）选择标记：旨在筛选出带有目标基因的细胞，并提高表达效率。
常用的选择标记有抗生素抵抗基因和荧光标记基因等。
（4）复制起点：能够使表达载体在宿主细胞内进行自我复制，提高表达效率。
宿主细胞则是一种能够实现表达载体遗传信号转录、翻译和合成目标蛋白质的生命体。
2. 原核表达系统的工作流程原核表达系统通过以下几个步骤来实现目标蛋白质的表达：（1）制备表达载体将目标基因插入表达载体中，构建成重组DNA分子。
（2）转化宿主细胞将制备好的表达载体转化（transform）到宿主细胞内。
转化过程中，表达载体通过电击、热激或溶菌酶处理等方法，被宿主细胞吞噬并与其细胞质融合。
（3）表达基因转录和翻译转录因子识别插入表达载体的启动子序列，调节基因在宿主细胞内能够合成被表达的mRNA。
转录后的mRNA与核糖体结合，开始翻译，合成蛋白质。
（4）目标蛋白质的后处理和纯化将宿主细胞内表达的蛋白质从培养基或细胞酶中提取出来。
通常采用离心、过滤或柱层析等方法，对蛋白质进行分离和纯化。
3. 原核表达系统的优缺点原核表达系统在生物技术和基因工程领域应用广泛，主要因为其有以下的优缺点。
（1）优点①高效：能够表达大量的目标蛋白质，通常能够达到10%以上的蛋白质总产量。
②简便：操作简便，不需要昂贵的设备，很容易进行规模化操作。
外源基因的原核表达
遗传背景清楚
目的基因表达水平高
培养时间短
16.07.2024
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6
大肠杆菌表达系统的主要不足
• 1、缺少真核生物的蛋白质翻译后修饰 和加工过程。
• 2、表达的蛋白质多以包含体形式存在， 需经复性才能恢复构象与活性
1、不溶性蛋白
2.可溶性蛋白
16.07.2024
精选课件
30
大肠杆菌载体的表达方式
非融合表达载体 融合表达载体 带纯化标签表达载体 分泌型表达载体 表面展示表达载体 带分子伴侣表达载体
16.07.2024
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31
1.非融合表达载体：应用此种载体表 达的蛋白质与天然状态下存在的蛋白 质在结构、功能和免疫原性等方面基 本或完全一致。目前上市的细胞因子 类产品多采用此类表达载体。 2.融合表达载体：分子量较小的蛋白 质常用此类载体进行表达。将外源蛋 白基因与受体菌自身蛋白基因重组在 一起，但不改变两个基因阅读框。
精选课件
43
常见的大肠杆菌基因表达受体菌株
菌株
基因型
启动子
BL 21
hsd S gal
T 7噬菌体
HMS174 M5279 RB791
recA1 hsdR rif lacZ trpA rpsL W3110 lacIq L8
T 7噬菌体 λ 噬菌体PL
lac,tac
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44
大肠杆菌高效表达目的基因策略
• 3.宿主本身杂蛋白质多，纯化步骤复杂。
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7
PET系统_原核表达详细总结
04
应用前景展望
在生物制品领域的应用前景
1 2
疫苗生产
利用PET系统进行原核表达，可实现疫苗抗原的 高效制备，降低生产成本和时间。
抗体药物生产
通过PET系统表达抗体，能够简化抗体药物的生 产流程，提高生产效率和产品质量。
3
生物制品质量控制
PET系统可用于生物制品质量控制，如蛋白质结 构鉴定、功能检测和残留物质检测等。
疾病机制研究
PET技术可用于研究疾病的发 生机制、发展过程和治疗方法 ，有助于深入了解疾病的本质
。
医学影像诊断
PET技术能够提供高灵敏度和特异 性的医学影像，有助于肿瘤、神 经系统疾病等疾病的早期诊断。
生物医学材料研究
通过PET技术对生物医学材料进行 标记和检测，能够提高材料的安全 性和有效性。
05
培养基
提供实验菌种生长和繁殖所需的营 养成分。
试剂和仪器
包括各种分子生物学试剂和细胞培 养设备，用于实验操作。
实验方法
活性检测
通过生物学活性检测，评估目的蛋白的功 能和效果。
目的基因克隆
将目的基因从染色体或质粒上克隆到表达 载体中。
表达载体转化
将克隆好的表达载体转化到实验菌种中。
蛋白纯化
采用各种纯化技术，将目的蛋白从细胞中 分离出来。
诱导表达
通过添加诱导剂或其他方法，启动目的基 因的表达。
02
实验结果
pet系统表达的蛋白质量分析
总结词
在利用PET系统进行原核表达的过程中，需要关注蛋白的质量和产量。
详细描述
通过SDS-PAGE和Western Blot分析，可以检测到目标蛋白的分子量标准，同时利用定量蛋白试剂盒可以测定 其浓度。
原核表达系统
05
原核表达系统的研究进展
研究现状
基因克隆技术
随着基因克隆技术的发展，越来 越多的基因被成功克隆并用于原 核表达系统中，为生物制品的制 备提供了更多选择。
表达载体构建
原核表达系统中的表达载体是关 键因素，目前已经构建了多种高 效表达载体，能够实现外源基因 的高水平表达。
宿主菌选择
宿主菌的选择对原核表达系统的 表达效果至关重要，经过不断筛 选和改良，已成功应用于生产实 践的宿主菌种类不断增加。
通过原核表达系统可以大量制 备蛋白质，用于研究蛋白质之 间的相互作用和复合物组装。
蛋白质工程改造
利用原核表达系统可以对蛋白 质进行体外进化、定向改造等 ，提高蛋白质的特性和功能。
在生物科学研究中的应用
蛋白质组学研究
生物信息学研究
原核表达系统可用于蛋白质组学研究， 大量制备蛋白质并进行分析，揭示蛋 白质的结构和功能。
原核表达系统
目
CONTENCT
录
• 引言 • 原核表达系统的基本原理 • 原核表达系统的应用 • 原核表达系统的优缺点 • 原核表达系统的研究进展 • 结论
01
引言
主题简介
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）作为宿主细胞进行 目的基因表达的技术。
它具有操作简便、成本低廉、表达量高等优点，广泛应用于基因 工程、蛋白质工程等领域。
翻译过程中，宿主菌的 核糖体识别mRNA上 的起始密码子，开始翻 译目的基因，合成蛋白 质。
通过调控启动子和终止 子等元件，可以控制目 的基因的表达水平和方 向。
03
原核表达系统的应用
在生物制药领域的应用
80%
生产重组蛋白药物
原核表达系统可用于生产重组蛋 白药物，如胰岛素、生长激素等 ，用于治疗各种疾病。
《原核表达系统》课件
原核表达系统是一种利用原核生物（如细菌）进行基因表达的方法。通过将外源基因插入到原核生物的质粒或染 色体DNA中，利用这些生物的转录和翻译系统合成目的蛋白。原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、 药物研发等领域。
原核表达系统的应用领域
总结词
原核表达系统广泛应用于基因工程、蛋白质工程、药物研发等领域，用于生产重组蛋白、抗体、疫苗 等生物制品。
药物设计与筛选
蛋白质结晶研究有助于揭示蛋白质的结构与功能关系，为药物设计与筛选提供理论依据 。利用原核表达系统可以快速获得大量具有特定功能的蛋白质，为药物研发提供有力支
持。
蛋白质相互作用研究
互作蛋白的鉴定
通过原核表达系统可以获得与目标蛋白 相互作用的互作蛋白，为互作蛋白的鉴 定提供有力支持。
VS
互作机制的研究
利用原核表达系统可以深入研究蛋白质之 间的相互作用机制，揭示互作蛋白在生命 过程中的作用。
05
原核表达系统的改进 与发展
提高表达产物的产量
探索新的宿主菌
通过选择或改良宿主菌，提高表达产物的产量。例如，使用具有更 强蛋白表达能力的菌株或对现有菌株进行基因改造。
优化培养条件
通过调整培养基成分、温度、pH等条件，促进宿主菌的生长和蛋 白质的表达。
详细描述：原核表达系统的优点包括操作简便、成本低 廉、表达量高等。由于原核生物的遗传背景和生理特征 比较简单，因此在进行基因表达时不需要太过复杂的操 作。此外，原核生物具有较高的繁殖速度，可以快速地 生产大量的目的蛋白。但是，原核表达系统也存在一些 缺点，如表达产物可能存在免疫原性、翻译后修饰功能 不足等。此外，由于原核生物的转录和翻译机制与真核 生物存在差异，因此有些真核生物基因在原核表达系统 中可能无法得到理想的表达效果。
原核表达系统
-原核表达系统一．表达系统：基因工程中用来获得有功能的异源蛋白质的体系，包括克隆载体，表达载体及受体细胞。
据受体细胞的不同可分为：1．原核表达载体系统：将外源基因引入原核细胞，并使其在原核细胞中以发酵形式快速高效地表达合成基因产物的体系。
2．真核表达系统：使外源基因在真核细胞中表达。
二．原核生物基因结构和表达特点1．原核生物染色体DNA是裸露的环形DNA，其转录和翻译是偶联的连续进行。
2．原核生物形成多顺反子mRNA：mRNA在合成过程中和多个核糖体结合，翻译形成多条肽链。
（图）多顺反子mRNA（polycistronic mRNA）：即可作为两个或多个肽链翻译模板的mRNA。
3．一般不含内含子（intron），没有转录及翻译后加工系统。
4．原核生物中功能相关的基因串联在一起，形成操纵子。
操纵子（operon）：是一组功能上相关，受同一调控区控制的基因组成的一个遗传单位。
1）原核生物基因表达的基本单位（即一个转录单位）。
共同协调作用，完成某一多肽的表达调控。
2）包括调控区：调节基因，启动基因，操作基因。
结构基因：5．原核生物中参与转录的基因结构：1）启动子：是DNA上的一段序列，是RNA聚合酶识别并结合部位。
各种不同的原核细胞其启动子各有不同，但均含有下列两个高度保守区（富含AT：易变性解离为单链，为RNA合成提供模板）（1）TATA box（-10区，pribnow box）：转录启始点上游10bp处一段富含AT的碱基TATATTA（2）-35区：长度和顺序个体间差别很大，富含AT是RNA聚合酶识别位点。
转录的启始：RNA聚合酶首先识别启动子的-35区并结合至启动子上，然后开始滑向转录起始点，到-10区时，RNA聚合酶与启动子结合更牢固，并继续向前滑行，大约6-7bp后开始转录（转录起始位点）。
即RNA聚合酶识别并结合启动子，但并不转录（图）。
各种启动子启动转录能力不同。
启动子强弱取决于-35区和-10区的碱基组成及其间隔序列。
原核表达步骤
悬细菌。超声破碎（300W4 S/4S,99次）。超声后液体变清澈。超声时 探头离管底一定距离，防止管破裂。
&12000g, 10mi n,取上清作为待纯化的样品。
9、 混匀镍柱，根据培养物及表达水平装柱2ml（加膜防镍柱漏），用三 个柱床体积50mM PBS（不可溶细菌加8M尿素50mM PBS平衡柱子
原剂使二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束。对于
盐酸胍而言，可以从4M开始，到1.5M时复性过程已经结束。
复性中常采用的方法有： 稀释复性：直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快， 不易控制。
透析复性： 好处是不增加体积， 通过逐渐降低外透液浓度来控制变性剂去除速度， 有人称易 形成沉淀，且不适合大规模操作，无法应用到生产规模。
1可溶性蛋白在细胞容易受到蛋白酶的攻击，包涵体表达可以避免蛋白酶对外源蛋白的降 解。
2、降低了胞外源蛋白的浓度，有利于表达量的提高。
3、包涵体中杂蛋白含量较低，且只需要简单的低速离心就可以与可溶性蛋白分离，有利于 分离纯化。
4、对机械搅拌和超声破碎不敏感，易于破壁，并与细胞膜碎片分离。
分离：
1离心：5000-20000g15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。
杆菌中表达的蛋白由于缺少修饰和糖基化、磷酸化等翻译后加工，常形
成包涵体而影响表达蛋白的生物学活性及构象。
表达载体在基因工程中具有十分重要的作用， 原核表达载体通常为质粒， 典型的表达载体应具有以下几种元件：
（1）选择标志的编码序列；
（2）可控转录的启动子；
原核表达密码子偏好 概述及解释说明
原核表达密码子偏好概述及解释说明1. 引言1.1 概述原核表达密码子偏好是指原核生物在蛋白质合成过程中对编码氨基酸的密码子选择存在一定规律性。
密码子是由三个核苷酸组成的序列，用于编码不同的氨基酸。
在原核生物中，有些密码子被广泛使用，而其他密码子则较少使用。
这种密码子偏好现象引发了科学家们的兴趣，并且对研究人员揭示了一些有关遗传信息传递机制和生物进化的重要见解。
1.2 文章结构本文将以以下几个部分来描述原核表达密码子偏好。
首先，在第2部分中，我们将概述原核表达密码子偏好的基本概念和背景知识。
然后，在第3部分中，我们将解释说明影响原核表达密码子偏好的主要原因和机制。
接下来，在第4部分中，我们将通过实例分析具体介绍常见原核生物中的密码子偏好现象及其解释。
最后，在第5部分中，我们将总结原核表达密码子偏好的特点并展望该领域未来的研究方向。
1.3 目的本文旨在深入探讨原核表达密码子偏好的现象和机制，并通过实例分析加深对该领域的理解。
了解原核表达密码子偏好对我们揭示细胞功能和进化过程具有重要意义。
同时，本文也希望能够促进对密码子偏好研究领域的发展，为未来的研究提供新的思路和方向。
2. 原核表达密码子偏好概述：2.1 什么是原核表达密码子偏好原核生物中的基因编码信息通过密码子来进行转录和翻译，密码子是由三个核苷酸组成的序列，每个密码子对应着一个氨基酸。
然而，在同一种原核生物的基因组中，对于某些氨基酸来说，并非所有可能的密码子都被等概率地使用。
相反，原核生物存在一种选择性地使用某些密码子来编码特定氨基酸的现象，这就是原核表达密码子偏好。
2.2 密码子的定义和功能在DNA或RNA序列中，每三个连续的核苷酸被称为一个密码子。
根据遗传密码表，不同的密码子对应着不同的氨基酸，起到了翻译基因信息为蛋白质序列的作用。
2.3 原核生物中密码子使用的规律性原核生物在使用密码子时并非随机选择，而是存在一定程度上的规律性。
具体而言，原核生物中较为常见或者富集的密碼雙取决于其所编码氨基酸出现频率及其它影响因素。
膜蛋白原核表达
膜蛋白原核表达膜蛋白是一类存在于生物体膜上的蛋白质，其主要作用是参与细胞膜的构成和功能维护。
膜蛋白原核表达指的是利用原核细胞（如大肠杆菌）作为宿主，表达目的膜蛋白的一种技术。
一、制备载体在进行膜蛋白原核表达前，需要首先制备载体。
载体是可以携带外源基因的DNA分子，通常用来在宿主细胞中进行表达。
其中，最常用的载体是质粒，其优点是结构简单、易于操作并且能够在细胞内稳定存在。
二、亚克隆外源基因将目标膜蛋白的DNA序列亚克隆到载体上。
亚克隆技术是指通过DNA重组技术将一种DNA序列嵌入到另一种载体DNA序列中去。
此时，可以在亚克隆所使用的限制酶（也称限制性内切酶）识别位点中将目标膜蛋白的DNA序列嵌入到载体中。
三、转化宿主细胞将含有重组质粒的大肠杆菌细胞进行转化。
转化是指将外源DNA分子导入到宿主细胞内。
这个过程可通过搭配CaCl2、冷冻等方式进行，最终结果是DNA分子进入到宿主细胞的胞质中。
四、筛选阳性菌落利用一些特定的培养基，筛选并分离带有重组质粒的大肠杆菌阳性菌落。
筛选时，常常会在培养基中添加抗生素，以使得带有质粒的细胞可以生长下去，而没有质粒的细胞则无法生长。
通常与筛选方法相搭配的还有荧光筛选、酶标筛选等。
五、纯化目标膜蛋白在得到阳性菌落后，对细胞进行断菌，将膜蛋白纯化出来。
这个过程可通过裂解细胞膜、使用亲和层析等重新制备纯化的方法进行。
六、功能检测检测膜蛋白的功能性质。
这个环节可以使用电生理技术、荧光染料标记、免疫印迹等多种方法，通过测量膜蛋白分子结构和活性，确定膜蛋白的生物学功能。
综上所述，膜蛋白原核表达是一种非常有用的技术，可以为膜蛋白的研究提供了非常重要的技术支持。
随着表达载体、亚克隆技术、表达系统的不断发展，我们对膜蛋白的研究将更为深入和系统。
原核生物基因表达调控
20
同位素示踪实验
把大肠杆菌细胞放在加有放射性35S标记的氨基酸,但没 有半乳糖诱导物的培养基中繁殖几代然后再将这些带有 放射活性的细菌转移到不含35S、无放射性的培养基中 随着培养基中诱导物的加入, β-半乳糖苷酶便开始合成。 分离β-半乳糖苷酶, 发现这种酶无35S标记说明酶的合 成不是由前体转化而来的, 而是加入诱导物后新合成的。
• Jacob和Monod认为诱导酶（他们当时称为适应酶）
现象是个基因调控问题, 可以用实验方法进行研究, 因此
选为突破口, 终于通过大量实验及分析, 于1961年建立
了该操纵子的控制模型。
-
21
酶的诱导
-
22
• 酶的诱导现象是生物进化过程中出现的一种合理、 经济地利用有限资源的本能。
• 酶诱导已证明是低等生物的普遍现象。
倒位片段
鼠伤寒沙门菌鞭毛素基- 因的调节
H1鞭毛素
10
鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimrium）的相转变（phase variation）
-
11
2.σ 因子对原核生物转录起始的调控
σ因子:原核生物RNA聚合酶的一个亚基，是转录起 始所必需的因子，主要影响RNA聚合酶对转录起始 位点的正确识别，这种σ因子称σ70,此外还有分子量 不同,功能不同的其他σ因子 。
ＰＯ
操纵子可视为原核生物的转录单位，它可以逐个
地从原核生物基因组中分离出来，对其结构功
能加以研究。
-
15
3.乳糖操纵子
1) 乳糖操纵子的结构
启动子 操纵基因
调节蛋白
（阻遏蛋白）
-
结构基因
16
3个编码的结构基因
• Z编码β-半乳糖苷酶: 将乳糖水解成葡萄糖和半乳糖，还能 将乳糖转变为异构乳糖
蛋白表达形式
蛋白表达形式
蛋白表达形式主要有以下几种：
1. 原核表达系统：原核表达系统是最早被开发的蛋白表达途径之一，主要利用大肠杆菌（E.coli）作为宿主细胞。
该系统具有操作简单、表达量高等优点，适用于小分子量蛋白的表达。
在原核表达系统中，常用的表达载体包括质粒和噬菌体。
质粒表达途径通过将目标蛋白编码基因插入质粒中，然后将质粒导入宿主细胞，利用宿主细胞的代谢机制表达目标蛋白。
噬菌体表达途径则利用噬菌体感染宿主细胞，将目标蛋白编码基因插入噬菌体基因组中，然后利用宿主细胞的机制表达目标蛋白。
原核表达系统的主要限制是无法表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
2. 真核表达系统：真核表达系统利用真核细胞作为宿主细胞，可以表达复杂的蛋白质结构和糖基化蛋白。
常用的真核表达系统包括酵母表达系统和哺乳动物细胞表达系统。
酵母表达系统主要利用酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)或毕赤酵母(Pichia pastoris)等作为宿主细胞。
除此之外，还有分泌型表达载体、带纯化标签的表达载体、表面呈现表达载体、带伴侣的表达载体等多种表达形式，并且每种表达形式都有其独特的特点和应用场景。
PET系统_原核表达详细总结
疗基因并发挥疗效。
pet系统中原核表达系统的优势
高表达效率
原核生物具有高效的基因转录和 翻译效率，可短时间内大量表达 目的基因。
快速制备
利用原核表达系统，可以在短时 间内制备大量蛋白质或多克隆抗 体，为药物研发和临床试验提供 支持。
成本低廉
原核生物易于培养，繁殖速度快 ，可实现工业化生产，降低生产 成本。
原核表达pet系统的研究方向
01
优化表达载体
02
完善检测技术
进一步探索和优化表达载体，提高表 达产物的纯度和产量。
发展更灵敏、快速的检测技术，提高 pet成像的分辨率和准确性。
03
拓展应用领域
将原核表达pet系统应用于更多的生 物医学领域，如肿瘤学、神经科学等 。
原核表达pet系统的发展趋势
技术创新
02
原核表达系统概述
原核表达系统的定义
原核表达系统是一种在原核生物中利用基因 工程技术表达特定基因产物的技术平台。
原核表达系统以原核生物的基因组、质粒或 噬菌体为载体，通过基因重组将目的基因插 入表达元件，转化原核细胞并表达目的蛋白
。
原核表达系统的原理
通过基因工程技术将目的基因与原核表达载体 相连接，形成重组质粒或重组噬菌体。
03
pet系统与原核表达系统的关系
pet系统中原核表达系统的应用
01
分子生物学实验
应用于分子生物学实验，对特定基因进行体外扩增和克隆，为进一步
研究该基因奠定基础。
02
蛋白质表达
通过原核表达系统，将特定基因在大肠杆菌等原核生物中表达，生产
大量具有生物活性的蛋白质。
03
基因治疗
将治疗基因导入原核细胞，利用原核细胞的转录和翻译系统，表达治来自 THANKS谢谢您的观看
原核表达步骤总结
原核表达步骤总结原核表达步骤总结原核表达步骤原核表达先要将基因克隆到原核表达载体上，然后通过转化到JM109或BL21等菌株中，诱导表达蛋白，然后进行蛋白纯化。
本实验方案的前提是，目的基因已克隆到载体，并已转进入JM109菌株中。
一( 鉴定目的蛋白是否在大肠杆菌JM109或BL21中大量表达制样 (一)1 . 挑取经过双酶切鉴定的单克隆菌落于700ul LB培养基，加入0.7ul Ampo(100mg/mL)，37C200r/min摇床培养，过夜活化。
2. 以1:50比例(200ul)，将活化的过夜培养物加入10mL LB液体培养基中，o加入10uLAmp(100mg/ml)，37C200r/min摇床扩大培养2h-3h，期间取样监控菌液的OD值，控制菌液OD600在0.6-1.0之间，以使大肠杆菌处于最适合表达外源蛋白的生长状态。
(一般3h时，菌液浓度及达到标准，但是不同的基因对菌的影响不同，所以第一次实验时需要确定这个最佳时间)3. 从10ml扩大培养物中取3ml菌液作为不加IPTG的空白对照(CK)，其余ul IPTG(储存浓度为0.5mol/l)，使IPTG终浓度达到0.5mmol/l。
7ml菌液加入7o以200r/min的转速，37C摇床培养3h。
4. 以5000r/min离心2min收集菌体，倾倒上清，每个离心管收集3ml培养物。
5. 加入1ml dHO，将管底沉淀用振荡器打散以充分洗涤，8000r/min离心2min，2倾倒上清。
6. 重复步骤5。
将离心管中的水倒干净。
(二)菌落SDS-PAGE1. 在收集的菌体中加入200ul 1×SDS PAGE loading buffer(可根据沉淀的量增加或减少loading buffer的量，一般200ul比较合适)。
用漩涡器剧烈震荡，确保将管底沉淀震散。
2. 将样品于100?恒温加热器上开盖加热10min(Marker也要加热)。
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Ni Sepharose 6 Fast Flow, 25 mlStorage Conditions 4 to 30°C, 20% EthanolAverage Particle Size 90 µmMetal Ion Capacity ~15 µmol Ni2₊/ml mediumpH Stability2-142)Cleaning-in-Place (CIP)Binding Capacity/mlApprox. 40 mg histidine-tagged proteinChromatographyMediumBioProcess Medium Yes2)Ni²⁺-stripped medium.3)Ni²⁺-stripped medium.Licensing For licensing information, see the Licensing Statements page in the About Ussection.PMSF英文全称：Phenylmethanesulfonyl fluoride中文名称：苯甲基磺酰氟分子式：C7H7FO2S分子量：174.19CAS号：[329-98-6]PubChem号：4784使用介绍：1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；2）10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；3）在室温可保存一年,一般保存在-20度或4度.；4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~1mM），储存液浓度为100或200mM；5）在水液体溶液中不稳定，30分钟就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h,补加一次。
（见水分解，使用前加入）【注意事项】1. PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。
为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。
一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。
凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。
2. PMSF在水溶液中不稳定。
应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。
3. PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。
pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。
PMSF的储存：2-8℃可以存放数月之久。
欲长期保存，可冻存在-20℃溶菌酶用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。
每一小份一经使用后便予丢弃。
3M咪唑分子量68.08（50ml）10.2g---加50ml dd水，过滤除菌5mol/L氯化钠分子量141.96（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml Binding buffer1L ph8.0Tris （121.14 g/mol）2.42gNacl 70.98g咪唑3M的加1.67ml甘油100ml甘油防止蛋白间的疏水作用，同时甘油也是保护剂Elution buffer生物通原核表达技术专辑：表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。
表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。
原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。
当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。
原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。
做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。
首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。
前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。
同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。
当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。
如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。
比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。
根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。
在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：1.翻译起始位点现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图谱上是否注明有起始密码子和终止密码子2.GC含量表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。
GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等软件进行预测。
3.二级结构在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。
如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。
4.基因或者蛋白的大小一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。
蛋白越小，越容易被降解。
在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。
如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP 或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表达。
对于另一个极端，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签，如6×组氨酸标签。
对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。
当然表达时要根据目的进行截取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。
对于抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结论，如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的话还是不妨一试的。
5.亲疏水性这也是一种经验之谈，相信经常做表达的人都发现表达亲水区域时表达量会比较高，如果你要表达一个膜蛋白，那么劝你做好长期抗战的准备吧。
有许多软件可以对氨基酸的亲疏水性进行分析，比如Vector NIT Suite，除此之外还可以利用在线跨膜区预测软件http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/ 对跨膜区进行预测。
对于自己表达的蛋白有所了解后就可以开始对载体进行选择了，目前商业化的载体基本上包含以下几个元件：除了上面标出的元件外还需要有复制起点，它对于控制质粒的拷贝数非常重要；另外就是筛选标记了，比如蓝白斑筛选的lacZ，各种抗生素标记。
在以上几个元件中，我们需要注意的是负责调节与启动的元件，也就是调控子和启动子。
其中启动子对于蛋白表达的速度起着举足轻重的作用，它与最终蛋白的表达量、是否可融密不可分。
这里，对于世面上广泛销售的几种原核表达载体使用的启动子进行总结。
启动子来源调控手段（浓度）强度LacUV5 乳糖操纵元lacI/IPTG (0.1-1mM) 强Trp 色氨酸操纵元trpR 3-β-吲哚丙烯酸强Tac 结合了色氨酸启动子的-35序列和乳糖启动子的-10序列lacI/IPTG (0.1-1mM) 强PLλ噬菌体λcI阻遏物/温度强噬菌体T5 T5噬菌体lacI/IPTG (0.1-1mM) 强pBAD 阿拉伯糖操纵元AraBAD/阿拉伯糖（1μm-10mM）严谨T7 T7 RNA聚合酶lacI/IPTG (0.1-1mM) 非常强乳糖操纵子是应用最广泛的调控模式，除了IPTG这种化学诱导方式之外还有利用吲哚丙烯酸和阿拉伯糖的化学诱导。
如果你害怕这些化学物质会损害细菌的生长，那么你可以尝试利用温度诱导的载体，如：pDH2。
它利用PL启动子，在温度上升到42℃后进行诱导表达。
可以看到在所有启动子里属T7启动子最强，它可以将大肠杆菌的资源最大程度地调用过来表达外源蛋白。
这样一些难表达的蛋白都可以在pET系统里面表达出来，但是是不是越强就越好呢？如果你需要表达蛋白是可溶的，那么T7启动子就不那么适合了。
较弱的启动子转录速度较慢，这样对于表达可溶、稳定、完整的蛋白比较有利。
Novagen可以说是的pET系统是最王牌的T7启动子表达系统，可是当T7启动子的强启动效应不受欢迎的时候怎么办呢？在这里给读者留个小小的疑问，看看大家有没有仔细看笔者写的Novagen篇。
提示一下，虽然它转录速度快，但是可以控制它的拷贝数，又或者是……利用这些原理Novagen载体也可以毒性高的外源蛋白。
载体上除了启动子这个需要注意之外，另外一个就是标签了。
很多标签是为了增加蛋白的可溶性，也有一些是为了方便鉴定表达产物，所以在表达时可以选择加标签。
是否加标签要看个人需要，笔者认为如果是表达一个人家没表达过的蛋白最好还是加标签，这样方便将来鉴定。
如果从经济角度考虑最好加入6×组氨酸标签，笔者曾经以为加什么标签都无所谓（前提是不需要融合表达），结果加了个Novagen的T7·Tag，等到鉴定的时候发现单抗那么贵。
而且还不好买的，一些较少人用的标签会让你很伤脑筋。
这也是表达前要准备的功课之一哦。
好了，如果你选好了载体，那么下一步就是设计引物的。
相信大多数人都是利用PCR 把目的基因调出来的吧。
设计引物可以使用一下两个软件，Primer Premier或者Oligo。
如果要表达全长，其实也就没那么多要考虑，从一头一尾找至少8个匹配序列在加上与载体匹配的序列就可以了。
不过，我还是有以下几点提醒一下各位：1.这一点其实很容易理解，但是有时也容易被遗忘。
那就是先查查表达外源片段中含有什么内切酶位点，不要设计重了，否则酶切时发现怎么老是有预期外的小片段出现。
2.根据载体上的酶切位点设计引物，现在许多类似T载原理的克隆方法也可以应用到原核表达中了，如果T载克隆方法要定向很多时候要多加4个碱基，设计引物时候可别忘了加。
在设计酶切位点的5’端不要忘了加保护碱基，不同内切酶所需的保护碱基不同，SalⅠ不需要保护碱基，EcoRⅤ需要1个，NotⅠ需要2个，HindⅢ最好有3个。
一般情况下，都设计2个。
3.注意启始密码子和终止密码子的读码框。
如果载体上有ATG可以不另外加了，但是通常ATG后不是紧跟外源片段的，如果中间含有载体序列，务必确定中间这段序列不会造成你外源序列的移码。