培养基灭菌的目的和要求
合集下载
相关主题
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
培养基灭菌的目的和要求
• 目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发 酵过程创造无菌的条件。
• 要求：达到要求的无菌程度(杂菌污染降低到被 处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度,10-3个/罐）； 尽量减少营养成分的破坏。
在灭菌过程中，培养基组分的破坏是由 两个基本类型的反应引起的：
– 培养基中不同营养成分间的相互作用；
d ln K dT
E RT 2
由该式可得出结论：
反应的ΔE越高，lnK对T的变化率 越大，即T的变化对K的影响越大
• 试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某
些有效成分热破坏反应的ΔE较低。
• 将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速
度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温 度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时 间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少
孢子热死灭和营养成分破坏活化能
物质 维生素B12 维生素B1盐酸盐 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 肉毒梭菌孢子 枯草杆菌孢子
ΔE（J/mol） 96232
92048 283257 343088 317984
• ΔEBS=67000× 4.184（J/mol） • ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol） • 将灭菌温度从105˚C提高到127 ˚C
K Nt
K
Nt
为理论灭菌时间的对数残留规律公式。
问题：能不能做到绝对无菌？
温度对K的影响 • 微生物的热死灭动力学接近一级反应
动力学，它的比热死灭速率常数K与 灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方
程表征 K A eE/ RT
A-频率因子，min-1 ΔE-活化能，J/mol R-通用气体常数，J/（mol.k）
– 不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。
– 对（4）两边取对数，得
ln
K
E RT
ln
A
k/min
4.0 3.0 2.0
1.0 0.8 0.6 0.4
0.2
0.1 2.54
2.56
斜率= -ΔE/R 2.58 2.60 2.62 2.64
微生物死亡速度常数K与温度的关系
– K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有 关，对（5）两边对T的导数，得
• 1、培养基成分 • 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越
高，微生物的热死亡速率越慢 • 在热死温度下，脂肪、糖分和蛋白质等
有机物质在微生物细胞外面形成一层薄 膜，它能有效保护微生物细胞抵抗不良 环境，因此需较高的灭菌温度。 • 另一些物质，如高浓度的盐类，色素等 可削弱其耐热性。
各种微生物对湿热的相对热阻
微生物
营养细胞和酵母 细菌芽孢 霉菌孢子 病毒和噬菌体
相对热阻
1.0 3×106 2~10 1~5
某些微生物的相对热阻
灭菌方式 大肠杆菌 霉菌孢子 细菌芽孢 噬菌体或病毒
干热灭菌 1 湿热灭菌 1
苯酚
1
甲醛
1
紫外线 1
2-10 2-10 1-2 2-10 5-100
1000 3×105 1×109 250 2-5
– 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的 分解。
灭菌的方法
• 化学法
– 化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等
• 物理法
– 干热灭菌法 – 湿热灭菌法（生物工程工业常用方法） – 射线灭菌法
1. 湿热灭菌原理和影响灭菌的因素
湿热灭菌的原理：主要是因高温使微生物体内的 一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性， 从而导致微生物无法生存而死亡。
灭菌温度（˚C）
100 110 120 130 140 150
达到灭菌程度的时间 （min）
843
维生素B1的损失（%） 99.99
75
89
7.6
27
0.Байду номын сангаас51
10
0.107
3
0.015
1
1.2 影响灭菌的因素
培养基成分 培养基的物理状态 培养基中氢离子浓度 培养基中微生物数量 微生物细胞含水量 微生物细胞菌龄 微生物的耐热性 空气排出情况 搅拌 泡沫
• 致死温度与致死时间：杀死微生物的极限温度 称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生 物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上， 温度愈高，致死时间愈短。
微生物的热阻和相对热阻：前者是指微生物 在某一特定条件（主要是温度和加热方式） 下的致死时间。后者是指某一微生物在某 条件下的致死时间与另一微生物在相同条 件下的致死时间的比值。
1 1-5 30 2 5-10
湿热灭菌的优点 • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽有很大的潜热； • 操作方便，易管理。
1.1 湿热灭菌的理论基础
• 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以 接受的总数N（10-3），需要多高的温 度、多长的时间为合理。
细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有
所不同。它表现为非对数的死亡动力学。 但当温度超过120˚C时，热阻极强的嗜热 脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接 近对数死亡动力学即符合一级反应规律。
• 取边界条件t0=0，N=N0，对上式积分得
Nt ekt N0
或
t 1 ln N0 2.303 lg N0
• 灭菌温度和时间的确定取决于：
– 杂菌孢子的热灭死动力学 – 反应器的形式和操作方式 – 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
微生物的热死灭动力学方程：对数残留定律
• 微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学 反应的一级反应动力学，即：
dN dt
kN
N-任一时刻的活细菌浓度，个/L； t-时间，min； K-比热死速率常数，min-1，越小越耐热
54℃
10-1
残留的活菌含量
10-2
56℃
10-3
10-4 10-5
0
58℃ 60℃
24
6 8 10 t(min)
图2-1 大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线
– 活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件
相同时， ΔE越高，K越低，热死速率越慢。 ∆E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量， 值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越 敏感，在灭菌中∆E/R是很重要的常数 。
• KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min -1 ） • KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min -1 ）
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和 维生素B1的lnK-1/T图
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 绝对温度倒数，1/T（·K）×10-3
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度 对维生素B1破坏的影响
• 目的：杀灭培养基中的微生物，为后续发 酵过程创造无菌的条件。
• 要求：达到要求的无菌程度(杂菌污染降低到被 处理的每1000罐中只残留1个活菌的程度,10-3个/罐）； 尽量减少营养成分的破坏。
在灭菌过程中，培养基组分的破坏是由 两个基本类型的反应引起的：
– 培养基中不同营养成分间的相互作用；
d ln K dT
E RT 2
由该式可得出结论：
反应的ΔE越高，lnK对T的变化率 越大，即T的变化对K的影响越大
• 试验表明，细菌孢子热死灭反应的ΔE很高，而某
些有效成分热破坏反应的ΔE较低。
• 将温度提高到一定程度，会加速细菌孢子的死灭速
度，缩短灭菌时间，由于有效成分的ΔE很低，温 度的提高只能稍微增大其破坏速度，但由于灭菌时 间的显著缩短，有效成分的破坏反而减少
孢子热死灭和营养成分破坏活化能
物质 维生素B12 维生素B1盐酸盐 嗜热脂肪芽孢杆菌孢子 肉毒梭菌孢子 枯草杆菌孢子
ΔE（J/mol） 96232
92048 283257 343088 317984
• ΔEBS=67000× 4.184（J/mol） • ΔEVB=22000× 4.184 （J/mol） • 将灭菌温度从105˚C提高到127 ˚C
K Nt
K
Nt
为理论灭菌时间的对数残留规律公式。
问题：能不能做到绝对无菌？
温度对K的影响 • 微生物的热死灭动力学接近一级反应
动力学，它的比热死灭速率常数K与 灭菌温度T的关系可用阿累尼乌斯方
程表征 K A eE/ RT
A-频率因子，min-1 ΔE-活化能，J/mol R-通用气体常数，J/（mol.k）
– 不同菌的孢子的热死灭反应ΔE可能各不相同。
– 对（4）两边取对数，得
ln
K
E RT
ln
A
k/min
4.0 3.0 2.0
1.0 0.8 0.6 0.4
0.2
0.1 2.54
2.56
斜率= -ΔE/R 2.58 2.60 2.62 2.64
微生物死亡速度常数K与温度的关系
– K是ΔE和T的函数，K的对T的变化率与有 关，对（5）两边对T的导数，得
• 1、培养基成分 • 培养基中脂肪、糖分和蛋白质的含量越
高，微生物的热死亡速率越慢 • 在热死温度下，脂肪、糖分和蛋白质等
有机物质在微生物细胞外面形成一层薄 膜，它能有效保护微生物细胞抵抗不良 环境，因此需较高的灭菌温度。 • 另一些物质，如高浓度的盐类，色素等 可削弱其耐热性。
各种微生物对湿热的相对热阻
微生物
营养细胞和酵母 细菌芽孢 霉菌孢子 病毒和噬菌体
相对热阻
1.0 3×106 2~10 1~5
某些微生物的相对热阻
灭菌方式 大肠杆菌 霉菌孢子 细菌芽孢 噬菌体或病毒
干热灭菌 1 湿热灭菌 1
苯酚
1
甲醛
1
紫外线 1
2-10 2-10 1-2 2-10 5-100
1000 3×105 1×109 250 2-5
– 对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的 分解。
灭菌的方法
• 化学法
– 化学药品灭菌法：甲醛、苯酚等
• 物理法
– 干热灭菌法 – 湿热灭菌法（生物工程工业常用方法） – 射线灭菌法
1. 湿热灭菌原理和影响灭菌的因素
湿热灭菌的原理：主要是因高温使微生物体内的 一些重要蛋白质，如酶等，发生凝固、变性， 从而导致微生物无法生存而死亡。
灭菌温度（˚C）
100 110 120 130 140 150
达到灭菌程度的时间 （min）
843
维生素B1的损失（%） 99.99
75
89
7.6
27
0.Байду номын сангаас51
10
0.107
3
0.015
1
1.2 影响灭菌的因素
培养基成分 培养基的物理状态 培养基中氢离子浓度 培养基中微生物数量 微生物细胞含水量 微生物细胞菌龄 微生物的耐热性 空气排出情况 搅拌 泡沫
• 致死温度与致死时间：杀死微生物的极限温度 称为致死温度。在致死温度下，杀死全部微生 物所需的时间称为致死时间；在致死温度以上， 温度愈高，致死时间愈短。
微生物的热阻和相对热阻：前者是指微生物 在某一特定条件（主要是温度和加热方式） 下的致死时间。后者是指某一微生物在某 条件下的致死时间与另一微生物在相同条 件下的致死时间的比值。
1 1-5 30 2 5-10
湿热灭菌的优点 • 蒸汽来源容易，操作费用低，本身无毒； • 蒸汽有强的穿透力，灭菌易于彻底； • 蒸汽有很大的潜热； • 操作方便，易管理。
1.1 湿热灭菌的理论基础
• 将培养基中的杂菌总数N0杀灭到可以 接受的总数N（10-3），需要多高的温 度、多长的时间为合理。
细菌孢子的热死灭动力学与营养细胞的有
所不同。它表现为非对数的死亡动力学。 但当温度超过120˚C时，热阻极强的嗜热 脂肪芽孢杆菌孢子的热杀灭动力学也接 近对数死亡动力学即符合一级反应规律。
• 取边界条件t0=0，N=N0，对上式积分得
Nt ekt N0
或
t 1 ln N0 2.303 lg N0
• 灭菌温度和时间的确定取决于：
– 杂菌孢子的热灭死动力学 – 反应器的形式和操作方式 – 培养基中有效成分受热破坏的可接受范围
微生物的热死灭动力学方程：对数残留定律
• 微生物营养细胞的均相热死灭动力学符合化学 反应的一级反应动力学，即：
dN dt
kN
N-任一时刻的活细菌浓度，个/L； t-时间，min； K-比热死速率常数，min-1，越小越耐热
54℃
10-1
残留的活菌含量
10-2
56℃
10-3
10-4 10-5
0
58℃ 60℃
24
6 8 10 t(min)
图2-1 大肠杆菌在不同温度下的死亡曲线
– 活化能ΔE的大小对K值有重大影响。其它条件
相同时， ΔE越高，K越低，热死速率越慢。 ∆E/R是微生物受热死亡时对温度敏感性的度量， 值越大，表明微生物死亡速率随温度的变化越 敏感，在灭菌中∆E/R是很重要的常数 。
• KVB从0.02（min-1）提高到0.06（min -1 ） • KBS从0.12（min-1）提高到40.0（min -1 ）
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子和 维生素B1的lnK-1/T图
2.1 2.2 2.3 2.4 2.5 2.6 2.7 2.8 绝对温度倒数，1/T（·K）×10-3
嗜热脂肪芽孢杆菌孢子死灭程度为N/N0=10-16时，灭菌温度 对维生素B1破坏的影响