原核表达

Ni Sepharose 6 Fast Flow, 25 ml

Storage Conditions 4 to 30°C, 20% Ethanol

Average Particle Size 90 µm

Metal Ion Capacity ~15 µmol Ni2₊/ml medium

pH Stability

2-142)

Cleaning-in-Place (CIP)

Binding Capacity/ml

Approx. 40 mg histidine-tagged protein

Chromatography

Medium

BioProcess Medium Yes

2)Ni²⁺-stripped medium.

3)Ni²⁺-stripped medium.

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section.

PMSF

英文全称：Phenylmethanesulfonyl fluoride

中文名称：苯甲基磺酰氟

分子式：C7H7FO2S

分子量：174.19

CAS号：[329-98-6]

PubChem号：4784

使用介绍：

1）抑制丝氨酸蛋白酶（如胰蛋白酶，胰凝乳蛋白酶，凝血酶）和巯基蛋白酶（如木瓜蛋白酶）；

2）10mg/ml溶于异丙醇（或无水乙醇）中；

3）在室温可保存一年,一般保存在-20度或4度.；

4）工作浓度：17~174ug/ml（0.1~1mM），储存液浓度为100或200mM；

5）在水液体溶液中不稳定，30分钟就会降解一半，必须在每一分离和纯化步骤中加入新鲜的PMSF，样品处理超过1h,补加一次。（见水分解，使用前加入）

【注意事项】

1. PMSF剧毒，严重损害呼吸道粘膜、眼睛及皮肤，吸入、吞进或通过皮肤吸收后有致命危险。为了安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。一旦眼睛或皮肤接触了PMSF，应立即用大量水冲洗之。凡被PMSF污染的衣物应予丢弃。

2. PMSF在水溶液中不稳定。应在使用前从贮存液中现用现加于裂解缓冲液中。

3. PMSF在水溶液中的活性丧失速率随pH值的升高而加快，且25℃的失活速率高于4℃。pH值为8.0时，20μmmol/l PMSF水溶液的半寿期大约为85min，这表明将PMSF溶液调节为碱性（pH>8.6）并在室温放置数小时后，可安全地予以丢弃。

PMSF的储存：2-8℃可以存放数月之久。欲长期保存，可冻存在-20℃

溶菌酶

用水配制成50mg/ml的溶菌酶溶液，分装成小份并保存于-20℃。每一小份一经使用后便予丢弃。

3M咪唑分子量68.08（50ml）

10.2g---加50ml dd水，过滤除菌

5mol/L氯化钠分子量141.96（NaCl）：溶解29.2g氯化钠于足量的水中，定容至100ml Binding buffer

1L ph8.0

Tris （121.14 g/mol）2.42g

Nacl 70.98g

咪唑3M的加1.67ml

甘油100ml

甘油防止蛋白间的疏水作用，同时甘油也是保护剂

Elution buffer

生物通原核表达技术专辑：表达不同于其它一些实验，比如：提取质粒、PCR、电镜切片，这些人为控制的因素比较多，出问题相对来说也比较好分析。表达呢，你把质粒克隆好啦，交给细胞，然后有些事情就不全是你要怎样就怎样了。原核表达在表达当中来说还是比较简单，细菌培养条件简单、生长速度快，需要的仪器和培养基都比较便宜。当然，它也存在一些缺乏高级修饰、细胞内部还原性过高等缺点。

原核表达从一开始的设计就非常重要，所谓好的开始是成功的一半。做足准备功夫，可是省去很多将来后悔的事情。首先，我们要根据是否要求可溶将载体分成两大类，如果希望可以同时尝试多种表达系统，也有许多商业化的系统供选择。

前面已经介绍过许多公司的商业化载体、菌株和多系统表达体系，现在我想先从自己的蛋白分析讲起。同样的载体、同样的系统，很可能表达这个蛋白表达量奇高，但是另外一个就是做不出来，所以没有万能的载体，只有永恒的分析。当然如果你的蛋白曾经在原核系统中成功表达出来那是最好的，选择同样的载体表达成功率会高很多。如果没有也最好尝试找一些曾经表达过和你的蛋白拥有相类似结构的文献。比如大部分含有哺乳动物src同源的SH2蛋白相互作用域的蛋白都是用pGEX系列载体表达出来的。根据经验而言，含有较少半胱氨酸和脯氨酸的、平均大小为60kD的单体蛋白较容易表达。

在下面将列出几个影响表达的因素，大家可以在表达前根据这几个因素自己分析一下：

1.翻译起始位点

现在大部分的表达载体都提供起始位点，所以它已经把起始密码子与核糖体结合位点的距离进行优化了，一般情况下不需要自己再加，不过还是要留意载体图

谱上是否注明有起始密码子和终止密码子

2.GC含量

表达序列中的GC含量超过70％的时候可能会降低蛋白在大肠杆菌中的表达水平。GC含量可以利用DNA STAR、Vector NTI Suite等软件进行预测。

3.二级结构

在起始密码子附近的mRNA二级结构可能会抑制翻译的起始或者造成翻译暂停从而产生不完全的蛋白。如果利用软件分析DNA或RNA结构上有柄（stem）结构，并且结合长度超过8个碱基，这种结构会因为位点专一突变等因素而变得不稳定。

4.基因或者蛋白的大小

一般说来小于5kD或者大于100kD的蛋白都是难以表达的。蛋白越小，越容易被降解。在这种情况下可以采取串联表达，在每个表达单位（即单体蛋白）间设

计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，那么加入融合标签GST、Trx、MBP 或者其它较大的促进融合的蛋白标签就较有可能使蛋白正确折叠，并以融合形式表

达。

对于另一个极端，大于60kD的蛋白建议使用较小的标签，如6×组氨酸标签。对于结构研究较清楚的蛋白可以采取截取表达。当然表达时要根据目的进行截

取，如果是要进行抗体制备而截取，那么一定要保证截取的部位抗原性较强。对于

抗原性也可以利用软件分析，比如Vector NIT Suite或者一些在线软件，不过在分析之余也要认识到这是一种数据统计的结论，如果蛋白和免疫动物亲缘关系较远的

话还是不妨一试的。