常用实验方法总结

一、PCR：

Takara ExTaq体系组成：

Takara ExTaq （5U/UL）：0.25

10*EXTaqBuffer : 5 UL

dNTP Mixture (各2.5mM) : 4 UL

Template ： 1.05 UL

正向引物: 2UL

负向引物：2UL

Dddw : 35.7(加水至50UL)

步骤：灭菌蒸馏水→10*EXTaqBuffer→正向引物→反向引物→dNTP Mixture→Template→Takara ExTaq

ＰＣＲ体系（３０Ｃｙｃｌｅｓ）：

９８℃１０Ｓ；

５５℃３０Ｓ

７２℃１ｍｉｎ

扩增的DNA放到-20度冰箱保存。

二、跑胶切割回收：（在跑胶的实验台上一定要带上一次性手套，防止污染，也保护自身，且只限于跑胶试验区域使用，否则会污染其他或者其他区域）

1、配1%琼脂糖凝胶（50 UL体系）：

1.1用称量纸片（抽屉里）电子天平取0.4g的琼脂粉（）；

1.2配40ML的1*10的TBST缓冲液与100ml的三角烧瓶里；

1.3倒入琼脂粉摇匀，并转到微波炉中加热（一般是50S,加锡箔纸封盖）溶解完全；

1.4用手套取出到凉水稍稍晾凉至温热后，加入核酸酶（Eb替代物）2ul；要边加边

摇匀，使之充分摇匀；

1.5倒入组装好的电泳槽中（一般是三个大孔和两个小孔的，梳子要插到底下有红色

条带的一方，方便加样），冷凝20min；

1.6胶凝后取胶放到电泳槽中，倒入电泳液至浸过凝胶；

1.7从冰箱中取出MARK和loading buffer，加入6ULloading buffer到样品中混匀；然

后用加样枪分别加到凝胶的大孔中（要缓慢加，不要穿破凝胶，最后抢不要打尽

以至于有空气使样品吹打出来）；MARK加到小孔中的任一孔；

1.8盖上电泳槽，正负极要插对（红对红，黑对黑），打开电源调至60~80V，40~60min。

1.9观察条带（mark或样品是否有条带显示）

MARK用1000*/loading buffe+多大KB的除以R得到样品加多少体积

2、切胶：

1.1将已跑出条带的凝胶转至切胶机上（要用一次性手套垫着），打开紫外荧光，盖

上滤光板，将样品的条带形状切下（若太大可适当修剪，但不能切到有条带显示

的地方）；

1.2用干净无菌的EP装切下来的凝胶，装好；

3、胶DNA回收(通用型DNA纯化回收试剂盒，离心柱型)：回收8~100bp的DNA （80%回收率）

产品组成：溶液PC（Buffer PC）,平衡液BL（BL），漂洗液PW（PW），洗脱缓冲液EB，吸附柱CB2，收集管（2ML）

试剂置于室温（15~25℃）干燥条件下，在2~8℃保存更长，若有沉淀则室温或者放置37℃水浴预热至溶解。

使用前检查平衡液BL是否出现浑浊，若有则37℃水浴加热几分钟，即可澄清，溶液PC 含有指示剂，为黄色，只是pH≤7.5

操作步骤：

1.1柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500UL平衡液BL，

12000rmp；离心1 min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中（洗

涤平衡住）；

1.2将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的

离心管中，称取重量；

1.3向胶块中加入等倍体积溶液PC（若凝胶重0.1g，体积为100UL）50℃水浴放置

10min且不断温和转动，确保胶块充分溶解（若胶块过大，可切成碎块），胶块溶

解完全后最好将溶液温度降至室温上柱；

1.4上平衡柱离心12000rmp/1min;弃收集管废液，吸附柱放回收集管；

1.5向吸附柱加入600UL漂洗液PW（使用前检查是否加入无水乙醇），静置2~5min

钟12000rmp/1min离心弃废液，吸附柱放回收集管；

1.6重复上一步操作；

1.7将吸附柱放回收集管中，12000rmp/2min离心，尽量除去漂洗液。将吸附柱置于

室温放置数分钟，彻底晾干。（漂洗液中的乙醇残留会影响后续酶反应（酶切，

PCR）实验）

1.8将吸附柱放入一个干净的离心管，向吸附膜中间位置悬空滴加适量的洗脱液EB

（一般用蒸馏水ddw，方便后续做测序）不少于30UL，室温放置2min，

12000rpm/2min离心，回收DNA（为了提高回收量可重新再离一次）

1.9保存-20℃以防DNA降解。

ＴＡ克隆及转化：

TA克隆技术（TA cloning）利用Taq聚合酶具有末端转移酶（TdT）活性，但却不具有3'-5'端外切酶校准活性的特点，可在PCR产物的3'端加上一个非模板依赖碱基“A”。pMD18-T是一种高效克隆PCR产物的专用载体，它是由pUC18载体在Xba I和Sal I 识别位点间插入一个EcoR V位点，然后用EcoR V进行酶切使质粒线性化，并在它的3'端添加“T”构建而成。因其3'端带有一个突出的“T”尾，能高效地与带“A”尾的PCR产物连接，极大地提高了克隆的效率。TA克隆是目前克隆PCR产物最简便、快捷的方法。

1、取出目的DNA和T载体，ddw, 从-80℃取出DH5α大肠杆菌感受态均放入冰盒中；

2、T载体离心后放入冰盒中

3、反应体系：先加ddw 1 UL入PCR管中,再加入离心后的T载体，最后加入目的基

因DNA，轻弹混匀，小离心机离心，室温放置10min；

1~2kb10~15min

2~3kb15~20min

3kb以上20~30min

★转化：

1.将克隆后的载体基因加入到DH5α大肠杆菌中，放入冰盒30min；

2.42℃水浴45 S，取出放入冰盒2min；

3.加入500UL的SOC（或纯LB）；预摇45min；

4.5000rpm/5min离心，去上清800UL（留50~100UL）；

5.混匀涂板（涂布棒要无菌）过程无菌操作；

6.37℃温箱培养8~9h;

挑单克隆：

从温箱中取出已长好单克隆的平皿，用枪头挑单克隆菌落，打入已装入5ml相应抗性LB培养液中小摇（盖子稍微松，粘好胶带固定），过夜。

提质粒：(小提)

1.柱平衡：向吸附柱CP3中加入500UL的平衡液BL，12000rpm离心1min.倒掉收集管中

的废液，将吸附柱从新放回收集管中。

2.取1~5ml过夜培养的菌液，加入离心管中，12000离心1min.吸出上清。

3.向留有菌体沉淀的离心管中加入250UL的溶液P1，（检查是否已经加入RnaseA）,使用

移液枪或者漩涡振荡器彻底悬浮细菌沉淀。

4.向离心管中加入250 UL 溶液P2，温和的迅速上下翻转6-8次，使菌体充分裂解，静置

3min.

5.向离心管中加入350 ul的溶液P3，立即温和的上下翻转6-8次，充分混匀，此时将出现

白色絮状沉淀，12000rpm/10min.

6.将上一步收集的上清液用移液枪转移到吸附柱CP3中，注意尽量不要吸出沉淀，

12000rpm/1min,倒掉收集管中的废液，将吸附柱CP3放入收集管中。

7.向吸附柱CP3中加入500UL的去蛋白液PD，12000rpm/1min,倒掉废液，CP3放回收集

管中。

8.向CP3中加入600UL的PW(检查是否加入无水乙醇)，12000rpm/1min, 倒掉废液，CP3

放回收集管中。

9.重复8.

10.将CP3放入收集管中，12000rpm/2min,，目的是将吸附柱中残余的漂洗液除去，开盖静

置5min.

11.将CP3放入一个新的EP管中，向吸附膜的中间部位滴加80UL ddw,室温放置

2min,12000rpm/2min,将质粒溶液收到离心管中。

12.测定浓度，纯度，2.5ul。

13.-20℃保存。