喜树碱及其衍生物的提取和应用

9-硝基喜树碱
• 9-硝基喜树碱（9-NC）以TopoI为作用靶点, 其内酯环打开, 酰基与TopoI中的亲核部分相 互作用, 与TopoI-DNA断裂复合物可逆结合, 形成药物-TopoI-DNA三元复合物, 从而稳定了 可裂解复合物, 使复制不能进行下去, 从而使 细胞死亡。主要用于治疗直肠结肠癌及卵巢癌 ，且对胰腺癌效果显著。
• 7-氰基喜树碱(7-cyano-camptothecin)
喜树碱
• 喜树碱主要用于对胃肠道肿瘤的近期疗 效较好，但缓解期较短；主要治疗胃、 肠、肝、肺、卵巢、膀胱和头颈部癌及 急慢性粒细胞性白血病。与其它抗癌药 物无交叉耐药性。
10-羟基喜树碱
• 10-羟基喜树碱能抑杀处于增殖期的肿瘤细胞，属于细 胞周期特异性药物，主要作用于DNA合成期(即S期)， 并对G2期及M期边界有延缓作用。主要用于原发性肝癌 、胃癌、头颈部癌、直肠癌及白血病治疗。
结论
• 索氏回流法操作简便，溶剂消耗量小，对有效成分的提取也比较 完全，是实验室常用的提取中药材有效成分的方法，但因提取过 程是在高温(高于提取溶剂的沸点)环境下完成，因此，对热敏感 物质的提取不宜采用此法。由于喜树碱不溶于水和普通的有机溶 剂，对光、热敏感易分解。从理论上讲采用超声提取最好，但本 试验通过对3种提取方法的提取液中喜树碱含量进行方差分析和 Duncan多重比较，结果显示：95％乙醇索氏回流提取液中喜树碱 含量极显著的高于95％乙醇超声提取，95％乙醇超声提取又极显 著的高于0．3％NaOH溶液碱法提取。这可能是由于超声提取过程 中超声波产生的强烈振荡，不仅会破坏喜树碱的结构，也会加大 喜树碱与其他物质接触并发生反应的概率，超声波在加速喜树碱 溶解的同时，也加速了喜树碱的分解和向其他物质转变，导致最 终提取液中喜树碱含量低于索氏回流提取。另外，在长时间的碱 液浸提过程中，由于喜树碱在钠盐中十分不稳定，很容易与其他 物质结合生成更稳定的物质，增加了还原为喜树碱的难度，并且 喜树碱在酸水中的溶解度极低，因此，提取液中喜树碱含量极显 著的低于索氏回流提取和超声提取。 • 综合考虑到样品中喜树碱的损失量，去除杂质的效果，以及简化 实验操作减少误差来源，本实验选用的提取喜树碱的最佳方法为 ：用95％的乙醇索氏回流提取6 h，样品不经温水浸泡和石油醚萃 取。
喜树碱的提取方法
• • • • • • 95％乙醇索氏回流法 0.3%NaOH溶液提取法 95％乙醇超声提取法 匀浆提取法 常温冷浸提取法 水浴振荡提取法
95％乙醇索氏回流法工艺流程
干燥喜树果实 粉碎至10~ 20 目 将样品装入滤纸斗 并将开口处封死 注入虹吸量1.6~1.7倍的 95%乙醇
用盐酸调PH为2~3
几种重要的喜树碱类抗癌物质
• • • • • 喜树碱（camptothecin） 10-羟基喜树碱（10 – hydroxycamptothecin) 喜树碱-11（CPT-11) 9-二甲氨基- 10-羟基喜树碱(topotecan) 9-硝基喜树碱(9-nitrocamptothecin)
• 9-氨基喜树碱(9-amino camptothecin）
喜树碱-11
• 喜树碱－11(CPT-11)是喜树碱的一种半 合成衍生物，可以作为一种前体药物。 在体内喜树碱－11被迅速转变成它的活 性代谢物 7-乙基-10-羟基喜树碱（SN－ 38），主要用于治疗卵巢癌及已转移的 直肠结肠癌。
9-二甲氨基- 10-羟基喜树碱
• 9-二甲氨基- 10-羟基喜树是半合成的DNA拓扑异构酶 I(TopoI)抑制剂，作用特点是与拓扑异构酶I形成复合 物并导致DNA不能正常复制，导致DNA双链损伤，由于 哺乳动物不能有效地修复这种DNA损伤，因此抑制细胞 增殖。被广泛用于治疗卵巢癌和小细胞肺癌。
搅拌吸附6h 用板框过滤机过滤
将吸附的活性炭干燥后 用氯仿回流洗脱喜树碱
将洗脱液回收氯仿至干膏体 加甲醇煮沸溶解膏体
冷却至室温 喜树碱粗品
95％乙醇超声提取法工艺流程
干燥喜树果实 粉碎至10~ 20 目
95%乙醇超声提取2次 得提取液
将提取液过滤 得滤液
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概述
• 喜树（Camptotheca ）为山茱萸目珙桐 科乔木植物，是我国特有的一种高大落 叶乔木，广泛分布于长江流域及西南各 省。 • 喜树中主要含喜树碱（camptothecine ）、喜树次碱（venoterpine）、10-羟 基喜树碱（10-hydroxycamptothecine ）、10-甲氧基喜树碱（10methoxycamptothecine）、白桦脂酸（ betulic acid）、长春甙内酰胺（ vincoside-lactam）等。 • 1966年美国的Monroe E.wall博士从喜 树茎的提取物中分离得到了抗癌活性物 质，将其命名为喜树碱（ Camptothecine）。 • 喜树碱属于生物碱类。
理化性质
• 喜树碱的分子式C20H16N2O4，化学名称为：1H一吡喃酮[3 ，4 ：6，7]吲哚并[1，2一b]喹啉一3，14(4H，2H)一 二酮 • 喜树碱是淡黄色结晶，一个含喹啉、内酯、内酰胺的 五环平面化合物，此五环中仅有一个不对称中心(C20) ，其构型为S型。 m.p.264～266℃，[α ]D40°，不 溶于水，可溶于氯仿、乙醇、乙酸、乙酸乙酯等。 • 没有明显的碱性，属于中性乃至近酸性物质，与一般 生物碱试剂无反应 ，也不能与酸成盐。
比较与分析
• 通过对14种提取方案(见表1)提取液中的喜树碱含量进行方差分析 和Duncan多重比较，结果显示：采用95％乙醇索氏回流法提取的 方案l、方案2、方案3和方案4，经HPLC法测定喜树碱含量极显著 地高于采用95％乙醇超声提取和0．3％NaOH溶液提取的各方案。 • 比较采用索氏回流提取的方案1—4可以看出：方案1、方案3中喜 树碱含量极显著地高于方案4，方案2与方案1和方案3差异不显著 ，与方案4在0．05水平差异显著，但在0．01水平差异不显著。即 样品未经任何处理的提取方案，与经过温水浸泡或经过石油醚萃 取处理的提取方案相比。喜树碱含量差异不显著，但与同时经过 温水浸泡和石油醚萃取处理的提取方案相比差异极显著。表明在 95％乙醇索氏回流提取过程中采取的去除杂质的方法均不会显著 影响样品中喜树碱含量。但若同时采用两种去除杂质的方法则会 极显著的降低提取液中的喜树碱含量。
喜树碱类抗癌药的作用原理
• 喜树碱类药物通过抑制DNA拓扑构型异构酶 Ⅰ(TopoI)的合成，使DNA链断裂，阻断DNA合 成，干扰细胞分裂周期以及使染色体DNA断裂 、降解等反应，在机体多种调控蛋白协同作用 下，最终导致肿瘤细胞死亡。 • 拓扑异构酶Ⅰ是生物体内广泛存在的一类必需 酶, 参与DNA 复制、转录、重组和修复等所有 关键的过程。
加盐酸搅拌 调pH 为2~ 3
将浓缩液离心 得上清液
将滤液浓缩 得浓缩液
过滤得沉淀
用甲醇洗涤2~3次 得喜树碱粗品
三种提取法比较
准备阶段
准确称取喜树碱标准品5．00 mg，以无水乙醇为溶剂， 超声波助溶并定容至100 mL；准确吸取1．0 mL、2．0 mL、3．0 mL、4．0 mL、5．0 mL、6．0 mL、7．0 mL 、8．0 mL、9．0 mL、10．0 mL标准液，分别置于10 mL容量瓶中，用无水乙醇稀释定容至刻度，摇匀。该标 准系列浓度为：5．0、10．0、15．0、20．0、25．0、 30．0、35．0、40．0、45．0、50．0mg/L。按照1．3 色谱条件进行测定，每个浓度标准液重复进样5次，取 色谱峰面积的平均值。根据峰面积(Y)与标准液浓度(X) 呈正比的关系确定线性回归方程为：Y=32 114X一16 995，相关系数R2=0．9985。
喜树碱的提取及其衍生物的应用
Extraction of camptothecine and its derivatives, and applications 蒲彩蓉 20090411310019 杨庆先 20090411310028
目录
• • • • • 概述 理化性质 喜树碱的提取方法 喜树碱类抗癌药的作用原理 几种重要的喜树碱类抗癌物质
色谱曲线
对照实验
• 精确称取干燥喜树叶粉42 份，每份1．00 g，按表l 所示的3种提取方法，即 索氏回流提取、超声提取 和碱法提取，辅以不同的 去除杂质的试验方案分别 提取喜树碱，高效液相色 谱(HPLC)法测定喜树碱含 量，每个方案重复3次， 每次进样5针，取平均值 ，筛选出既能有效去除杂 质又不影响喜树碱提取率 的方案作为本试验的最佳 提取方案。结果见表1。
取上清液
80℃水浴 提取2~4小时
过滤的沉淀
用甲醇洗涤2~3次 得喜树碱粗品
0.3%NaOH溶液提取法工艺流程
干燥喜树果实 粉碎至10~ 20 目 1. 5% NaOH浸渍12 h 装入渗漉桶中 0. 3%氢氧化钠液渗漉 收集6~ 8 倍液
加盐酸搅拌 调pH 为2~ 3
按喜树果实粗粉量 0. 6%加入活性炭