单克隆抗体的制备
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程1.鼠标免疫：选择合适的抗原，并将其注射到小鼠或其他啮齿动物的体内。
这样可以激发小鼠体内的免疫系统产生特异性的抗原抗体。
2.细胞融合：在小鼠免疫周期结束后，收集其脾细胞，并将其与癌细胞（如骨髓瘤细胞）进行融合。
这一步骤将产生一组称为杂交瘤细胞的细胞群体，具有免疫系统的特异性。
3.筛选和扩增：将融合细胞在含有抗生素的培养基中进行筛选，以去除非融合细胞和未融合的B细胞。
然后，将融合细胞转移到含有较低抗生素浓度的培养基中，以扩增单克隆细胞株。
4.克隆：通过稀释稀释法或限稀稀释法，将单个细胞分离成单个细胞，并将其分别培养在微孔板中。
培养一段时间后，进行测序和酶联免疫吸附试验（ELISA）等测试，以筛选出产生特异性抗体的克隆。
5.生产和纯化：确定产生特异性抗体的克隆后，可以进行大规模的生产和纯化。
将克隆细胞移植到大容量培养器中，进行大规模培养。
然后，通过收集和离心等步骤收集细胞上清液，获取抗体。
6.特性和稳定性测试：对生产的抗体进行特性和稳定性测试，以确定其特异性、亲和力、稳定性和纯度等参数。
这些测试通常包括ELISA、Western blot、免疫组织化学（IHC）等。
7.应用：将制备好的单克隆抗体用于特定的应用，如免疫组化、免疫印迹、流式细胞术等。
根据需要，可能需要对抗体进行标记，如荧光标记或酶标记，以便在特定实验中进行检测。
总之，单克隆抗体制备流程是一个复杂而耗时的过程，需要经过多个步骤来获得特异性和高亲和力的抗体。
这些抗体可以用于研究、诊断和治疗等领域，对于科学研究和临床应用有着重要的意义。
单克隆抗体制备的主要技术
单克隆抗体制备的主要技术单克隆抗体制备的主要技术_______________________________单克隆抗体（Monoclonal Antibody，简称mAb）是一种特殊的抗体，它们可以特异性地识别抗原，并且具有极高的特异性和稳定性。
它们已经在临床治疗和诊断方面发挥了重要作用，因此单克隆抗体制备技术已成为生物医学研究的重要手段。
一、单克隆抗体制备的基本原理单克隆抗体制备的基本原理是将一种特定的抗原分子和一种抗原特异性的抗体分子连接起来，从而产生一种特定的单克隆抗体。
这种联合物可以由一种具有抗原特异性的单克隆抗体分子或多克隆抗体分子所表示。
单克隆抗体制备的基本过程可分为四个步骤：选择抗原；制备抗原；选择和培养单克隆抗体产生细胞；制备和纯化单克隆抗体。
1、选择抗原在进行单克隆抗体制备时，首先必须选择一种特定的抗原，以便于产生特异性的单克隆抗体。
常用的抗原来源有蛋白质、多肽、核酸、糖蛋白和合成化学物质。
2、制备抗原根据所选用的抗原，可采用不同的方法对其进行制备。
例如，蛋白质通常可以采用蛋白质表达或免疫原制备方法；多肽可以采用合成方法或者从天然蛋白质中分离出来；核酸可以采用合成方法或者从样品中分离出来；糖蛋白可以采用表达方法或者从天然蛋白质中分离出来；而合成化学物质可以直接合成。
3、选择和培养单克隆抗体产生细胞在单克隆抗体制备中，必须使用能够产生特异性单克隆抗体的产生细胞。
目前常用的单克隆抗体产生细胞包括B细胞、T细胞和流感株融合细胞。
在这些产生细胞中，B细胞是最常用的，因为它能够快速、有效地产生大量的特异性单克隆抗体。
4、制备和纯化单克隆抗体当B细胞产生了足够数量的单克隆抗体之后，就可以采用不同的方法将它们制备和纯化出来。
常用的方法包括浸出法、寡核苷酸酶切法、蛋白酶浸出法、杂交法和Ion-exchange chromatography。
这些方法可以帮助我们得到高度纯化的单克隆抗体。
二、单克隆抗体制备的优势单克隆抗体制备是一种高效、可靠的方法，它可以用来高通量地产生大量特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体制备的基本过程
单克隆抗体制备的基本过程
1.免疫原选择：选择适当的免疫原进行免疫，以诱导机体产生特异性抗体。
免疫原可以是蛋白质、多肽、病毒、细菌等。
2.动物免疫：将免疫原注射到动物体内，通常使用小鼠、兔子或大鼠作为免疫动物。
免疫的方法包括皮下注射、腹腔注射或静脉注射。
3.抗体筛选：收集动物的抗体样本，检测其对免疫原的特异性和亲和力。
常用的方法包括ELISA（酶联免疫吸附测定法）和免疫组化。
4.B细胞筛选：选择具有高亲合力的抗体阳性B细胞作为单克隆抗体的源头。
B细胞流式细胞分选或细胞培养均可用于筛选。
5.克隆化：从筛选出的B细胞中获得单个的抗体分泌细胞。
可以通过限稀稀释、单细胞分选、细胞融合等方法获得单克隆抗体细胞株。
6.表达和纯化：将单克隆抗体细胞按照需要进行培养和大量扩增，使其产生足够的抗体。
通过培养上清液或组织提取等方式获得抗体。
7. 鉴定和验证：对制备的单克隆抗体进行鉴定和验证，确定其特异性和亲和力。
常用的方法包括Western blotting、免疫组化和流式细胞术等。
8.应用和保存：单克隆抗体可以用于研究、诊断或治疗等领域。
制备的抗体可以保存在液氮中，以备后续使用。
需要注意的是，单克隆抗体制备是一项复杂的工作，需要专业的知识和技术。
制备过程中可能会遇到各种问题，如抗原选择、抗体筛选和细胞克隆等环节的问题。
因此，在进行单克隆抗体制备之前，应对各个环节进行充分的计划和准备，并请专业的科研人员或技术人员指导操作。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种由单一克隆的B细胞产生，具有针对特定抗原的高度特异性和亲和力的抗体。
制备单克隆抗体的过程主要包括以下几个步骤：免疫原制备、小鼠免疫、混合细胞瘤制备、细胞筛选与分克隆。
首先，制备免疫原。
根据需要制备一种抗原，可以是纯化的蛋白质、多肽或合成的多肽。
这个抗原通常具有特异性，可用于激发B细胞产生特异性抗体。
其次，选择小鼠免疫。
通常选择小鼠作为免疫动物，因为小鼠的免疫系统较为适合。
给小鼠注射免疫原，激发其免疫反应。
为了增强免疫效果，通常在小鼠体内使用佐剂，如完全弗氏佐剂。
然后，制备混合细胞瘤。
在小鼠接种一段时间后，从其脾脏或骨髓中取出淋巴细胞。
然后通过融合淋巴细胞和骨髓瘤细胞，如骨髓瘤SP2/0，获得混合细胞瘤。
接下来，细胞筛选与分克隆。
将混合细胞瘤悬浮液均匀地滴于含有选择性培养基的平板上，通过稀释法，保证每个细胞得到充分的空间生长。
经过适当的培养时间后，细胞形成单个克隆。
最后，对每个克隆细胞进行培养与鉴定。
收集克隆细胞，经过一段时间的培养，获得充足的抗体。
而后，对培养液中的抗体进行鉴定，采用ELISA和免疫组化方法来确认是否产生了特定抗原的单克隆抗体。
在单克隆抗体制备的过程中，需要注意以下几点：首先，免疫原的制备应保证其纯度和有效性；其次，小鼠对免疫原的免疫应注意适当的剂量和接种时机；再者，混合细胞瘤的制备要控制好融合细胞的比例，避免细胞瘤的过度生长；最后，细胞的培养与鉴定是确保获得高质量单克隆抗体的关键环节，要进行仔细的监测和筛选。
总之，单克隆抗体的制备过程是一个复杂而精细的过程，需要在实验操作中严格控制各个步骤，以确保获得高质量、高特异性的单克隆抗体。
这些单克隆抗体不仅可以应用于科学研究领域，还可以用于临床诊断和治疗。
单克隆抗体制备流程
单克隆抗体制备流程单克隆抗体是一种来源于单一B细胞克隆的抗体，具有高度的特异性和亲和力，被广泛应用于生物医药领域。
其制备流程主要包括免疫原制备、动物免疫、细胞融合、筛选和鉴定等步骤。
下面将详细介绍单克隆抗体制备的流程。
1. 免疫原制备。
首先需要准备纯化的抗原蛋白，可以是蛋白质、多肽、细胞膜蛋白等。
抗原蛋白的纯度和活性对单克隆抗体的制备至关重要，因此需要进行严格的纯化和活性检测。
通常采用亲和层析、离心、电泳等方法进行抗原蛋白的提取和纯化。
2. 动物免疫。
将纯化的抗原蛋白注射到小鼠或兔子等动物的体内，诱导其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意控制免疫程序，监测抗体滴度，以及合理调整免疫方案，以提高单克隆抗体的产量和质量。
3. 细胞融合。
从免疫动物中获取脾细胞或骨髓细胞，与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS-1等）进行融合，得到杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有较高的产抗体能力，能够长期稳定地分泌单克隆抗体。
4. 筛选和鉴定。
通过ELISA、免疫印迹、细胞免疫荧光等方法对杂交瘤细胞培养上清液进行筛选和鉴定。
筛选出特异性较强的单克隆抗体阳性杂交瘤细胞，并进行亚克隆的鉴定，最终获得单克隆抗体细胞株。
5. 扩大培养和纯化。
将筛选出的单克隆抗体细胞株进行扩大培养，获得大量的单克隆抗体上清液。
然后采用亲和层析、离子交换层析、凝胶过滤等方法对单克隆抗体进行纯化，获得高纯度的单克隆抗体制剂。
总结。
单克隆抗体制备流程是一个复杂而又精细的过程，需要在每个环节都严格控制条件，确保单克隆抗体的产量和质量。
通过上述步骤的实施，可以获得高效、高纯度的单克隆抗体，为生物医药领域的研究和应用提供有力支持。
单克隆抗体的制备流程
单克隆抗体的制备流程
一、抗体cDNA克隆
2、结合分离：抗体和抗原之间采用免疫学方法，进行亲和结合分离，在病理学中，可以采用细胞亲和免疫电泳或者细胞色素紧缩技术来进行识
别性结合分离抗体。
3、mRNA提取：使用RNAsy Plus Kit根据操作说明提取亲和结合分
离后的抗体的mRNA，用于cDNA合成。
4、cDNA合成：使用双链cDNA合成试剂盒，根据说明书操作，将mRNA合成双链cDNA。
5、克隆：将双链cDNA进行克隆，经过构建的一系列步骤，最终将cDNA克隆到载体上，构建出抗体cDNA克隆库。
二、抗体cDNA克隆抗体制备
1、选择克隆体：选择抗体cDNA克隆库中的抗体表达克隆，采用PCR
技术进行选择，并检测克隆体具有良好的免疫特性，可以快速确定最佳克
隆体。
2、表达载体构建：将最佳克隆体插入到表达载体中，构建出属于克
隆体的表达载体，以此保证克隆体的正确表达。
3、表达系统筛选：利用多种表达系统，筛选出最佳的表达系统，以
此来达到最佳的表达效果。
4、表达调控：对于最佳的表达系统，根据cDNA克隆体的特性，进行
最佳的表达调控，以此达到最佳的抗体表达效果。
单克隆抗体制备的基本流程
单克隆抗体制备的基本流程以单克隆抗体制备的基本流程为标题，本文将介绍单克隆抗体的制备过程，包括免疫原的选择和制备、小鼠免疫、细胞融合、筛选和克隆等步骤。
单克隆抗体是由一种特定的免疫细胞株分泌的抗体构成，具有高度的特异性和亲和力，广泛应用于医学诊断、免疫治疗等领域。
第一步：免疫原的选择和制备免疫原是刺激机体产生抗体的物质，可以是蛋白质、多肽、糖类等。
在制备单克隆抗体时，需要选择合适的免疫原，并进行制备。
常用的制备免疫原的方法包括基因工程重组、化学合成、纯化天然蛋白等。
制备好的免疫原应具有高纯度、活性和稳定性。
第二步：小鼠免疫将制备好的免疫原注射到小鼠体内，刺激其产生特异性抗体。
在免疫过程中，需要注意合理的免疫方案，包括免疫剂量、免疫间隔、免疫次数等。
通常情况下，免疫间隔为1-2周，免疫次数为3-4次。
免疫后，需要等待一段时间，使小鼠产生足够的抗体。
第三步：细胞融合细胞融合是将小鼠的免疫细胞与骨髓瘤细胞（如SP2/0、NS1等）融合，形成杂交瘤细胞。
杂交瘤细胞具有小鼠免疫细胞的抗体产生能力和骨髓瘤细胞的无限增殖能力。
细胞融合的方法包括电融、PEG融合等，其中PEG融合是最常用的方法。
第四步：筛选与克隆杂交瘤细胞融合后，需要进行筛选和克隆，以获得产生特异性单克隆抗体的细胞株。
筛选的方法通常是将杂交瘤细胞悬浮在含有抗原的培养基中，通过ELISA、免疫荧光等技术鉴定细胞株的抗原特异性。
筛选出的阳性细胞株需要进行克隆，常用的方法有有限稀释法、限 dilution法等。
克隆后的细胞株可以进一步培养和扩增。
第五步：抗体的纯化与鉴定通过培养和扩增克隆细胞株，可以获得大量的抗体。
抗体的纯化通常采用亲和层析、离子交换层析等技术，以去除杂质和提高纯度。
纯化后的抗体可以进行鉴定，包括亲和力测定、特异性检测、Western blot等方法。
通过以上步骤，就能够制备得到特异性的单克隆抗体。
制备单克隆抗体的过程需要严格控制各个环节，确保抗体的特异性和质量。
单克隆抗体制备
1. 免疫动物：三只Balb/c小鼠2. 佐剂：首先用完全弗氏佐剂（CFA），后用不完全弗氏佐剂（IFA）。
3. 免疫原：蛋白或KLH偶联多肽。
每次免疫使用50-100µg免疫原。
4. 免疫：用PBS稀释免疫原，然后与相应的佐剂1：1混合。
抗原和佐剂完全混合形成稳定的乳剂，将该乳剂在小鼠双肩周围的皮肤下进行皮下注射和后腿进行肌肉注射。
每个区域大约用1/8的免疫原。
接着将1/2的免疫原进行腹腔注射，这样免疫原可以持久存在从而提高免疫应答。
以后每个星期进行腹腔注射直到达到要求的效价。
5. 第0星期预采血完全弗氏佐剂（CFA）混合的100µg抗原免疫小鼠。
第2星期完全弗氏佐剂（CFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第3星期不完全弗氏佐剂（IFA）混合的50µg抗原免疫小鼠。
第4星期溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第5星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
第X星期取适当的细胞或组织进行ELISA和WB检测，溶解在PBS中的50µg抗原免疫小鼠。
6. 杂交瘤融合和筛选：用PEG方法将效价最好的小鼠脾细胞和骨髓瘤细胞F0进行融合。
用抗原对融合的杂交瘤克隆进行筛选，检测它们的特异性和敏感性。
ELISA阳性的克隆可用WB检测，筛选出来的克隆至少还需要亚克隆两次。
7. 大规模抗体生产：筛选得到两个克隆最后进行大规模培养（每个克隆1L）或者取腹水（每个克隆5只小鼠）。
用蛋白A/G对培养液或腹水进行纯化，平均每个克隆可以得到3-5mg 抗体。
8. 注意：每个融合平均可以得到900多个克隆，对于多肽抗原可以得到100个左右的ELISA阳性克隆，重组蛋白抗原可以得到100-150个ELISA阳性克隆。
亚克隆实验做的越早，越容易保存克隆。
因此，为了保存和复苏阳性克隆，尽早进行筛选检测是必需的。
单克隆抗体的制备原理及应用
单克隆抗体的制备原理及应用概述单克隆抗体是由单一克隆细胞分泌的抗体，具有单一的抗原结合特异性，在生物医学研究和临床诊疗中具有重要的应用价值。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及其在医学领域的主要应用。
制备原理单克隆抗体的制备包括如下几个步骤：1.抗原免疫：选择目标抗原，根据需要选择适当的动物作为免疫宿主，并注射抗原以激发免疫反应。
2.B细胞分离：从免疫宿主的脾脏或淋巴结中分离出B细胞，这些细胞具有产生抗体的能力。
3.融合：将B细胞与癌细胞（常用的是骨髓瘤细胞）进行融合，生成一种称为杂交瘤细胞的细胞系。
4.筛选：通过筛选，选择出产生特定抗原结合特异性的单个细胞。
常用的筛选方法包括ELISA和流式细胞术。
5.扩增和提取：将筛选出的单克隆细胞进行扩增，然后提取单克隆抗体。
应用领域单克隆抗体在医学领域具有广泛的应用，主要包括以下几个方面：1.肿瘤治疗：单克隆抗体可以用于肿瘤治疗，通过特异性结合肿瘤细胞表面的抗原，识别并杀灭肿瘤细胞。
例如，CD20单克隆抗体在非霍奇金淋巴瘤治疗中被广泛使用。
2.自身免疫性疾病治疗：单克隆抗体可以用于治疗自身免疫性疾病，如风湿性关节炎、狼疮等。
它们可以通过抑制免疫反应的关键分子，降低炎症反应和组织损伤。
3.诊断试剂：单克隆抗体可以用作诊断试剂，帮助检测疾病标志物或特定细胞表面受体。
例如，嗜酸性粒细胞抗体可以用来识别嗜酸性粒细胞，从而辅助诊断哮喘和过敏性疾病。
4.病原体检测：单克隆抗体可以用于检测病原体，如病毒、细菌等。
它们可以特异性地结合病原体表面的蛋白质，从而帮助诊断和监测感染性疾病。
5.药物研发：单克隆抗体可以用于药物研发，如生物制剂和抗体药物。
它们可以作为靶向药物的组成部分，具有高度的特异性和选择性。
通过上述应用领域的介绍，可以看出单克隆抗体在医学领域的广泛应用，为疾病的诊断和治疗提供了有效的手段。
总结单克隆抗体的制备原理简单明了，包括抗原免疫、B细胞分离、融合、筛选、扩增和提取等步骤。
制备单克隆抗体的原理
制备单克隆抗体的原理
单克隆抗体制备的原理是使用相同的抗原去刺激小鼠免疫系统产生抗体，然后利用细胞融合技术融合小鼠脾细胞和肿瘤细胞，形成的杂交瘤细胞能够长期稳定地分泌单一种抗体。
制备单克隆抗体的步骤包括：免疫小鼠、采集脾细胞、合并脾细胞和肿瘤细胞、筛选杂交瘤细胞、克隆化杂交瘤细胞、培养单克隆细胞、收集单克隆抗体。
首先，将目标抗原注射到小鼠体内，刺激其免疫系统产生抗体。
随后，采集小鼠脾脏，分离脾细胞。
接下来，将脾细胞与骨髓瘤细胞（如myeloma）进行细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这个步骤可以通过短暂的高温、聚乙二醇或其他化学物质来促进细胞融合。
随后，将杂交瘤细胞进行筛选。
通常通过培养基中加入选择性抗生素来杀死未融合的脾细胞和骨髓瘤细胞，只留下融合细胞的杂交瘤细胞。
这些细胞称为杂交瘤克隆细胞。
然后，将杂交瘤克隆细胞进行克隆化。
将单个克隆细胞分离，分别培养成单个细胞克隆，并扩展培养。
接下来，用ELISA等技术对克隆细胞的细胞上清进行筛选，
以检验其对目标抗原的特异性。
只有对目标抗原产生特异性抗体的克隆细胞才能被选择出来。
最后，收集特异性单克隆抗体。
将特异性的克隆细胞进行扩增
培养，并收集细胞上清中的单克隆抗体。
通过上述步骤，可以制备出具有高特异性、高亲和力的单克隆抗体，用于特定抗原的检测、定量、纯化等实验和应用中。
简述单克隆抗体制备原理。
简述单克隆抗体制备原理。
单克隆抗体是一种通过人工合成而获得的高度特异性的抗体,通常用于检测、诊断和治疗各种疾病。
单克隆抗体的制备原理主要涉及以下几个步骤:
1. 细胞培养:选择适当的细胞系,如B细胞或T细胞等,将其培养在适宜条件下。
2. 分子标记:使用一定的技术和分子标记技术,如荧光标记、放射性标记等,将目标分子或目标分子的基因编码序列引入细胞中。
3. 基因重组:利用基因工程技术,如基因重组载体、基因编辑工具等,将目标分子的基因与相应的单克隆抗体基因进行重组。
4. 表达和处理:将重组后的单克隆抗体基因导入细胞中,使其表达目标分子。
随后,对表达后的单克隆抗体进行筛选和纯化。
5. 扩增和制备:利用适当的扩增技术和设备,如PCR、冻存技术等,将筛选得到的单克隆抗体进行扩增,并制备成所需的浓度和规模。
单克隆抗体制备的原理是基于人工合成抗体的概念,通过分子标记和基因工程技术,将目标分子的基因与单克隆抗体基因进行重组,
使其在细胞中表达并产生高特异性的抗体。
随后,通过筛选、纯化和扩增等技术,获得所需的单克隆抗体。
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是一种来源于同一种细胞的抗体，具有高度的特异性和亲和力。
它在生物医药领域有着广泛的应用，包括疾病诊断、药物治疗、生物学研究等方面。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法，希望能够为相关研究工作者提供一些帮助。
首先，单克隆抗体的制备原理是基于对特定抗原的高度特异性识别。
在制备过程中，首先需要选择合适的抗原，通常选择蛋白质、多肽或小分子等作为抗原。
然后，通过免疫动物（如小鼠、大鼠、兔子等）注射抗原来诱导免疫应答，激发机体产生特定的抗体。
接着，从免疫动物中获取免疫细胞，如B细胞，然后将其与癌细胞融合，形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具有免疫细胞的抗体合成能力和癌细胞的无限增殖能力，能够长期产生单克隆抗体。
其次，单克隆抗体的制备方法主要包括免疫动物免疫、细胞融合、筛选和培养等步骤。
在免疫过程中，需要确定合适的免疫动物种类、抗原的免疫方案和免疫时间等因素，以提高单克隆抗体的特异性和亲和力。
在细胞融合过程中，需要将免疫细胞与癌细胞进行融合，形成杂交瘤细胞。
接着，通过细胞培养和筛选，筛选出产生特定单克隆抗体的杂交瘤细胞，并进行大规模培养和抗体的纯化。
在单克隆抗体的制备过程中，需要注意一些关键技术和方法。
例如，在抗原的选择和免疫动物的免疫过程中，需要进行充分的实验设计和控制，以确保抗体的特异性和亲和力。
在细胞融合和筛选过程中，需要选择合适的细胞融合剂和培养基，以提高杂交瘤细胞的产量和纯度。
此外，在单克隆抗体的纯化过程中，需要选择合适的纯化方法，如亲和层析、离子交换层析等，以获得高纯度的单克隆抗体。
总之，单克隆抗体的制备原理及方法是一个复杂而又关键的过程，需要在实验设计、技术操作和实验控制等方面进行精心的策划和执行。
通过不断的实验探索和技术创新，相信单克隆抗体制备技术将会得到进一步的提高和发展，为生物医药领域的发展做出更大的贡献。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理引言：单克隆抗体是一种与特定抗原高度亲和的抗体，它由单一的B细胞或其衍生的细胞克隆产生。
单克隆抗体制备是一项重要的生物技术手段，广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
本文将介绍单克隆抗体制备的原理及其在科学研究和医学应用中的重要性。
一、单克隆抗体的起源和背景抗体是机体免疫系统中产生的一种特殊蛋白质，可以识别和结合抗原，从而参与免疫应答。
传统的抗体制备方法主要依赖于动物免疫，但存在许多局限性，如免疫反应的不可控性、抗体来源有限等。
为了解决这些问题，科学家发展出了单克隆抗体制备技术。
二、单克隆抗体制备的原理单克隆抗体制备的原理基于混合细胞瘤技术和免疫细胞培养技术。
具体步骤如下：1. 抗原免疫：将目标抗原注射到小鼠等哺乳动物体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
2. 细胞融合：从免疫小鼠体内提取B细胞和骨髓细胞，将它们与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞株SP2/0）融合，形成杂交瘤细胞。
3. 杂交瘤筛选：将杂交瘤细胞悬浮于含有选择性培养基的培养皿中，使非杂交细胞死亡，只留下杂交瘤细胞。
4. 单克隆细胞扩增：将杂交瘤细胞分装到96孔板中，每孔只包含一个细胞，培养并扩增单克隆细胞。
5. 单克隆抗体收集：从培养上清中收集单克隆抗体，经过纯化和鉴定，获得纯度较高的单克隆抗体。
三、单克隆抗体制备的重要性1. 高亲和力和特异性：与多克隆抗体相比，单克隆抗体具有更高的亲和力和特异性，可以更准确地结合目标抗原。
2. 可重复性和稳定性：单克隆抗体制备的过程可以被重复进行，从而获得相同的抗体产品。
此外，单克隆抗体也具有较长的稳定性，可以在不同实验条件下保持一致的性能。
3. 应用广泛：单克隆抗体广泛应用于医学诊断、药物研发和治疗等领域。
例如，单克隆抗体可以用于肿瘤标记、疾病诊断、药物靶点鉴定等。
4. 抗体工程的基础：单克隆抗体的制备为后续的抗体工程提供了基础。
通过改变单克隆抗体的结构和功能，可以获得更加理想的抗体产物。
单克隆抗体制备(共44张PPT)
单克隆抗体制备流程图
亲本细胞的选择与制备
骨髓瘤细胞 (NS-1)
骨髓瘤细胞需定期用
细胞株稳定，易传代培养；
细胞株本身不产生Ig
是次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖 转换酶 缺陷株
(hypoxanthine-guanine phos phoribosyl transferase ,HGPRT)
最常用的骨髓瘤细胞是NS-1 和SP2/0细胞株
PEG可导致细胞膜上 脂类物质的物理结构 重排，使细胞膜容易 打开而有助于细胞融 合。
常见的几种融合形式
细胞DNA合成途经
HAT选择培养基
三种关键成分：
次黄嘌呤（hypoxanthine,H）
氨基蝶呤（aminopterin,A）
胸腺嘧啶（thymidine ，T）
◆是根据细胞内嘌呤核苷酸和嘧啶核苷酸的 生物合成途径设计的用于筛选杂交瘤细胞
因此在传统抗血清中，都含有许多种不同的抗体，分别针对这些不同的eptope。
每 mL 含有100 个 但除非抗原来源困难或有其它目的，我们仍采用传统方法，因免疫反应的启动机制非常复杂，生物整体的免疫反应是最可靠的。
单克隆抗体的制备流程和应用
细胞，若只要取一个 试采血 确定有抗体产生后，即可取出 脾脏以收集脾脏细胞(大多为B 细胞) 与骨髓瘤细胞进行 细胞融合。
2)体外增量培养法： 把杂交瘤细胞在大型培养槽 中培养，收集培养液上清即得抗体，但每 mL 只得 约数 mg，浓度较腹水稀约一千倍。最近有一种细 胞培养瓶，可产生如腹水般浓度的上清，但价格极 为昂贵 (IBS Integra Bioscience: Integra Celline)。
单克隆抗体的性质鉴定
种抗体；因此在传统抗血清中， 都含有许多种不同的抗体，分
单抗制备原理
单抗制备原理
单抗制备原理是指通过免疫细胞融合技术，将特定的抗原与特异性抗体结合，最终合成出具备相应特异性的单克隆抗体。
单克隆抗体是一种具有高特异性和高亲和力的抗体，可用于诊断、治疗和研究等领域。
单克隆抗体的制备主要包括以下步骤：
1. 免疫原制备：提取目标抗原并纯化，使其成为单克隆抗体的免疫原。
2. 免疫兔子或小鼠：将免疫原注射到兔子或小鼠体内，激发其免疫系统产生特异性抗体。
3. 细胞融合：从兔子或小鼠体内提取骨髓细胞，与无限增殖潜能的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤筛选：通过限制性稀释法或酶免疫吸附筛选法，筛选出产生特异性抗体的杂交瘤细胞。
5. 单克隆抗体培养：将筛选出的杂交瘤细胞进行单克隆化，分离成单个克隆株，每个克隆株都产生特异性的单克隆抗体。
6. 单克隆抗体纯化：通过层析、电泳等技术对单克隆抗体进行纯化，去除杂质。
7. 鉴定和鉴定：利用免疫学技术对单克隆抗体进行鉴定，确定其特异性和亲和力。
8. 大规模制备：将特异性的单克隆抗体进行扩增和大规模制备，以满足实际需求。
通过以上步骤，可以制备出具有高特异性和高亲和力的单克隆抗体。
这些单克隆抗体可以应用于疾病的诊断、治疗和研究中，为医学和生物科学领域提供重要的工具和技术支持。
单克隆抗体的制作流程
单克隆抗体的制作流程一、引言在生物医学研究和临床治疗中，单克隆抗体被广泛应用。
它可以通过与特定的抗原结合来识别和定位目标分子，为研究人员提供了重要的工具。
在本文中，我们将深入探讨单克隆抗体的制作流程，包括免疫原选择、免疫动物制备、细胞融合和单克隆抗体筛选等环节。
二、免疫原选择免疫原的选择对于制备具有高特异性和亲和力的单克隆抗体至关重要。
首先要确定所需的抗原特征，例如结构域、修饰形式等。
常见的免疫原包括蛋白质、多肽、糖类、小分子化合物等。
在选择免疫原时，需考虑其易得性、免疫原性、纯度、稳定性等因素。
2.1 蛋白质和多肽免疫原蛋白质和多肽通常是制备单克隆抗体最常用的免疫原。
选择合适的蛋白质或多肽，可以根据目标蛋白的功能域、线性表位或立体结构等特征。
对于复杂的蛋白质，可以选择亲和纯化后的特定结构域或表位作为免疫原。
2.2 糖类免疫原糖类通常具有较复杂的结构，选择适当的免疫原十分关键。
在制备糖类免疫原时，可以选择与糖链特异性结合的蛋白质作为载体，通过共价结合将糖类连接到蛋白质上，并保持其天然的空间构象。
2.3 小分子化合物免疫原小分子化合物通常具有较弱的免疫原性，需要通过与载体结合形成分子复合物来增强免疫性。
常用的方法包括与大分子带电载体或蛋白质偶联，或通过共价结合形成分子复合物。
三、免疫动物制备合适的免疫动物选择和制备是单克隆抗体制备的重要环节。
常用的免疫动物包括小鼠、兔子和大鼠等。
3.1 小鼠小鼠是最常用的免疫动物，且易于操作。
在选择小鼠品系时，需考虑其免疫反应能力、抗原耐受性和容易获得的特点。
通常使用BALB/c小鼠或nude小鼠。
3.2 兔子兔子具有较强的免疫反应能力和较大的体积，可以提供大量的抗体。
但兔子对某些抗原可能产生耐受性。
3.3 大鼠大鼠易于操作且免疫反应充分，但体积较小，提供的抗体量相对较少。
四、细胞融合细胞融合是制备单克隆抗体的关键步骤之一。
通过将免疫动物的脾细胞与骨髓瘤细胞融合，可以获得具有免疫动物和癌细胞特点的杂交瘤细胞。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体是指由同一种细胞分泌的具有相同结构和功能的抗体分子。
单克隆抗体制备的过程主要包括以下几个步骤：抗原制备、免疫动物、细胞融合、筛选和克隆。
1. 抗原制备
首先需要准备纯化的抗原，通常采用多肽、蛋白质或其他生物大分子
作为抗原。
这些抗原必须具有足够的纯度和特异性，以便在后续步骤
中能够有效地诱导特异性免疫反应。
2. 免疫动物
将纯化的抗原注射到实验动物体内，例如小鼠、大鼠或兔子等。
这些
实验动物会产生针对该特定抗原的免疫反应，并产生多种不同类型的
抗体。
3. 细胞融合
将产生针对目标抗原特异性的B淋巴细胞与肿瘤细胞进行融合，形成
杂交瘤（hybridoma）。
肿瘤细胞通常来自于小鼠或人类，由于其具
有不受限制的增殖能力，可以保证单克隆抗体的持续生产。
4. 筛选
对杂交瘤进行筛选，以确定产生特定单克隆抗体的杂交瘤。
通常采用ELISA、Western blotting等技术对杂交瘤进行筛选，以检测其是否
产生目标抗原的特异性抗体。
5. 克隆
将产生目标抗原特异性抗体的杂交瘤进行单克隆化处理。
这个过程中
需要将杂交瘤分离，并将其分别培养在不同的培养基上。
最终，每个
单一细胞会形成一个单克隆群落，并产生相同结构和功能的抗体分子。
总之，单克隆抗体制备是一项复杂而精密的过程。
通过以上步骤，可
以从多种不同类型的B淋巴细胞中筛选出具有特定结构和功能的单克
隆抗体，并为医学、科学等领域提供了广阔应用前景。
单克隆抗体的制备原理及方法
单克隆抗体的制备原理及方法单克隆抗体是指来源于单一B细胞克隆的抗体，具有单一的抗原特异性。
它是一种高度纯化、高度特异性的抗体，广泛应用于生物医学研究、临床诊断和治疗等领域。
本文将介绍单克隆抗体的制备原理及方法。
首先，单克隆抗体的制备原理是基于B细胞的克隆扩增。
当机体受到抗原刺激后，B细胞会产生多种抗体，其中具有特异性的B 细胞将被筛选出来，然后与癌细胞融合形成杂交瘤细胞。
这些杂交瘤细胞具有B细胞的分泌抗体能力和癌细胞的无限增殖能力，能够长期稳定地分泌单一种类的抗体。
其次，单克隆抗体的制备方法包括免疫动物、细胞融合、筛选鉴定和大规模培养等步骤。
首先，需要选择合适的免疫动物，如小鼠、大鼠、兔子等，然后将抗原注射到动物体内，刺激B细胞产生抗体。
接着，收集免疫动物的脾细胞和癌细胞，进行细胞融合，得到杂交瘤细胞。
随后，通过细胞培养和限稀稀释法，筛选出分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
最后，对筛选出的单克隆抗体进行鉴定和鉴定，确保其具有高亲和力和特异性。
在实际操作中，制备单克隆抗体需要严格控制各个步骤的条件，包括抗原的选择和纯化、免疫动物的免疫程序、杂交瘤细胞的筛选和鉴定等。
此外，还需要考虑单克隆抗体的应用领域和特定要求，如在临床诊断中需要高灵敏度和高特异性的抗体，而在治疗中则需要稳定性和低免疫原性的抗体。
总之，单克隆抗体的制备原理及方法是基于B细胞的克隆扩增，通过免疫动物、细胞融合、筛选鉴定和大规模培养等步骤，最终得到具有单一抗原特异性的抗体。
制备单克隆抗体需要严格控制各个步骤的条件，并考虑其应用领域和特定要求。
希望本文能够为单克隆抗体的制备提供一定的参考和帮助。
单克隆抗体制备实验报告
一、实验目的1. 了解单克隆抗体制备的基本原理和实验流程；2. 掌握单克隆抗体制备过程中各步骤的操作方法；3. 通过实验，获得特异性单克隆抗体。
二、实验原理单克隆抗体是由单个B细胞克隆产生的高度均一、仅针对某一特定抗原表位的抗体。
制备单克隆抗体的基本原理是杂交瘤技术，即将具有分泌特异性抗体能力的致敏B细胞和具有无限繁殖能力的骨髓瘤细胞融合，形成杂交瘤细胞，进而培养出单克隆细胞，最终获得单克隆抗体。
三、实验材料1. 实验动物：Balb/c小鼠；2. 细胞：SP2/0骨髓瘤细胞；3. 抗原：待筛选的抗原；4. 试剂：弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、氢氧化铝佐剂、细胞培养液、抗生素、无菌操作器具等。
四、实验步骤1. 动物免疫（1）首免：将抗原与弗氏完全佐剂混合，通过多点注射法注射给Balb/c小鼠，剂量为150-200g/只。
（2）加强免疫：在首免后2-3周，重复首免过程。
2. B细胞提取（1）无菌操作，处死小鼠，取脾脏，制成单细胞悬液。
（2）用细胞分离液分离B细胞。
（3）洗涤、计数，调整细胞浓度。
3. 细胞融合（1）将B细胞与SP2/0骨髓瘤细胞按一定比例混合，加入聚乙二醇（PEG）诱导细胞融合。
（2）将融合细胞在含有抗生素的细胞培养液中培养。
4. 杂交瘤细胞筛选（1）在培养液中加入抗原，筛选出能分泌特异性抗体的杂交瘤细胞。
（2）将筛选出的杂交瘤细胞进行克隆化培养，获得单克隆细胞。
5. 单克隆抗体制备（1）将单克隆细胞在培养液中扩大培养，收集上清液。
（2）对上清液进行抗体检测，鉴定抗体特异性。
（3）采用适当方法纯化抗体，如亲和层析、离子交换层析等。
五、实验结果1. 成功获得特异性单克隆抗体。
2. 抗体特异性经ELISA等方法验证，与待筛选抗原具有高度特异性。
3. 抗体亲和力良好，可用于后续实验。
六、实验总结本次实验成功制备了特异性单克隆抗体，掌握了单克隆抗体制备的基本原理和实验流程。
在实验过程中，应注意以下几点：1. 动物免疫时，抗原与佐剂的混合比例、注射剂量、注射次数等要严格控制。
单克隆抗体制备的原理
单克隆抗体制备的原理以单克隆抗体制备的原理为标题，我将为您简要介绍单克隆抗体制备的原理和步骤。
单克隆抗体制备是一种从单一细胞分离出的抗体，具有高度特异性和亲和力。
它是通过对抗原刺激免疫细胞产生的抗体进行筛选和鉴定，从而获得特定单克隆抗体。
下面是制备单克隆抗体的主要步骤：1. 免疫原的制备：首先需要获得目标抗原，可以是蛋白质、多肽、糖类或其他小分子。
然后将抗原纯化并与佐剂混合，以增强其免疫原性。
佐剂可以激活免疫系统，促使机体产生更多的抗体。
2. 免疫动物的免疫：将免疫原注射到小型实验动物（如小鼠）的体内，以激发其免疫系统产生抗体。
为了增强免疫效果，通常需要多次免疫，间隔一定时间。
3. 细胞融合：在免疫动物产生足够的抗体后，需要收集其脾脏或骨髓细胞。
这些细胞中包含了产生抗体的B淋巴细胞。
将这些B细胞与骨髓瘤细胞（如骨髓瘤细胞SP2/0或NS0）进行融合，形成杂交瘤细胞。
4. 杂交瘤细胞的筛选：杂交瘤细胞具有无限增殖的能力，但它们只会产生一种类型的抗体。
为了筛选出目标抗体的单克隆细胞株，通常需要使用肿瘤细胞和抗生素来选择出只产生目标抗体的杂交瘤细胞。
5. 单克隆细胞的扩增：经过筛选后，单克隆细胞需要进行扩增，以获得足够多的细胞用于后续实验。
这些细胞可以在体外培养基中继续增殖，以产生大量的单克隆抗体。
6. 单克隆抗体的纯化和鉴定：通过培养单克隆细胞，可以获得细胞培养上清液，其中含有单克隆抗体。
然后可以使用各种纯化技术，如亲和层析、离子交换层析和凝胶过滤等，将目标抗体从上清液中纯化出来。
最后，通过鉴定技术，如酶联免疫吸附测定（ELISA）或免疫组化等，确定单克隆抗体的特异性和亲和力。
单克隆抗体制备是一项复杂而精细的工作。
通过对抗原的选择、免疫动物的免疫、细胞融合、筛选、扩增和纯化等步骤，可以获得具有高度特异性和亲和力的单克隆抗体。
这些抗体在医学诊断、药物研发和科学研究等领域具有广泛的应用前景。
单克隆抗体的制备为生物医学领域的研究和应用提供了强有力的工具，也为疾病的早期诊断和治疗提供了新的途径。
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单克隆抗体的研制一、单克隆抗体的概念抗体是机体在抗原刺激下产生的能与该抗原特异性结合的免疫球蛋白。
常规的抗体制备是通过动物免疫并采集抗血清的方法产生的，因而抗血清通常含有针对其他无关抗原的抗体和血清中其他蛋白质成分。
一般的抗原分子大多含有多个不同的抗原决定簇，所以常规抗体也是针对多个不同抗原决定簇抗体的混合物。
即使是针对同一抗原决定簇的常规血清抗体，仍是由不同B细胞克隆产生的异质的抗体组成。
因而，常规血清抗体又称多克隆抗体（polyclonal antibody），简称多抗。
由于常规抗体的多克隆性质，加之不同批次的抗体制剂质量差异很大，使它在免疫化学试验等使用中带来许多麻烦。
因此，制备针对预定抗原的特异性均质的且能保证无限量供应的抗体是免疫化学家长期梦寐以求的目标。
随着杂交瘤技术的诞生，这一目标得以实现。
1975年，Kohler和Milstein建立了淋巴细胞杂交瘤技术，他们把用预定抗原免疫的小鼠脾细胞与能在体外培养中无限制生长的骨髓瘤细胞融合，形成B细胞杂交瘤。
这种杂交瘤细胞具有双亲细胞的特征，既像骨髓瘤细胞一样在体外培养中能无限地快速增殖且永生不死，又能像脾淋巴细胞那样合成和分泌特异性抗体。
通过克隆化可得到来自单个杂交瘤细胞的单克隆系，即杂交瘤细胞系，它所monoclonal antibody），简称单抗。
与多抗相比，单抗纯度高，专一性强、重复性好、且能持续地无限量供应。
单抗技术的问世，不仅带来了免疫学领域里的一次革命，而且它在生物医学科学的各个领域获得极广泛的应用，促进了众多学科的发展。
Kohler和Milstein两人由此杰出贡献而荣获1984年度诺贝尔生理学和医学奖。
二、杂交瘤技术（一）杂交瘤技术的诞生淋巴细胞杂交瘤技术的诞生是几十年来免疫学在理论和技术两方面发展的必然结果，抗体生成的克隆选择学说、抗体基因的研究、抗体结构与生物合成以及其多样性产生机制的揭示等，为杂交瘤技术提供了必要理论基础，同时，骨髓瘤细胞的体外培养、细胞融合与杂交细胞的筛选等提供了技术贮备。
1975年8月7日，Kohler和Milstein在英国《自然》杂志上发表了题为“分泌具有预定特异性抗体的融合细胞的持续培养”（Continuous cultures of fused cells secreting antibody of predefined specificity）的著名论文。
他们大胆地把以前不同骨髓瘤细胞之间的融合延伸为将丧失合成次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（hypoxanthine guanosine phosphoribosyl transferase，HGPRT）的骨髓瘤细胞与经绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞进行融合。
融合由仙台病毒介导，杂交细胞通过在含有次黄嘌呤（hypoxanthine，H）、氨基喋呤（aminopterin，A）和胸腺嘧啶核苷（thymidine，T）的培养基（HAT）中生长进行选择。
在融合后的细胞群体里，尽管未融合的正常脾细胞和相互融合的脾细胞是HGPRT+，但不能连续培养，只能在培养基中存活几天，而未融合的HGPRT-骨髓瘤细胞和相互融合的HGPRT-骨髓瘤细胞不能在HAT培养基中存活，只有骨髓瘤细胞与脾细胞形成的杂交瘤细胞因得到分别来自亲本脾细胞的HGPRT和亲本骨髓瘤细胞的连续继代特性，而在HAT培养基中存活下来。
实验的结果完全像起始设计的那样，最终得到了很多分泌抗绵羊红细胞抗体的克隆化杂交瘤细胞系。
用这些细胞系注射小鼠后能形成肿瘤，即所谓杂交瘤。
生长杂交瘤的小鼠血清和腹水中含有大量同质的抗体，即单克隆抗体。
这一技术建立后不久，在融合剂和所用的骨髓瘤细胞系等方面即得到改进。
最早仙台病毒被用做融合剂，后来发现聚乙二醇（PEG）的融合效果更好，且避免了病毒的污染问题，从而得到广泛的应用。
随后建立的骨髓瘤细胞系如SP2/0-Ag14，和NSO/1都是既不合成轻链又不合成重链的变种，所以由它们产生的杂交瘤细胞系，只分泌一种针对预定的抗原的抗体分子，克服了骨髓瘤细胞MOPC-21等的不足。
再后来又建立了大鼠、人和鸡等用于细胞融合的骨髓瘤细胞系，但其基本原理和方法是一样的。
（二）基本程序和方法杂交瘤技术在具体操作上，各实验室使用的程序不尽一致。
本节中介绍的方法是作者所在实验室采用的、实践证明成熟的程序，该程序适合国内大多数实验室。
在开展杂交瘤技术制备单抗之前，培养骨髓瘤和杂交瘤细胞必须具备下列主要仪器设备：超净工作台、CO2恒温培养箱、超低温冰箱（-70℃）、倒置显微镜、精密天平或电子天平、液氮罐、离心机（水平转子，4000r/min）、37℃水浴箱、纯水装置、滤器、真空泵等。
其需要的主要器械包括：100ml、50ml、25ml细胞培养瓶，10ml、1ml刻度吸管，试管，滴管（弯头、直头），平皿，烧杯，500ml、250ml、100ml盐水瓶，青霉素小瓶，10ml、5ml、1ml注射器等，96孔、24孔细胞培养板，融合管（50ml圆底带盖玻璃或塑料离心管），眼科剪刀，眼科镊，血细胞计数板，可调微量加样器（~50ul，~200ul，~1000ul），弯头针头，200目筛网，小鼠固定装置等。
此外，杂交瘤细胞的筛选与检测的仪器设备，依据检测单抗的方法不同而各异，请参阅本节有关部分。
淋巴细胞杂交瘤技术的主要步骤包括：动物免疫、细胞融合、杂交瘤细胞的筛选与单抗检测、杂交瘤细胞的克隆化、冻存、单抗的鉴定等，图6-1概括了淋巴细胞杂交瘤技术研制单抗的主要过程。
1、动物免疫(1) 抗原制备制备单克隆抗体的免疫抗原，从纯度上说虽不要求很高，但高纯度的抗原使得到所需单抗的机会增加，同时可以减轻筛选的工作量。
因此，免疫抗原是越纯越好，应根据所研究的抗原和实验室的条件来决定。
一般来说，抗原的来源有限，或性质不稳定，提纯时易变性，或其免疫原性很强，或所需单抗是用于抗原不同组分的纯化或分析等，免疫用的抗原只需初步提纯甚至不提纯，但抗原中混杂物很多，特别是如果这些混杂物的免疫原性较强时，则必须对抗原进行纯化。
检测用抗原可以是与免疫抗原纯度相同，也可是不同的纯度，这主要决定于所用筛检方法的种类及其特异性和敏感性。
(2)免疫动物的选择根据所用的骨髓瘤细胞可选用小鼠和大鼠作为免疫动物。
因为，所有的供杂交瘤技术用的小鼠骨髓瘤细胞系均来源于BALB/c小鼠，所有的大鼠骨髓瘤细胞都来源于LOU/c大鼠，所以一般的杂交瘤生产都是用这两种纯系动物作为免疫动物。
但是，有时为了特殊目的而需进行种间杂交，则可免疫其他动物。
种间杂交瘤一般分泌抗体的能力不稳定，因为染色体容易丢失。
就小鼠而言，初次免疫时以8-12周龄为宜，雌性鼠较便于操作。
(3)免疫程序的确定免疫是单抗制备过程中的重要环节之一，其目的在于使B淋巴细胞在特异抗原刺激下分化、增殖，以利于细胞融合形成杂交细胞，并增加获得分泌特异性抗体的杂交瘤的机会。
因此在设计免疫程序时，应考虑到抗原的性质和纯度、抗原量、免疫途径、免疫次数与间隔时间、佐剂的应用及动物对该抗原的应答能力等。
没有一个免疫程序能适用于各种抗原。
现用的免疫程序中多数是参照制备常规多克隆抗体的方法。
表6-1列举了目前常用的免疫程序。
免疫途径常用体内免疫法包括皮下注射、腹腔或静脉注射，也采用足垫、皮内、滴鼻或点眼。
最后一次加强免疫多采用腹腔或静脉注射，目前尤其推崇后者，因为可使抗原对脾细胞作用更迅速而充分。
在最后一次加强免疫后第3天取脾融合为好，许多实验室的结果表明，初次免疫和再次免疫应答反应中，取脾细胞与骨髓瘤细胞融合，特异性杂交瘤的形成高峰分别为第4天和第22天，在初次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgM抗体，再次免疫应答时获得的杂交瘤主要分泌IgG抗体。
笔者体会阳性杂交瘤出现的高峰与小鼠血清抗体的滴度并无明显的平行关系，且多在血清抗体高峰之前。
因此，为达到最高的杂交瘤形成率需要有尽可能多的浆母细胞，这在最后一次加强免疫后第3天取脾进行融合较适宜。
已有人报道采用脾内免疫，可提高小鼠对抗原的免疫反应性，且节省时间，一般免疫3天后即可融合。
(摘自刘秀梵)体内免疫法适用于免疫原性强、来源充分的抗原，对于免疫原性很弱或对机体有害（如引起免疫抑制）的抗原就不适用了。
如果制备人单克隆抗体几乎不大可能采用体内免疫法。
因此，针对这些情况，可采用体外免疫。
所谓体外免疫就是将脾细胞（或淋巴结细胞，或外周血淋巴细胞）取出体外，在一定条件下与抗原共同培养，然后再与骨髓瘤细胞进行融合。
其基本方法是取4-8周龄BALB/c小鼠的脾脏，制成单细胞悬液，用无血清培养液洗涤2-3次，然后悬浮于含10%小牛血清的培养液中，再加入适量抗原（可溶性抗原ml，细胞抗原105-106个细胞/ml）和一定量的BALB/c小鼠胸腺细胞培养上清液；在37℃，6%CO2浓度下培养3-5天，再分离脾细胞与骨髓瘤细胞融合。
2、细胞融合（1）主要试剂的配制a、细胞培养基杂交瘤技术中使用的细胞培养基主要有RPMI-1640或DMEM（Dulberco ModifiedEagles Medium）两种基础培养基，具体配制方法按厂家规定的程序，配好后过滤除菌（），分装，4℃保存。
·不完全RPMI-1640培养基：RPMI-1640培养基原液96ml100×.溶液（L-谷氨酸）1ml双抗溶液1ml% NaHCO3溶液1-2mlHEPES溶液1ml·不完全DMEM培养基：DMEM 13.37g超纯水或四蒸水980mlNaHCO3 3.7g双抗溶液10ml100×.溶液10ml用1N HCl调试PH至，过滤除菌，分装4℃保存。
·完全RPMI-1640或DMEM培养基：不完全RPMI-1640或DMEM培养基80ml小牛血清15-20ml用于骨髓瘤细胞SP2/0和建株后的杂交瘤细胞培养。
·HT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基99mlHT贮存液1ml·HAT培养基：完全RPMI-1640或DMEM培养基98mlHT贮存液1mlA贮存液1mlb、氨基喋呤（A）贮存液（100×，4×10-5mol/L） : 称取氨基喋呤（Aminopterin MW ），溶于90ml超纯水或四蒸水中，滴加1mol/L NaOH 中和，再补加超纯水或四蒸水至100ml。
过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃保存。
c、次黄嘌呤和胸腺嘧啶核苷（HT）贮存液(100×,H:10-2mol/L，T：×10-3mol/L): 称取次黄嘌呤(Hypoxanthine,MW 和胸腺嘧啶核苷(Thymidine,MW ，加超纯水或四蒸水至100ml，置45-50℃水浴中使完全溶解，过滤除菌，分装小瓶（2ml/瓶），-20℃冻存。