浅析细菌内毒素检测方法及常见问题
中国药典 细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法
中国药典细菌内毒素检验方法中，按以下步骤进行实验。
首先，制备试样溶液。
将待测样品溶解在合适的溶剂中，并通过过滤将溶液过滤至少两次以去除杂质。
然后，制备标准溶液。
将内毒素标准品按照指定浓度配制成溶液。
接下来，准备试管。
将标准溶液和试样溶液分别装入两个试管中，并加入适量的无菌生理盐水作为空白对照。
然后，进行混合。
轻轻旋转试管混合样品，确保溶液均匀混合。
接着，培养细菌。
将特定的细菌株接种在培养基中，分别加入试管中的样品溶液，并在适当条件下进行培养。
培养结束后，观察结果。
通过观察培养基的变化，比较试管中的样品溶液和空白对照的差异，判断样品中是否存在细菌内毒素。
最后，记录结果。
根据观察结果，记录样品的检验结果，并进行数据分析。
细菌内毒素试验(鲎试验)要点及控制方法
细菌内毒素试验（鲎试验）要点及控制方法一般细菌毒素可分为两类，一类为外毒素(Exotoxin)；它是一种毒性蛋白质，是细菌在生长过程中分泌到菌体外的毒性物质。
产生外毒素的细菌主要是革兰氏阳性菌。
如白喉杆菌、破伤风杆菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌以及少数革兰氏阴性菌。
另一类为内毒素(Endotoxin)，是革兰氏阴性菌的细胞壁的产物。
细菌在生活状态时不释放出来，只有当细菌死亡自溶或粘附在其它细胞时，才表现其毒性，内毒素的主要化学成分是脂多糖中的类脂A 成分。
和热原的关系热原(pyrogen)系指能引起恒温动物体温异常升高的致热物质。
它包括细菌性热原、内源性高分子热原、内源性低分子热原及化学热原等。
热原是否就是内毒素？细菌内毒素是热原的一种，即细菌性热原。
细菌内毒素被认为是热原的本质，此事在学术上仍有争议，热原不仅是细菌内毒素。
但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒素就是控制热原。
热原反应：含有热原的注射剂注入人体可引起发热反应，使人体产生发冷、寒战、体温升高、出汗、恶心、呕吐等症状，有时体温可升至40℃，严重者甚至昏迷、虚脱，如不及时抢救，可危及生命。
来源和控制方法1、细菌内毒素的特性2、去除细菌内毒素的方法(1)吸附法此法是利用活性炭对热原的吸附作用达到去除作用的方法。
常用的吸附剂中，活性炭对热原的吸附作用最强，一般用量为总容量的0.1%-0.5% ，将溶液加热到70℃左右保温一定时间效果更好。
使用的活性炭应符合药典规定要求。
(2)蒸馏法此法是利用热原具有不挥发性而达到去除目的。
因此，凡适于蒸馏的药品均可用蒸馏法除去热原。
(3)热破坏法此法是利用热高温能破坏热原质达到去除目的。
因此，凡适用于高温处理的如热原检查试验中接触药液的容器，可用180℃干烤3小时，或250℃干烤30min以上。
(4)强酸强碱处理法此法利用强酸强碱能破坏热原而达到去除的目的。
(5)其他，也可以采用过滤等方法去除热原。
细菌内毒素检测试验注意事项与误差分析
如果用量不大，使用频率不高，建议大家选用 本公司提供的一次性耗材。无热原耗材是一种在 此行业中被鉴定为无内毒素和β-葡聚糖污染的产 品，其中包括, 无热原试管、无热原移液器吸头。 这些产品可以给您的工作带来很大方便,另外，当 实验出现误差时可首先排除器皿方面的因素,很快 分析判断出误差原因。
2） 器皿的正确处理
➢应用标准：干扰能力、稳定性 ➢国外标准：无菌
1 鲎试剂
➢灵 敏 度：在本检查法规定的条件下，使鲎试 剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为鲎试剂的 标示灵敏度，用EU/ml表示。 ——2010版《中 国药典》 ➢国外鲎试剂：灵敏度由FDA统一标定
1 鲎试剂
鲎试剂灵敏度复核的目的不仅是考察鲎试剂 的灵敏度是否准确，也是考查检验人员操作方 法是否正确及实验条件是否符合规定。
2） 细菌内毒素标准品用途
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取 精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度 和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家 标准品为基准标定其效价，用于试验中鲎试剂灵 敏度复核、干扰试验及各种阳性对照。
——2010年版《中国药典》
3） 细菌内毒素标准品效价误差
➢由于凝集反应是不可逆的，所以在反应过程 中及观察结果时应注意不要使试管受到振动， 以免使凝胶破碎产生假阴性结果。
➢进行干扰实验时，标准对照系列和含内毒素 的供试品溶液系列应同时进行，并使用同一支 细菌内毒素标准品。
➢在进行鲎试剂灵敏度复核、干扰实验和供试 品细菌内毒素检查时，各个实验中要求的对照 应同时进行，并在实验有效的情况才能进行计 算和判断。
➢蒸馏水
➢有效期
应该特别注意，该规程明确规定最后冲洗玻璃器 皿必须“用蒸馏水冲洗，禁用纯化水冲洗。”有 的客户使用反渗透制备的纯化水冲洗试验用玻璃 器皿，结果试验中所有的阳性对照都为阴性，复 核鲎试剂灵敏度时试验结果误差较大，这主要是 由于纯化水和蒸馏水的质量不同所造成的。
细菌内毒素检查法常见问题与探讨
此文章来源：/s/blog_4fcb513e01000bgj.html细菌内毒素检查法常见问题与探讨摘要: 目的总结归纳细菌内毒素检查法中的常见问题，方法收集整理工作中发现的问题，查阅国内外有关文献资料，对照分析应用情况并比较其差异。
结果与结论：从五个方面较为全面的总结了细菌内毒素检查法所涉及到的问题，认为在应用方面还需要进一步完善、规范。
关键词：细菌内毒素检查法；问题Discussion of common issues in the BactarilEndutoxin Test, BETZHOU Su-Wen.（Pharmacology Laboratory, Hubei Institute of Drug Examination,Wuhan 430064）ABSTRACT: OBJECTIVE to summarize and conclude the common problems in the bacterial endotoxins test. METHODS by collecting the practical problems in work and referring to the related articals and information, we compared and analyzed their differences. RESULTSand CONCLUSION the problems concerning the bacterial andotoxins test were comprehensively generalized in the review from five aspects and the conclusion showed that the application of the bacterial endotoxins test need to be further enhanced and standardized.Key word: Bactaril Endutoxin Test；problems细菌内毒素检查法(BactarilEndutoxinTest,BET )是近二十年来发展起来的用于检测药品及其中间品中内毒素污染的一种方法；作为家兔热原检查法的一种替代，已经十分成熟，美国药典迄今已为八百余种药品制定了该项检查法，中国药典自1990年版开始收载以来，每版药典细菌内毒素检查品种也逐步增多，2005年版已增加到204种，并且在增补本中将继续增加收载数量，该方法相对家兔热原检查法而言，有劳动强度低、快捷、经济、灵敏和易于标准化等优点，受到广大药品质检人员高度关注。
细菌内毒素检测方法
细菌内毒素检测方法细菌内毒素是一种由细菌产生的有毒物质，它可以对人体和动物产生严重的危害。
因此，及时准确地检测细菌内毒素，对于预防和控制疾病具有重要意义。
目前，有多种方法可以用来检测细菌内毒素，本文将介绍其中常用的几种方法。
首先，生物学法是一种常用的细菌内毒素检测方法。
这种方法利用动物（如小鼠、大鼠等）或细胞培养物来检测细菌内毒素的毒性。
通过观察动物或细胞的生理和病理变化，可以判断细菌内毒素的毒性和浓度。
生物学法的优点是对多种类型的细菌内毒素都能进行检测，但缺点是需要动物实验，操作复杂且耗时。
其次，生化法也是一种常用的细菌内毒素检测方法。
这种方法利用化学试剂对细菌内毒素进行特异性反应，生成可测定的产物。
常用的生化法包括凝集素试验、ELISA法等。
这些方法具有操作简便、结果快速的特点，但对不同类型的细菌内毒素的特异性有一定要求。
另外，分子生物学法也是一种常用的细菌内毒素检测方法。
这种方法利用PCR、基因芯片等技术，通过检测细菌内毒素的基因序列来进行检测。
分子生物学法具有高灵敏度、高特异性的特点，可以对不同类型的细菌内毒素进行准确检测，但需要专业的实验技术和设备支持。
最后，质谱法是一种新兴的细菌内毒素检测方法。
这种方法利用质谱仪对细菌内毒素进行分析，通过质谱图谱来确定细菌内毒素的种类和浓度。
质谱法具有高灵敏度、高分辨率的特点，可以对微量的细菌内毒素进行检测，但设备昂贵、操作复杂。
综上所述，细菌内毒素的检测方法多种多样，每种方法都有其特点和适用范围。
在实际应用中，可以根据具体情况选择合适的方法进行检测，以确保检测结果的准确性和可靠性。
希望本文所介绍的内容能够对细菌内毒素的检测有所帮助。
细菌内毒素检测方法介绍
EU/ml，
内 毒 素 标准溶液 制 备 注：箭头上方为吸取前一步标准溶液量，下方为吸取 BET 水量。 取 18 支反应用试管，各加入复溶后的鲎试剂 0.1ml，分别加入浓度为 2.0λ、1.0λ、0.5λ、0.25λ 的内毒素标准溶液各 0.1ml,每一浓度做 4 个平行管，另 2 支加入 BET 水作为阴性对照。 反应条件：37± 1℃保温 60± 2min。 平 行 管 号
2、器具
器具分类
器具名称
反应试管 玻璃试管（外径10³75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头 其他
酒精灯、脱脂棉球、镊子、剪刀、砂轮、 封口膜、记号笔
试剂 1、鲎试剂：具有国家颁发的批准文号 2、内毒素工作标准品 3、内毒素检查用水 4、三效热原灭火剂 5、75％乙醇 常用英文缩写 BET：细菌内毒素检查 BET水：细菌内毒素检查用水 MVD：供试品最大有效稀释倍数 NC：阴性对照 MVC：供试品最低有效浓度 PC：阳性对照 λ ：鲎试剂灵敏度 L：供试品细菌内毒素限值
实验环境：最好在洁净室。 实验人员：用适宜的洗涤剂洗手，用75％酒 精棉球消毒，戴工作帽和口罩。 实验过程： 1、内毒素工作标准品应严格按要求低温保存； 工作标准品开封后尽快使用且应一次性用完， 不再保存。 2、溶解后的标准品用封口膜封口后在漩涡振 荡器上混匀15min；进一步稀释时每稀释一步 均应在漩涡混合器上混匀30s。
灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进 行灵敏度复核。 试验举例：内毒素工作标准品为100EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹 瓶壁使粉末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75 ％酒精擦拭后启开，加1mlBET水溶解，封口膜封住， 置漩涡振荡器上混匀15min后进行稀释，步骤如下 (箭头下方为加入BET水量)：
浅析细菌内毒素检测方法及常见问题解读
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。
4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。
5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。
将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
❖ 与热源对比内毒素检查法优势
❖ 方便、快捷、经济； ❖ 重现性好、灵敏度高； ❖ 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
- / 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λc在0. 5λ～2.0λ范围内，符合规定。
❖ 方法学验证—供试品干扰预试验 目的：
确证产品对方法是否存在干扰（抑制或增强）， 得到供试品的最大不干扰浓度或最小不干扰稀释倍 数，为正式干扰实验提供依据。
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
❖ 主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
❖ 主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
EU/ml EU/ml
内毒素的检验方法_概述及解释说明
内毒素的检验方法概述及解释说明1. 引言1.1 概述内毒素是一种存在于细菌细胞壁或细菌体内的有毒物质，可以引起多种炎症反应和严重的生理功能障碍。
检验内毒素的方法对于保障食品安全、医药领域和环境监测等方面至关重要。
本文将概述内毒素的检验方法，并分析其优劣势及应用场景。
1.2 文章结构本文将从以下几个方面内容进行阐述：引言部分主要介绍内毒素的概述以及文章结构；接下来在“2. 内毒素的检验方法介绍”部分，将详细介绍常见的内毒素定量和定性检测方法并讨论其使用场景和限制；随后，在“3. 内毒素的生物学意义”部分，将探讨内毒素的来源、作用机制以及与疾病关联性研究进展；接着，在“4. 常见内毒素检验方法详解及优缺点比较”部分，将对生物试剂法（LAL 法）、免疫测定法（ELISA法）和质谱分析法（MS法）这三种常见内毒素检验方法进行详细解释，并比较它们的优缺点；最后，在“5. 结论与展望”部分，将总结本文的主要内容和发现，并展望内毒素检验方法的发展趋势和应用前景。
1.3 目的本文旨在全面介绍内毒素检验方法的原理、应用场景及其在食品安全、医药领域和环境监测中的重要性。
通过对常见内毒素检验方法进行详细解析和比较，希望能够为读者提供一个清晰而全面的了解，推动相关领域内毒素检测方法的研究与应用。
2. 内毒素的检验方法介绍：内毒素的检验方法是为了确定样品中是否存在内毒素，并且可以量化其含量或者进行定性分析。
常用的内毒素检验方法主要包括定量检测方法和定性检测方法。
下面将详细介绍这两种方法以及它们的使用场景和限制。
2.1 定量检测方法：定量检测方法旨在准确地测定样品中内毒素的含量。
其中，最常用且广泛应用的方法是生物试剂法（LAL法）和质谱分析法（MS法）。
生物试剂法（LAL法）是一种基于海洋生物滤过膜锥虫（Limulus polyphemus）体液反应原理的敏感、特异性、快速、可重复测定内毒素含量的显色反应试剂。
该试剂能够与内毒素结合形成凝胶或产生溶血现象，进而通过光密度变化或溶血程度来间接推算出样品中内毒素的含量。
(2021年整理)细菌内毒素检查法与实验分析
细菌内毒素检查法与实验分析编辑整理：尊敬的读者朋友们：这里是精品文档编辑中心，本文档内容是由我和我的同事精心编辑整理后发布的，发布之前我们对文中内容进行仔细校对，但是难免会有疏漏的地方，但是任然希望（细菌内毒素检查法与实验分析）的内容能够给您的工作和学习带来便利。
同时也真诚的希望收到您的建议和反馈，这将是我们进步的源泉，前进的动力。
本文可编辑可修改，如果觉得对您有帮助请收藏以便随时查阅，最后祝您生活愉快业绩进步，以下为细菌内毒素检查法与实验分析的全部内容。
学习交流题目：细菌内毒素检查法与实验分析莫水晶（高级工程师）一、热原与细菌内毒素的研究进展（一）热原与热原反应一百多年前，在西方医药学的发展史上，一个重要的发展就是注射给药(特别是静脉注射）方式的创立，它在人类与疾病作斗争的过程中起了重大作用。
但是无论过去还是现在,在临床上使用注射剂，常易发生不良反应(冷感、寒战、发热、头痛、恶心、呕吐、肤色灰白、昏迷、休克)而加重病情,严重时导致病人重要器官功能衰竭或死亡。
1875年(Brrdon-Sanderson)从腐肉中分离出不带活菌的物质，能引起上述一系列症状，并称之为热原（Pyrogen）。
将上述一系列不良反应定为热原反应。
为了克服热原反应的发生,保障输、注药品的给药安全，对热原进行了广泛的研究。
1923年Seibert肯定热原来源于细菌，它能从滤器滤过,对热稳定，注射剂虽经严格灭菌，仍不能排除热原反应的发生，而提出采用家兔检测热原的方法.1、热原检查法的建立及优、缺点1942年美国首先将家兔热原检查方法收入药典，作为检查药品注射液中发热物质的法定方法。
因此，相继在世界各国药典均规定了这一检查方法.中国药典自1953年版开始收载了热原检查法（各国药典方法基本相同）。
近半个世纪以来，这项保障药品安全的检查，发挥了重要作用。
家兔热原检查法的优点：它能反映出“热原”引起哺乳动物复杂的升温反应过程，除此之外很难列出这一检查方法的更多优点。
细菌内毒素检查相关问题
细菌内毒素检查相关问题 This model paper was revised by the Standardization Office on December 10, 2020细菌内毒素检查相关问题细菌内毒素检查方法建立中应注意的几个问题审评四部王彦厚摘要：本文对细菌内毒素检查方法的建立、限值的确定、方法学验证及常见问题进行了介绍。
关键词：细菌内毒素检查、方法、验证细菌内毒素检查法作为控制药品质量的一种有效方法，已经广泛的被世界各国药典收载。
经过30多年的不断改进，无论是凝胶法还是光度法均比较成熟和完善。
但是，在为新化合物或新药建立细菌内毒素检查方法时，常常会遇到各种各样的困难，尤其是尚处于新药研发早期阶段的药物，由于药物制剂、赋形剂等还不稳定，经常会发生变化，这样就给方法的建立带来不同程度的影响。
在建立细菌内毒素检查法之前，应尽可能多的收集有关该药品的基本信息，例如：有关样品的溶解性信息，推荐的稀释液，在水中的溶解度，以及最适溶剂；样品的pH范围；分子量大小；产品规格、体积或重量；拟用于临床的用法和用量等等。
以便选择合适的样品处理方法和内毒素检查方法，对于早期研发阶段的药物，应选择合适的赋形剂，以有利于细菌内毒素检查中对样品的稀释处理。
此外，在确定内毒素限值时还应尽可能采用最大人拟用剂量，为临床安全性和有效性研究中增加剂量留出空间。
一、细菌内毒素检查方法建立的主要步骤对某一新化合物建立细菌内毒素检查方法时，首先应根据人体最大日给药剂量和给药途径，计算和确定样品的内毒素限值，选择合适的鲎试剂，根据临床规格，计算最大有效稀释倍数，稀释产品，并在低于最大稀释倍数的浓度下进行检查。
可以采用凝胶法，也可以采用终点法或动态法。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法为准。
1、细菌内毒素限值的确定一个药品在投放市场前，它是否满足内毒素限值的要求样品的内毒素含量具体是多少这些问题不但关注用药安全，还应该最大限度的提供有关内毒素含量的准确信息，为药品生产过程中质量控制提供警戒信息。
细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识
细菌内毒素检查方法以及限度要求浅识摘要：由于方法本身的优越性，采用细菌内毒素检查法取代热原法的国内申报资料逐年增加，但部分资料仍存在一定缺陷，本文对该法及其影响因素、质控要点等进行简要评述，以期申请人注意规范对该部分的研究工作。
关键词：细菌内毒素方法学热原检查法或细菌内毒素检查法是注射制剂的关键质控指标之一。
一直以来，热原检查在药物研发中广泛使用，方法比较成熟，目前药典和其他国家标准中有很多品种采用热原检查，但热原检查易受试验动物个体差异，方法灵敏度、药物本身性质（某些药物如乳糖酸红霉素引起降温，青霉素往往也有类似作用，两性霉素B 可引起升温）等影响，使用受到一定限制；细菌内毒素法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，检测供试品中细菌内毒素的限量的方法，由于方法灵敏度高、准确、快速和经济等优点，已在各国药典中得到推广。
当然也仍有部分药物因为药物干扰等其他因素无法使用细菌内毒素检查法。
上述两种方法目前都是可行的内毒素物质检查方法，在实际应用过程中可以结合药物本身性质进行选择。
但在审评中发现，由于细菌内毒素检查法国内研究时间不长，导致部分注册申请人在药物研发时对细菌内毒素检查法的认识上存在一定偏差，本文希望通过对该方法的方法学和限值计算的相关介绍，使研发者增进对细菌内毒素检查法的认识，提高药物研发水平。
关于细菌内毒素的研究方法，中国药典2000年版纳入的细菌内毒素检查法为凝胶法（附录XI E），在细菌内毒素检查应用指导原则中（附录XIX F）提出了浊度法和显色基质法。
即将执行的中国药典2005年版将两部分进行了合并，并进行了修订，纳入了凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
浊度法是测定凝胶形成过程中的浊度变化，可进一步细分为终点浊度法和动态浊度法，在做细菌内毒素定量测定时，检测波长一般为360nm。
显色基质法是测定特殊底物释放出来的生色团，也可分为终点显色法和动态显色法，定量测定的检测波长一般为405nm或545nm。
中国药典细菌内毒素检测方法
中国药典细菌内毒素检测方法中国药典是我国制定的药品标准，用于规范药品生产和检验。
其中细菌内毒素检测方法是药品检验的重要部分。
细菌内毒素是由细菌合成并分泌的一种生物活性毒素，能够引起多种疾病和副作用。
在药品生产中，内毒素污染是常见的问题，如不及时检测和去除，会对药品质量和使用安全产生不良影响。
中国药典规定了细菌内毒素检测的方法，包括传统的生物学检测和生物化学检测。
生物学检测方法以大肠杆菌为指示菌株，采用荷尔蒙室试验（Limulus amoebocyte lysate test，LAL）或兔脉球凝集试验（Rabbit Pyrogen Test，RPT）进行内毒素检测。
1. 荷尔蒙室试验荷尔蒙室试验基于荷尔蒙蟹（Limulus polyphemus）的血细胞溶解液（LAL）对内毒素的敏感性。
此方法针对内毒素结构中特异的内酰胺基团，其与LAL结合后可引起凝集反应，从而可以测定荷尔蒙蟹血中补体激活产生的凝胶体数量。
荷尔蒙室试验灵敏度高、重复性好、操作简便，被广泛应用于药品、医疗器械等领域中的内毒素检测。
2. 兔脉球凝集试验兔脉球凝集试验使用兔血清进行内毒素检测，通过检测内毒素引起的兔脉球凝集反应来定量测定药物样品中内毒素的含量。
该方法繁琐，操作复杂，需要大量的动物，且灵敏度相对较低，已被荷尔蒙室试验所代替。
生物化学检测方法主要采用比色法、酶联免疫吸附法（Enzyme linked immunosorbent assay，ELISA）等。
比色法根据化学试剂对内毒素的反应特性，利用其变化特征进行检测。
ELISA方法则是基于免疫学原理进行的定量分析方法，可快速、准确地检测内毒素的含量。
2008 无菌_微生物限度及细菌内毒素检查方法学验证中常见问题及分析_国明
中国药品标准 2008年第 9卷第 1 Nhomakorabea 47以减少膜的吸附, 对于抑菌性较强的注射用无菌粉 末或固体原料, 一定要充分溶解、混合均匀。 114 加菌时机不一致
验证试验主要考虑滤器中残留抗菌物质对阳性 菌生长的影响, 应与对照滤器比较而作出判断, 所以 验证试验中加菌时机要与对照一致 [ 2] 。
115 薄膜过滤法滤膜材质选择不正确, 直接影 响试验结果
20 05年 版药 典执 行以 来药 品 生 产企 业 、科 研 单 位等 在药品质量标准建立及检验工作中困难和问题较多 的项目。我们在药品注册品种的审核检验中, 发现 有的申报单位对方法学验证的意义理解不够, 验证 试验的科学性、完整性及可操作性均存在着很多问 题。为尽快提高方法学验证水平, 更好地保证用药 的安全性, 现将方法学验证工作中常遇到的问题进 行分析、讨论。 1 无菌检查方法学验证问题及分析 111 验证菌株选择不正确 11111 敏感菌株与阳性对照菌不一致, 降低了阳性 对照菌的意义。有些药品选择了敏感菌株进行方法 学验证试验, 但是无菌检查时阳性对照菌不是验证 试验选定的敏感菌株。实际工作中抑制枯草芽孢杆 菌的样品很多, 可用此作为敏感菌株, 但药典规定无 菌检查时以金黄色葡萄球菌作为阳性对照菌, 使金 黄色葡萄球菌失去了阳性对照菌的意义。应在此类 无菌检查时也增加敏感菌株作为阳性对照菌。 11112 2005年版药典无菌检查中规定 / 抗革兰阴 性菌为主的供 试品以大肠埃希菌为对照菌 0, 但方 法学验证规定用菌株没有大肠埃希菌, 缺少了验证 此类药物抗菌作用的代表菌株。建议对抗菌作用中 明确具有抗革兰阴性菌的药品进行无菌检查方法学 验证时, 应增加大肠埃希菌作为验证菌株。 112 验证时取样量不符合要求 11211 无菌检验量与验证试验的取样量不同, 与中 国药典 2005年版方法学验证要求不符。进行供试 品检查时, 所采用的检验方法和检验条件应与验证 的方法相同, 应按照规定的检验数量和检验量取样。 11212 有的生产单位无菌检查方法学验证仅按抽 验产品检验数量进行验证, 药典规定应按照批出厂 产品最少检验数量进行试验 [ 1] 。 113 方法选择错误或不恰当, 不符合 2005 年版中 国药典要求 11311 有的申报单位无菌检查时无论什么药品都 用直接接种法。 2005年版中国药典规定, 只要供试 品性状允许, 应采用薄膜过滤法 [ 1] 。 11312 有些申报单位对非抑菌性供试品也用大量 的冲洗液冲洗, 如每次 100 mL, 10次 /膜, 既增加了 对膜的损伤和对微生物生物特性的破坏机会, 也增 加了检验繁琐性和检验人员的工作量。所以薄膜过 滤时尽 可能 减少 冲 洗量, 冲 洗 不一 定 为每 次 100 mL, 可少量多次, 并注意充分振摇。对于抑菌性较 强的供试品, 可以先用适宜的稀释液稀释后再过滤,
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分细菌内毒素检验方法
中国药典第二部分中包含了多种细菌内毒素检验方法，这些方法用于检测药物中是否含有细菌内毒素，以确保药品的质量和安全性。
以下是一些常见的细菌内毒素检验方法：
1. 破碎毒素检验法：将含有可能含有细菌内毒素的样品与敏感动物接触，观察是否有毒性反应。
这种方法已经有一定的局限性，并且不适合大规模的检验。
2. LAL试验法：利用与细菌内毒素特异性结合的激活酶酵素（LAL）来检测细菌内毒素。
这种方法基于生物反应原理，可以快速、准确地检测出细菌内毒素的存在。
LAL试验法是目
前最常用的细菌内毒素检验方法之一。
3. 细胞培养法：通过细胞培养技术，将待测样品与细胞共同培养，观察是否存在毒性反应。
这种方法可以模拟真实的细胞环境，对多种细菌内毒素具有较高的敏感性。
4. 放射免疫试验法：利用放射性标记的抗体与细菌内毒素结合，通过放射免疫分析技术来检测细菌内毒素。
这种方法可以进行定量测定，但需要使用放射性物质，操作较为复杂。
5. 特异性试验法：根据细菌内毒素的特异性，设计特定的试验方法进行检测。
例如，利用特定酶致黑色反应法检测棒状杆菌内毒素等。
以上是中国药典第二部分中常见的细菌内毒素检验方法，每种
方法都有其优缺点和适用范围，制药企业可以根据需要选择合适的方法来进行细菌内毒素检测。
内毒素检测方法
内毒素检测方法
内毒素是一种存在于细菌细胞壁中的毒素，当细菌死亡或者被杀死时，内毒素
会释放出来，对人体健康造成危害。
因此，检测内毒素的方法显得尤为重要。
目前，常见的内毒素检测方法包括生物学检测法、生化检测法和免疫学检测法。
生物学检测法是通过动物实验来检测内毒素的方法。
常用的动物包括小鼠、大
鼠和兔子等。
这种方法的优点是对内毒素的检测灵敏度高，但缺点也很明显，动物实验造成了动物的牺牲，而且实验周期长，费时费力。
生化检测法是通过检测内毒素对细胞或者生物分子的影响来进行内毒素检测的
方法。
这种方法的优点是可以定量检测内毒素的含量，而且不需要动物实验，但缺点是操作复杂，需要较长的实验周期。
免疫学检测法是通过检测内毒素与特定抗体的结合来进行内毒素检测的方法。
这种方法的优点是操作简便，快速高效，而且可以进行定量检测，但缺点是需要特定的抗体，成本较高。
除了以上几种常见的内毒素检测方法外，近年来，一些新型的检测方法也逐渐
出现。
比如基于光学原理的检测方法，利用内毒素与特定物质的光学特性进行检测，操作简便，快速高效；基于纳米材料的检测方法，利用纳米材料对内毒素的高灵敏度进行检测，具有极高的灵敏度和快速的检测速度。
综上所述，内毒素的检测方法有多种多样，每种方法都有其优缺点。
在选择合
适的内毒素检测方法时，需要根据实际情况综合考虑各种因素，选择最适合自己实验需求的方法。
同时，随着科学技术的不断发展，相信会有更多更高效的内毒素检测方法出现，为我们的科研工作和生产实践提供更好的技术支持。
内毒素检测方法
内毒素检测方法
首先，常见的内毒素检测方法之一是细胞毒性检测法。
该方法利用细胞培养技术，将待测样品与细胞共同培养，通过观察细胞的形态、数量、活性等指标的变化，来判断样品中是否存在内毒素。
这种方法的优点是操作简便、结果直观，但也存在着对细胞培养技术要求较高、操作过程较为繁琐等缺点。
其次，生物学检测法也是一种常用的内毒素检测方法。
这种方法利用动物、植物或微生物等生物体对内毒素的敏感性，通过观察生物体的生理指标变化来判断样品中是否存在内毒素。
生物学检测法的优点是对多种类型的内毒素具有较高的检测敏感性，但也存在着操作周期长、操作过程复杂等缺点。
另外，化学检测法也是内毒素检测的重要手段之一。
这种方法通过化学分析技术，利用特定的试剂与内毒素发生反应，从而检测样品中内毒素的含量。
化学检测法的优点是操作简便、结果准确，但也存在着对试剂纯度要求高、对操作人员技术要求高等缺点。
最后，分子生物学检测法也是内毒素检测的重要方法之一。
这种方法利用分子生物学技术，如聚合酶链式反应（PCR）、酶联免疫
吸附测定法（ELISA）等，对待测样品中的内毒素进行特异性检测。
分子生物学检测法的优点是检测灵敏度高、特异性强，但也存在着对仪器设备要求高、操作技术要求高等缺点。
综上所述，内毒素检测方法有多种多样，每种方法都有其独特的优点和局限性。
在实际应用中，我们可以根据具体的实验要求和条件，选择合适的检测方法进行内毒素的检测工作。
希望本文介绍的内容能够为相关领域的研究人员和实验人员提供一些参考，促进内毒素检测技术的发展和应用。
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左侧管旋转180°凝胶不能保持完整为阴性，记为“－”；右侧管旋转 180°凝胶不变形为阳性，记为“＋”。
举例： 设待复核的鲎试剂标示灵敏度λ为0.125EU/ml:
平行 管数
内毒素标准溶液浓度（EU/ml）
1 2 3 4
0.25 + + + +
0.125 0.06 + + + + + -
0.03 -
内毒素可被强酸、强碱和氧化剂破坏。
故：玻璃器皿用铬酸洗液浸泡
主要特性（实验器材处理方法）
3.水溶性与不挥发性
热原能溶于水，本身不具挥发性，但能随水蒸 气雾滴夹带入蒸馏水中，造成污染。
故：不可用湿热灭菌法处理实验器具
主要特性（去除内毒素方法）
4.滤过性
原体积很小，约在1～5 nm之间，故能通过除 菌滤器而进入滤液中，但不能通过石棉滤板，也不 能通过半透膜。
方法学验证—供试品干扰预试验
（1）原则上一般根据药品使用说明书或国家药典委
员会编制的《临床用药须知》来确定最大剂量。 如 儿童用药剂量大于成人用药剂量，则以儿童剂量为 准。 （2）为保证安全用药，对于抗感染、抗肿瘤、治疗 心血管疾病等重症用的药品、需联合用药的药品药 品，可根据计算值适当调整，严格至计算限值的1/2 或1/3。
近年来已经普遍采用细菌内毒素检查法，逐渐替代了热源 法
在药检中的应用
细菌内毒素检查作为控制药品质量的一种方法，
已经广泛的被世界各国药典收载。
成品检查——药品安全性检查之一 半成品（生产过程）检查——事前质控手段，避 免造成药品成批报废
二、细菌内毒素检测方法
《中国药典》批准使用方法： 测定 方法
凝胶法
光度测定法
浊度法 显色基质法
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。但当测 定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶法结果为准。 本节将着重介绍凝胶法的操作与有关原理。
鲎试剂与内毒素反应机理
内毒素 C因子 活化的C因子
B因子
凝固酶原
活化的B因子
凝固酶 凝固蛋白原 鲎凝血系统－酶联反应 凝胶
供试品溶液的最大稀释倍数的计算 MVD＝CL/λ L:供试品的内毒素限值；
C：供试品溶液的浓度；
当L以 EU/ml表示时，C为1ml/ml;当L以EU/mg或 EU/u表示时，C的单位为mg/ml或u/ml(注意：当L以 EU/ml表示时，C的值不是样品的浓度，就是1)。
方法学验证—供试品干扰预试验
(1).供试品稀释法 MVD=CL /λ 鲎试剂灵敏度(λ )越高(数值越小)，供试品的稀 释倍数越大，干扰越小。
(2).物理方法 如加热法(血液制品)、冷析法(甘露醇 ) (3).化学方法 如调节PH值(奎诺酮类)、调节金属离子(血液保 养液、FDP) (4).生物方法 如抗增液的使用，阻断G因子反应，防止假阳性； (5).其它方法 如过滤法、溶剂抽提等
6、鲎试剂浓度达不到要求 开启内毒素标准品和鲎试剂时，要将粘附在安 瓿壁上的粉末尽可能地弹落下去。用砂轮划过 安瓿后，要用酒精棉（最好能用沾异丙醇的无 纺布，以避免产生假阳性结果）擦拭，防止开 启时玻璃屑落入安瓿内。开启内毒素标准品时， 要在安瓿曲颈上部，并尽可能保留较长的安瓿 颈，准确加入1.0ml鲎试验用水复溶。
NC
/ /
X 反应终 点浓度C (lgC)
0.06 -1.22 0.125 -0.903 0.125 -0.903 0.125 -0.903
λc＝lg-1(∑X/4) ＝lg-1｛［（-1.22）＋（-0.903）＋（ -1.22 ）＋（ -1.22 ）］/4｝ ＝0.104（EU/ml）
λ c在0. 5λ ～2.0λ 范围内，符合规定。
2λ 2λ 2λ 2λ
λ λ λ λ
0.5λ 0.5λ 0.5λ 0.5λ
0.25λ 0.25λ 0.25λ 0.25λ
1 2λ
2 λ
3 0.5λ
4 0.25λ
BET水
反应及结果判断：加样结束后用封口膜封口，轻振动 混匀，置37 ℃水浴中保温60±2min，将每管拿出缓 缓倒转180°，凝胶不变形为“＋”，凝胶不能保持 完整为“－”。 当2.0λ四支管都为阳性，0.25λ四支管都为阴性时， 试验成立，按下面底公式计算复核的灵敏度λc ： λ c＝lg-1(∑X/4) （X:反应终点浓度的对数值。） 当0. 5λ≤λ c ≤2.0λ时，鲎试剂灵敏度复核合格，检测 时仍以标示灵敏度λ为准。
内毒素限值(L)的确定 药典附录有相应计算公式，即当今世界各国普遍采 用的细菌内毒素计算公式，即：L=K/M，式中K为 按规定给药途径，人每公斤体重每小时可以接受的 不产生任何不良反应的细菌内毒素剂量（亦称致热 阈），它基本上是一固定值，药典上对每一给药途 径的K值都有具体的规定。M为按规定的给药途径， 人每公斤体重每小时给药的最大剂量。这一个值的 确定实际上才是计算限值的关键。
故：灭菌注射用水≠细菌内毒素检查用水
光度法：
内毒素含量应小于0.005EU/ml；
细菌内毒素检测之凝胶法
实验程序
1、试验准备：试剂、仪器及用具 2、选择鲎试剂灵敏度，计算样品稀释度 3、鲎试剂灵敏度复核 4、供试品干扰试验（新药或新方法） 5、供试品细菌内毒素凝胶法检测
实验材料及用具 1、仪器 名称
3、实验条件达不到要求 实验室要求洁净，无尘埃空气流通，若是空调室， 应备有一台超净工作台。 4、温度不符合要求 实验室温度为25±2℃较好，恒温水浴箱温度为 37±1℃为宜。 5、忽视样品本身干扰
供试品若经干扰试验证实存在干扰因素，可采 用适宜的方法来消除干扰。消除干扰的一个重要 原则是不能影响供试品中的内毒素生物活性。
浅析细菌内毒素检测方法及常见 问题
内
细菌内毒素简介
容
细菌内毒素检测方法 常见问题及解决方案
一、细 菌 内 毒 素 简 介
主要内容
—— 来源 —— 特性
—— 与热源的关系
—— 在药检中应用
主要来源
主要来自于革兰氏阴性杆菌，当细菌死亡或自 溶后便会释放出内毒素，其化学成分主要是脂多糖， 这是一种大分子物质，分子量约为106，其粒径约 在1~ 5纳米 。
《中国药典》热原检查方法是采用家兔升温法进 行检查。 将一定剂量的供试品，静脉注入家兔体内，在 规定时间内，观察家兔体温升高的情况，以判定供 试品中所含热原的限度是否符合规定。
热原检查法
与热源对比内毒素检查法优势
方便、快捷、经济； 重现性好、灵敏度高； 避免抗原的产生，克服生物测定的误差；
名词解释1—鲎及鲎试剂
鲎：一种古老的栖身于沿海的海洋生物，节肢动物 门，在我国主要分布于浙江、福建及两广的沿海一 带。 鲎试剂：利用鲎血液中的变性细胞，经裂解液和机 械方式促使细胞破裂而提取到的一种细胞溶解物， 能与极微量的细菌内毒素形成特异凝胶反应，反应 的速度和凝胶的坚固程度与内毒素浓度有关，是体 外检测内毒素的敏感试剂。
灵敏度复核试验：每批鲎试剂用于检测前都必须进行灵敏度 复核。目的是为了对试剂、检测者的操作、环境条件、水平 条件进行验证。以证实操作正常无误，准确可靠和结果可信。 试验举例：内毒素工作标准品为90EU/支； 待测鲎试剂灵敏度λ ＝0.25EU/ml。 1、制备内毒素标准溶液：取工作标准品一支，轻弹瓶壁使粉 末落入瓶底，用砂轮在瓶颈出划痕，用75％酒精擦拭后启开， 加1mlBET水溶解，封口膜封住，置漩涡振荡器上混匀15min 后进行稀释，步骤如下(箭头下方为加入BET水量)：
5.吸附性
能被活性炭吸附剂吸附。内毒素在溶液中带有 一定的电荷，因而可被某些离子交换介质吸附。
热原=内毒素
？
热原指微生物产生的某些多糖蛋白复合物 等使人体发热的物质，不仅仅是细菌内毒素。 但在药检的范畴，细菌内毒素是主要的热 原物质，可以说无内毒素就无热原，控制内毒 素就是控制热原。
热原检查方法简介
—其他适宜的方法
如过滤、中和、透析或加热处理等排除干扰。
供试品细菌内毒素凝胶法检测
检测方法： 编号 A B C 内毒素浓度/配制内毒素的 平行管数 结果 溶液 判定 无/供试品溶液 2 阴性 2λ /供试品溶液 2λ /检查用水 2 2
阳性
阳性 阴性
D
无/检查用水
2
注：A 无干扰浓度供试品溶液；B 供试品阳性对照；C 阳性对照；D 阴性对照。
C
2λ /检查用水
检查用水
D
无/检查用水
—
方法学验证—供试品干扰试验
结果判定：
如果有供试品和无供试品测得的鲎试剂灵敏度（λc） 均在0.5λ-2.0λ范围内时，则认为供试品在该浓度下不干 扰试验，否则需要对供试品做适当处理。
干扰的排除：
—对供试品进行更大倍数的稀释； —选择灵敏度更高的鲎试剂；
天平 电热干燥箱 恒温水浴箱 水银或酒精温度计 漩涡混合器 计时器
要求 感量0.1mg以下 ～300℃ 37±1 ℃ ～100 ℃±1 ℃ / 60min±1min
2、器具
器具分类
器具名称
反应试管 玻璃试管（外径10×75mm）、试管架、 小三角瓶或磨口瓶
移液器具 刻度吸管及洗耳球或移液器及无热原吸头 其他
名词解释2—国家标准品及工作标准品
国家标准品： （单位：EU/ml）
自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、 仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的 效价；
工作标准品：
经国家标准品稀释用于试验中鲎试剂灵敏度符 复核、干扰试验及各种阳性对照；
名词解释3—细菌内毒素检查用水
凝胶法：
内毒素含量小于0.015EU/ml的灭菌注射用水；