实验一 MS培养基配制和灭菌
实验一 培养基的配制与灭菌
铁盐
有机物质 2,4-D
200倍液
100倍液 1.0 mg/ml
5 ml
10ml 1ml
——
5 ml
10ml ——
5 ml
10ml 1ml
NAA
KT 蔗糖
1.0 mg/ml
1.0 mg/ml 30 g
0.2ml
1.0ml 30 g
——
—— 30 g
0.1ml 30 g
琼脂
pH值
8g
5.8
8g
5.8
8g
五、作业要求：完成实验报告，回答下面的思考题 1、根据以下所给母液浓度、蔗糖和琼脂量，配制烟草愈伤组织诱 导和培养的培养基（MS1），按MS配方（Murashige and Skoog, 1962）计算各种母液吸取量或药品的直接称量量。 2、简述高压蒸气灭菌的步骤；培养基采用高压蒸气灭菌应注意哪 些事项？
药品名称
母液倍或母 液浓度 （mg/ml）
配制1 L培养基 配制0.25 L培养基所需母液量(ml) 所需母液量(ml) 或质量（g） 或直接称量量（g） MS 1 MS 2 MS 3
大量元素 微量元素 铁盐 有机物质 2,4-D NAA KT 蔗糖 琼脂 pH值
10倍液 100倍液 200倍液 100倍液 1.0 mg/ml 1.0 mg/ml 1.0 mg/ml 30 g 8g 5.8
5.8
——
5.8
1）在烧杯内放入一定量的蒸馏水，用量筒或移液枪按上述表 格内配方加入各种母液及激素。 2）加入蔗糖30g，待蔗糖溶解后（可搅拌）加水定容至1L。 3）调节PH值，用酸度计测量PH值至5.8，常用1mol/l的HCl或 NaOH调整。 4）在MS1和MS2中加入琼脂8g，加热溶解，溶解过程中不断 搅拌，加热时烧杯口上盖上锡箔纸，防止水分过度蒸发。 5）分装：将配好的培养基及时分装到小三角瓶中，防止凝固 ，每瓶约30ml-40ml（约覆盖瓶底），分装时不要沾壁口。 6）封口：用封口膜将将三角瓶封口。
MS培养基的配方与灭菌
MS培养基（用于分离）的配方与灭菌植物组织培养中常用的一种培养基是MS培养基。
MS培养基的配制包括以下步骤。
培养基母液的配制和保存MS培养基含有近30种营养成分，为了避免每次配制培养基都要对这几十种成分进行称量，可将培养基中的各种成分，按原量的20倍或200倍分别称量，配成浓缩液，这种浓缩液叫做培养基母液。
这样每次使用时，取其总量的1/20(50 mL)或1/200(5 mL)，加水稀释，制成培养液。
现将制备培养基母液所需的各类物质的量列出，供配制时使用。
大量元素(母液Ⅰ) mg／LNH4NO3 33 000KNO3 38 000CaCl2·2H2O 8 800MgSO4·7H2O 7 400KH2PO4 3 400微量元素(母液Ⅱ)KI 166H3BO3 1 240MnSO4·4H2O 4 460ZnSO4·7H2O 1 720Na2MoO4·2H2O 50CuSO4·5H2O 5CoCl2·6H2O 5铁盐(母液Ⅲ)FeSO4·7H2O 5 560Na2-EDTA·2H2O 7 460有机成分(母液Ⅳ)ⅣA肌醇20 000ⅣB烟酸100盐酸吡哆醇(维生素B6) 100盐酸硫胺素(维生素B1) 100甘氨酸400以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为200倍浓缩液。
上述几种母液都要单独配成1 L的贮备液。
其中，母液Ⅰ、母液Ⅱ及母液Ⅳ的配制方法是：每种母液中的几种成分称量完毕后，分别用少量的蒸馏水彻底溶解，然后再将它们混溶，最后定容到1 L。
母液Ⅲ的配制方法是：将称好的FeSO4·7H2O和Na2-EDTA·2H2O分别放到450 mL蒸馏水中，边加热边不断搅拌使它们溶解，然后将两种溶液混合，并将pH调至，最后定容到1 L，保存在棕色玻璃瓶中。
各种母液配完后，分别用玻璃瓶贮存，并且贴上标签，注明母液号、配制倍数、日期等，保存在冰箱的冷藏室中。
实验一MS培养基的配制
实验一MS培养基的配制一、实验目的：了解MS培养基的配制原理和方法，掌握其配制过程和分装方法。
二、实验材料与仪器：电子天平、量筒、烧杯、玻璃棒、组培瓶、移液器、6种母液、白沙糖、琼脂、氢氧化钠、盐酸、酸度计或pH试纸。
三、实验方法与步骤1、母液配制（1）大量元素(母液Ⅰ) (2) 微量元素(母液Ⅱ) (3) 铁盐(母液Ⅲ) (4) 有机成分(母液Ⅳ) ⅣA 和ⅣB (5) 植物生长调节物质(6－BA，NAA)以上各种营养成分的用量，除了母液Ⅰ为20倍浓缩液外，其余的均为100倍浓缩液。
2、1 L固体MS培养基配制（1）用电子天平称出8 g琼脂粉和 30 g蔗糖放在烧杯中，加入少量的蒸馏水在微波炉中加热使之溶解。
（2）用量筒从各种母液中分别取出所需的用量：母液Ⅰ为50 ml，母液Ⅱ、Ⅲ、ⅣA和ⅣB 各10ml。
（3）最后用蒸馏水定容到1 L；用 2 mol/L NaOH 或 2 mol/LHCL 溶液调节培养基的 pH 值至 5.8～6.0。
（4）用量筒量取100ml液体培养基分装在组培瓶里，再用移液器取适量的6－BA和NAA放入组培瓶里。
（5）在 1.1kg/cm2 压力（约 121℃）高压灭菌锅中灭菌 15～20 min；灭菌后，放置于室温自然冷却凝固待用。
3、实验分组本实验分五组，每组负责配制一组培养基组合：（1）MS+0.1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA（2）MS+0.5mg/L 6-BA+0.5mg/L NAA（3）MS+1mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA（4）MS+2mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA（5）MS+3mg/L 6-BA+0.1mg/L NAA4、其他需要灭菌的实验材料剪刀、镊子、蒸馏水、滤纸、培养皿、组培瓶。
四、分析1.MS母液分得更加细，一般实验室只分大量元素、微量元素、铁盐、有机成分四大类。
这里将大量元素中钙离子与硫酸根离子分开配，避免产生不溶物，将硼酸也单独列出来。
组织培养实验MS培养基及配制注意事项
一、MS培养基母液的配制注意：1．除CaCl2·2H2O单独配制外，大量元素按照使用时高10倍的数值称取，将各种化合物称量后，分别用少量水在不同的容器内充分溶解，然后在500ml烧杯中按顺序加入各溶液，加适量蒸馏水，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2．微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。
3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。
4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
A.制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。
B.称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。
二、培养基配制和灭菌一．养培养基配制程序(一).母液吸取量的计算配制培养基的升数母液吸取量= 母液体积（CC）×——————————母液浓缩倍数（二）各种母液按顺序编号排列A.大量元素；B.CaCl2.2H2O；C.微量元素；D.铁盐；E.有机物；F．生长素萘乙酸（NAA）：配制0.5mg/ml的NAA称取50mg ， NAA用少量95% 酒精溶解后加蒸馏水定容至1000ml；G..细胞分裂素、激动素（KT）配制0.5mg/ml的KT 称50mgKT 用少量1N HCL溶解后,加蒸馏水定容至100ml。
实验1-1MS培养基母液和常用试剂的配制
其他常用试剂的保存
配制好的其他试剂应保存在密封的玻璃瓶中 ，并放置在阴凉干燥处。避免阳光直射和高 温环境，以防变质。对于一些易挥发或易氧 化的试剂，应特别注意密封保存和使用。
04
实验操作流程与注意事项
03
04
配制好的培养基应尽快使用，避 免长时间存放。
实验安全须知
避免直接接触培养基和化学试剂，如不慎接 触，应立即用大量清水冲洗。
对于有毒有害的化学试剂，应遵循相关规定 进行操作和处理，不得随意倾倒或排放。
在实验过程中，应注意防范火灾、爆炸等安 全事故，遵循实验室安全规定。
05
实验结果与数据分析
03
常用试剂的配制与保存
植物生长调节剂的配制与保存
植物生长调节剂的配制
根据实验需求，将植物生长调节剂溶解于相应的溶剂中，如 水、乙醇等。按照所需的浓度进行配制，并充分摇匀。
植物生长调节剂的保存
配制好的植物生长调节剂应保存在低温、避光、干燥的环境 中，避免长时间暴露在空气中，以防氧化失效。
无机盐与微量元素的配制与保存
实验过程中严格控制了操作步 骤和试剂质量，确保了实验结 果的准确性和可靠性。
实验结果符合预期，证明了实 验方案的有效性和可行性。
实验中存在的问题与改进建议
实验中存在试剂配制误差和操 作不规范的问题，可能导致实
验结果的不准确。
建议加强实验操作规范性培 训，提高实验人员的操作水 平，确保试剂配制的准确性
熟悉实验操作流程与注意事项
实验操作流程
准备所需试剂和器材→按照配方配制 母液和常用试剂→过滤除菌→分装→ 储存。
MS培养基的配制
MS 培养基的配制1、配制几种母液（1）配制MS 大量元素母液一般将大量元素分别配制成100倍的母液，使用时再分别稀释100倍。
倍。
分别称取分别称取名称名称 重量重量 名称名称 重量重量 NH 4NO 3 165g 82.5 KH 2PO4 17g 8.5 KNO 3 190g 95 CaCl 2·2H 2O 44g 22 MgSO 4·7H 2O37g18.5各自配成1L 1L（（500ml 500ml）的母液。
各自倒入）的母液。
各自倒入1L 1L（（500ml 500ml）试剂瓶中，存放于冰箱中。
）试剂瓶中，存放于冰箱中。
）试剂瓶中，存放于冰箱中。
（2）配制MS 微量元素母液一般将微量元素配制成100倍母液。
倍母液。
依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）依次称取（注：溶好一个后，再加下一个）名称名称 重量重量 名称名称 重量重量 KI 0.083g Na 2MoO 4·2H 2O 0.025gH 3BO 3 0.62g CuSO 4·5H 2O 0.0025g MnSO 4·H 2O 1.69g CoCl 2·6H 2O 0.0025g ZnSO 4·7H 2O0.86g配成配成1L 母液，倒入1L 试剂瓶中，存放于冰箱中。
试剂瓶中，存放于冰箱中。
注：注：CuSO CuSO 4·5H 2O 和CoCl 2·6H 2O O 由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，由于称取量很小，如果天平精确度没有达到万分之一，可先配成调整液。
可先配成调整液。
分别称取CuSO 4·5H 2O 0.05g O 0.05g，，CoCl 2·6H2O ·6H2O 0.05g 0.05g各自配成100ml 的调整液，然后取5ml 就还有0.0025g 的量。
的量。
（3）配制MS 有机母液一般配制成100倍MS 有机母液。
配制ms培养基实验报告
配制ms培养基实验报告配制MS培养基实验报告引言：培养基是生物学实验中必不可少的一种工具，它提供了细胞生长所需的营养物质和环境条件。
在植物细胞培养中，MS培养基是最常用的一种基础培养基，它由Murashige和Skoog于1962年首次提出，并被广泛应用于植物组织培养和植物生理研究中。
本实验旨在通过配制MS培养基，深入了解其成分及配制方法。
一、材料与方法：1. 材料：- 水溶性盐类：硝酸钙、硝酸钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硼酸、锰酸钾、锌硫酸、硫酸铜、钼酸铵- 无机盐类：硝酸铵、磷酸二氢钾、硝酸钠、硫酸钾、硫酸铵- 有机物：肌酸、葡萄糖、维生素B5、天门冬氨酸、吲哚乙酸- 植物激素：植物生长素、植物生长素酸、植物生长素酯、植物生长素酸钠- pH调节剂：氢氧化钠、盐酸- 琼脂：用于凝固培养基2. 方法：1) 将硝酸钙、硝酸钾、硫酸镁、硫酸亚铁、硼酸、锰酸钾、锌硫酸、硫酸铜、钼酸铵分别称取适量，溶解于蒸馏水中，得到无机盐溶液A。
2) 将硝酸铵、磷酸二氢钾、硝酸钠、硫酸钾、硫酸铵分别称取适量，溶解于蒸馏水中，得到无机盐溶液B。
3) 将肌酸、葡萄糖、维生素B5、天门冬氨酸、吲哚乙酸分别称取适量，溶解于蒸馏水中，得到有机物溶液。
4) 将植物生长素、植物生长素酸、植物生长素酯、植物生长素酸钠分别称取适量，溶解于蒸馏水中，得到植物激素溶液。
5) 将无机盐溶液A、无机盐溶液B、有机物溶液、植物激素溶液按一定比例混合，加入适量的琼脂，调节pH值至适宜范围。
6) 高压灭菌培养基，使其达到无菌状态。
二、结果与讨论：通过以上步骤，我们成功配制出了MS培养基。
MS培养基的配方中包含了多种无机盐类、有机物和植物激素，这些成分为细胞生长提供了必要的营养物质和信号物质，保证了细胞的正常生长和分化。
其中，无机盐类的添加对于细胞的生长起到了重要的作用。
硝酸钙、硝酸钾等提供了细胞所需的氮源和钾源，硫酸镁和硫酸亚铁则提供了细胞所需的镁和铁等微量元素。
植物组织培养实验(1)
实验报告内容
实验名称 实验目的 实验原理 实验材料和用具 实验步骤 实验结果与分析
2. 分装。将培养基分装到8个50ml三角瓶中，培养 三角瓶中， 分装。将培养基分装到8 50ml三角瓶中 基厚度约为5mm。做好标记。 基厚度约为5mm。做好标记。 3. 灭菌。用高压蒸汽灭菌锅在121℃、 0.1MPa条件 灭菌。用高压蒸汽灭菌锅在121℃ 0.1MPa条件 下灭菌15～20min。操作按仪器操作步骤进行。 下灭菌15～20min。操作按仪器操作步骤进行。 灭菌后待压力下降到0Pa时取出 凝固后待用。 时取出， 灭菌后待压力下降到0Pa时取出，凝固后待用。
（三）实验材料和用具
实验材料： 实验材料：黄瓜种子 实验药品：灯用酒精、 70％酒精、 95％酒精、 实验药品：灯用酒精、 70％酒精、 95％酒精、 0.1％氯化汞，吐温-80，无菌水。 0.1％氯化汞，吐温-80，无菌水。 灭菌培养基： 灭菌培养基：MS 实验用具：无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、 实验用具：无菌室、无菌滤纸、无菌培养皿、烧 解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、 杯、解剖刀、镊子、剪刀、酒精灯、酒精棉花、 滴管、记号笔、废液罐、火柴、光照培养箱。 滴管、记号笔、废液罐、火柴、光照培养箱。
当植株的其他部位难以消毒时，可以选用 当植株的其他部位难以消毒时， 种子， 种子，消毒后的种子在无菌条件下播种到 含有水－琼脂培养基上或1/10 MS培养基上 含有水－琼脂培养基上或1/10 MS培养基上 使其发芽。将无菌培养的幼苗切成小片， 使其发芽。将无菌培养的幼苗切成小片， 作为外植体。 作为外植体。
作业
1. 1 周后观察灭菌培养基有无污染 ， 计算污 周后观察灭菌培养基有无污染， 染率（染菌瓶数/总瓶数×100％ 染率（染菌瓶数 /总瓶数 ×100％ ），分析 染菌原因。 染菌原因。 2. 1 周后观察初代培养体系有无污染 ， 计算 周后观察初代培养体系有无污染， 每一瓶内染菌外植体数和外植体外的菌落 分析染菌原因。 数，分析染菌原因。 3. 1 周 后 观 察 种 子 发 芽 情 况 ， 计 算 发 芽 率 （发芽种子数/种子总数×100％）。 发芽种子数/种子总数×100％
MS培养基的配制,灭菌等注意事项
一、MS培养基母液注意：1．大量元素按照使用时高10倍的数值称取，分别将各种化合物称量后，除CaCl2·2H2O单独配制外，其余化合物混合在500ml 烧杯中加适量蒸馏水溶解，用玻璃棒搅拌促溶，倒入1000ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，置小口瓶中保存，贴上标签注明化合物名称（或编号），浓缩倍数，配制日期和配制者姓名，CaCl2·2H2O配制同上置于另一小口瓶中。
2．微量元素母液的配制按要求浓缩100倍的数值称取，分别将各种化合物称量除铁盐（FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O）作为一组单独配制外，其余化合物可混合置于烧杯内加少量蒸馏水溶解后，定容在1000ml容量瓶中，置小口瓶中保存，贴上标签。
3．铁盐配制将FeSO4·7H2O和Na2-EDTA.2H2O分别溶于450ml蒸馏水中，加热，（很重要）不断搅拌，溶解后，两液混合，调PH至5.5加水定容至1000ml，置于小口瓶中，贴上标签。
4．有机物母液配制，按母液要求浓缩50倍，除蔗糖按3%单独临时称量外，其余分别称量后，溶解，定容在500ml容量瓶中，置于小口瓶中保存，贴上标签。
5．母液最好在2~4℃的冰箱中贮存，特别是有机类物质，贮存时间不宜过长，无机盐母液最好在一个月内用完，如发现有霉菌和沉淀产生，就不能再使用。
1．制备母液和营养培养基时，所用蒸馏水或无离子水必须符合标准要求，化学药品必须是高纯度的（分析纯）。
2．称量药物采用高灵敏度的天平，每种药品专用一药匙。
．生长调节剂母液配制：为了操作方便，节约时间，生长调节剂也可如同配制母液一样，先配成原液，这样配制培养基时只要稍加计算，按需要量取即可。
不同药品在配制时若不溶于水，可用少量不同的溶剂先溶解，萘乙酸（NAA），吲哚乙酸（IAA）,赤霉素（GA3），2，4-D等生长素和玉米素（ZT）可先用少量95%酒精溶解，然后加水，如溶解不完全再加热。
ms培养基的制备实验报告
ms培养基的制备实验报告
实验目的：
本实验旨在制备ms培养基，为细胞培养提供适宜的营养环境。
实验原理：
ms培养基是一种适用于植物细胞培养的基础培养基，其主要成分包括无机盐、糖类、维生素和植物激素等。
本实验制备ms培养基的主要步骤包括配制无机盐溶液、配制糖类溶液和调配维生素、植物激素溶液等。
实验步骤：
1. 配制无机盐溶液：按照ms培养基的配方，称取所需的无机盐粉末，加入适量的去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
2. 配制糖类溶液：按照ms培养基的配方，称取所需的糖类粉末，加入适量的去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
3. 调配维生素、植物激素溶液：按照ms培养基的配方，称取所需的维生素和植物激素粉末，加入适量的去离子水中，用磁力搅拌器搅拌至完全溶解。
4. 将无机盐溶液、糖类溶液和维生素、植物激素溶液按照一定比例混合，得到ms培养基溶液。
5. 调节溶液的pH值：使用pH计测定ms培养基溶液的pH值，并根据需要调节pH值至适宜范围。
6. 将培养基溶液过滤：使用0.22μm的滤膜将ms培养基溶液过滤，以去除其中可能存在的微生物和杂质。
实验结果：
经过上述制备步骤，我们成功制备了一定量的ms培养基溶液。
经过pH调节和滤膜过滤处理，该溶液清澈透明，无菌。
经过质量检测，该溶液满足细胞培养的要求，可以用于细胞培养实验。
结论：
本实验通过一系列制备步骤，成功制备出适用于植物细胞培养的ms 培养基溶液。
该溶液满足细胞培养的营养需求，可以用于后续细胞培养实验。
MS固体培养基的配制
MS固体培养基的配制一、实验目的通过实验实训，掌握MS固体培养基的配制技术及操作技能。
二、材料与用具配制MS培养基的各种母液、生长调节物质母液、琼脂、蔗糖、蒸馏水、移液管、量筒、电饭煲、全自动高压灭菌器、pH试纸、0.1mol/L 的NaOH、0.1mol/L的HCl、培养瓶、标签、铅笔等。
三、方法与步骤（一）按母液顺序和规定量，用吸管提取母液，放入盛有一定量（150-200ml）纯净水的量筒中。
母液一 30ml/L母液二 15ml/L母液三15ml/L母液四 15ml/L母液五30ml/L母液六7.5ml/L1-8组4人配1L，9-10组3人配1L。
（二）加入植物生长调节物质加入的具体调节物质与量视培养物不同而异（本次实验不加生长调节剂）。
（三）定容加纯净水定容至1000ml。
（四）倒入预先用铅笔标好刻度的电饭煲中。
（五）加糖、加热：加入蔗糖20g/L并开始加热。
（六）加琼脂粉12g/L：在电饭煲中给培养基加温至冒热气时均匀缓慢地加入琼脂粉，用玻璃棒不断搅拌至全部熔解并煮沸。
（七）调节pH值：煮沸后，用试纸测试pH值，用0.1mol/L的NaOH或0.1mol/L的HCl把培养基的pH调整到5.6—5.8；加水至预先标注的刻度处，煮沸1-2分钟。
（八）培养基分注把配置好的培养基用烧杯分注到培养瓶中，分注前用量筒量取30ml水倒入培养瓶测试，每瓶装30ml（3瓶/100 ml）左右。
分注后立即加盖，贴上标签，注明培养基的名称、配制时间、配制人姓名。
（九）培养基灭菌，无菌水、无菌瓶、无菌纸片制作。
1.将蒸馏水注入灭菌腔，直至水流进入水位板中间的水位指示器。
2.将待灭菌的物品放入提篮中，将提篮放入灭菌腔中。
3.插上电源，打开开关。
4.旋紧“排汽旋钮”，关闭灭菌腔盖，直至指示灯“LOCKED”亮起。
5.选择灭菌程序，按“SET/ENT”键设置温度为121℃，保温时间20min。
6.长按“START”键开始灭菌。
ms培养基的配制流程实验报告
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实验一配制MS及无菌苗的培养
实验一配制MS及无菌苗的培养一．实验目的学习培养基配制及与灭菌的操作方法二．实验方法（一）培养基配制配制培养基300ml（1/2班级人数）①用量筒量取500ml蒸馏水倒入烧杯中，用玻璃铅笔划好液位线，再将蒸馏水倒出一半。
②称琼脂2.4克倒入烧杯中，再称蔗糖60g备用。
③每组取50ml烧杯一只，用50ml量筒取大量元素30ml，分别用移液管吸取微量元素0.3ml，铁盐1.5ml，维生素B1 0.12ml，维生素B6 0.15ml，烟酸0.15ml，甘氨酸0.3ml，肌醇1.5ml 置于烧杯中备用（注意移液管不能混用）④将加入琼脂的烧杯放在石棉网的文火上煮沸，煮时常用玻璃棒搅动，待琼脂融化后加入蔗糖。
蔗糖溶解后将早已吸好的大量元素，微量元素，铁盐有机物的混合液倒入烧杯中，将装好混合液的烧杯用蒸馏水洗三次，倒入300ml烧杯中，加热片刻（注意不要煮沸），讲烧杯离火，加蒸馏水定容至液位线。
⑤用1M的NaOH或1M的HCL将PH调至5.8，调时应用玻璃棒不断搅拌，并用PH试纸测PH值。
⑥用玻璃漏斗将300ml培养基分注于15只三角瓶中，每瓶约20ml。
（分注培养基时不可将培养基倒在三角瓶内外壁上）⑦封好瓶⑧培养基的灭菌（略）待用（二）培养材料的灭菌与接种①接种前用肥皂洗手，特别是将手指洗干净，然后用沾70%的酒精棉球把手和指尖消毒一次②将大豆种子用70%的酒精浸泡灭菌5分钟，再用0.2%氯化汞浸泡灭菌10分钟，然后用灭菌水洗三次备用③把培养基放在接种台左侧，用70%酒精棉球把接种台擦一遍（清除尘粒）④将接种所用的大小镊子等沾以70%酒精，在酒精灯火焰上灼热灭菌，然后放在支架上，注意不可再行污染。
⑤去掉瓶塞，将三角瓶在火焰上方灼热灭菌（瓶口转动一圈），用镊子将灭菌后备用的大豆放入三角瓶内培养基上，每瓶接种3~5粒（注意大豆的种脐要贴在培养基上，不要放反了）⑥迅速盖上瓶塞，放于培养室内进行培养实验二原生质体融合一、实验目的本实验是学习和掌握利用酶解法，除去植物细胞壁，获得原生质体的方法。
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实验一MS培养基配制和灭菌
一．目的和要求：
1. 学会MS培养基的制作方法;
2. 掌握高压灭菌的方法和基本操作。
二、仪器与试剂
1. 仪器：灭菌锅、解剖刀、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿、移液管等
2. 试剂：MS的Macro-e、Micro-e、有机母液、Fe盐、肌醇蔗糖，琼脂粉，1N NaoH 和1N HCl
三、方法步骤
（一）配方设计: 以MS为基本培养基（mg/L）
（二）配制培养基
(1)溶化琼脂：量取300ml左右蒸馏水，加入4.8g琼脂粉，加热溶解直至完全融化。
(2) 各种母液的吸取：Macro-e 50ml
Micro-e 1ml
有机成分1ml
Fe盐5ml
肌醇10ml
加在一起，倒入烧杯（1L)
（3）加入糖:称取30g 蔗糖，溶于溶有琼脂的300ml 蒸馏水中。
（4）根据实验设计，量取生长调节剂:加在一起，倒入烧杯。
（5）定容:加蒸馏水（用量杯）。
（6）调节pH至，用pH试纸进行测定，用1molHcl或1Mol NaoH调节。
（7）分装:30～40 ml/瓶6，培养基勿碰三角瓶口。
（8）用具清理和洗涤：各种母液按原位置摆整齐，用过的量筒，移液管、烧杯、铝锅等用水洗涤干净，然后按次序放回原处。
（三）灭菌：用高压蒸汽消毒器灭菌，其压力为～,温度为120～126℃，保持15~20 min。
具体操作步骤：
1. 加水；
2. 把包扎好的培养基装入高压锅；
3. 盖上热压锅盖,上紧螺帽(注意对角拧紧螺帽)关上气阀和安全阀；
4. 加热；
5. 排除冷空气；
6. 排除冷空气后,关闭放气阀，待压力升到1Kg位置时，开始计算灭菌时间，一般在1Kg 压力(121℃)下灭菌15~20 分钟即可，但要注意保持稳定压力。
7. 灭菌时间达到20 分钟后，停止加热，待压力自动降到0磅时，打开放气阀，打开热压灭菌锅盖(注意对角扭松螺帽)稍待冷后再把培养基取出。
四.作业
1. 总结配制培养基的注意事项。
2. 制作培养基前为何要提前配制母液
实验二短柄五加无性系建立
一．目的和要求：
1.学习并掌握外植体的消毒方法及具体操作;
2. 掌握无菌操作技术。
二、材料、仪器与试剂
1.材料：短柄五加休眠枝
短柄五加( Eleutherococcus brachypus Harms.)为五加科五加属灌木，在我国的分布范围极其狭窄，主要分布于西北黄土高原，逐渐被认为是濒危植物。
其茎具有较高的药用价值，有治疗神经衰弱、妇女更年期综合症、继发性高血压、白细胞减少等功效。
2.仪器：超净工作台、灭菌锅、弯头剪、枪状镊子、烧杯（500ml）、培养皿等
3.试剂：配制好的MS培养基各种母液、1mol/L的NaOH、1mol/LHCL、%的升汞、70%的乙醇。
三、方法步骤
(一) 无菌操作
准备阶段
接种室：1、紫外灯提前照20-30min。
2、70%乙醇或新洁尔喷雾消毒。
操作人员：1、穿专用实验服，戴口罩。
2、剪短指甲，流水洗手三次。
操作阶段
1、清理工作台面，70%乙醇擦三次。
2、70%乙醇擦手三次。
3、避免说话和来回走动
(二) 无性系建立
1. 配制启动培养基
CK MS
①MS+6-BA 0. 5 mg/L + L
②MS+6-BA mg/L + L
③MS+6-BA 2. 0 mg/L + L
④MS+6-BA 1. 0 mg/L + L
⑤MS+6-BA 2. 0 mg/L + L
2. 材料的选择：选用的枝条要求表面光滑、无病虫害。
3. 培养步骤：
（1）外植体消毒：
去杂→流水水洗1～2h→70%乙醇（8-10s）→无菌水洗3-5次→%HgCl2（10min）→无菌水水洗5次
（2）接种：
用剪刀将灭菌后的枝条剪成长约1～1.5 cm的单芽茎段。
将茎段按其自然极性方向垂直插入培养基，每瓶只接一个。
对接种用具、超净台面、操作者手等进行适当灭菌处理，继续接种。
（3）培养：培养物置于25℃左右的培养室中，每天光照12 小时，光照度为850-1200lx。
（4）观察：定期观察培养物的生长情况，及时将污染材料取出。
四、作业
1、总结本实验外植体的消毒过程及关键步骤。
2、进行试验结果的观测、比较和记录，并通过分析筛选出月季无性系建立的最佳培养基配方。
No.
植物生长调节剂
接种数/个萌芽数/个污染数/个萌芽率/%芽生长情况6-BA NAA IBA
CK00 1
2 1. 0
3 2. 0
4 1. 0
5 2. 0。