真核生物启动子的鉴定方法

真核生物启动子的鉴定方法
启动子是RNA聚合酶识别、结合和开始转录的一段DNA序列。

它对基因的表达调控起着至关重要的作用。

本文对真核生物启动子的鉴定方法作了简要的总结，并对其优缺点进行了比较。

标签：真核；启动子；表达调控；RNA
在原核生物中，RNA多聚酶结合的位置即为启动子[1]。

但在真核生物中，启动子一直没有明确的概念，一般认为启动子是位于基因编码区上游，与RNA 聚合酶相互识别、结合并启动转录的DNA序列，它包括在起始位点附近直接活化或抑制转录的DNA序列元件。

启动子的定位是研究转录起始调控模式的前提，能否对其精确定位是后续功能性分析成败的关键[2]。

本文对真核启动子的鉴定方法进行了简要的综述，并比较了优缺点。

1S1核酸酶法
S1核酸酶法[3]由Arnold Berk和Philip Sharp于1977年创立，近年来关于该方法的优化有许多报道[4-5]。

其基本原理是首先构建噬菌体M13衍生型质粒，该质粒包括含有假定转录起始位点和其下游的部分核苷酸的基因区域、限制性酶切位点。

将引物和单链噬菌体DNA进行退火，加入Klenow和dNTPs，其中一种dNTP经放射性标记，以产生放射性标记的探针。

利用限制性内切酶将DNA 切割成线形，通过变性凝胶电泳分离放射性探针，再将探针和分离到的mRNA 进行杂交。

然后用S1核酸酶进行消化，单链RNA和DNA被消化，生成含有部分核苷酸的双链片段。

通过变性聚丙烯酰胺凝胶电泳确定放射性标记的抗S1核酸酶的产物大小，最后进行放射自显影或磷酸成像分析。

抗性产物的长度应该与从探针的5′末端到转录起始位点的距离相等。

这种方法的缺点是杂交分子易发生瞬间解离，产生相当多的背景条带。

2引物延伸方法
引物延伸方法[6]由P.K.Ghosh和S.M.Weissman于1978年提出。

首先根据与起始位点5′末端下游大约50～150个核苷酸的mRNA序列设计合成寡核苷酸引物，并将引物的5′末端用32p标记。

在根据经验确定的反应条件下，使过量的放射性标记引物与总RNA中特异的RNA分子或经过寡聚dT纯化的mRNA退火。

将反转录酶、脱氧核苷三磷酸和适宜的缓冲液加到引物-mRNA杂交分子体系中，催化引物延伸到mRNA的5′末端。

用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析产生的放射性标记的cDNA产物。

通过与旁边的标准分子量比较，在凝胶中检测条带的分子量大小。

然后计算从合成的寡核苷酸5′末端到mRNA转录起始位点的距离。

如果标记的cDNA产物在凝胶的分辨率范围内，转录起始位点的确定可精确到±1个核苷酸。

此方法的缺点是很难找到与新基因有效杂交的引物，而且经常出现背景带，另外，有些mRNA 5’末端富含G/C且产生稳定的二级结构，使得反转录
酶不能有效的延伸。

因此通常需要采用其他方法对结果进行验证。

3RNase保护
RNase保护[7-8]，首先构建质粒，该质粒应含有假定转录起始位点和其下游部分核苷酸的基因区域、SP6启动子和常见的限制性酶切位点。

用相应的限制性内切酶将质粒切割成线形。

再加入转录缓冲液、SP6RNA聚合酶、含有[α-32p]UTP 的NTPs以生成反义RNA探针。

将探针和分离到的mRNA进行杂交，用RNaseT1和RNaseA消化，RNA分子的单链突出部分被消化，而RNA-RNA杂交分子抗消化。

则探针抗消化的长度将与探针5′末端到转录起始位点的长度相等。

由于该探针是放射性标记的，可以在高分辨率的变性聚丙烯酰胺凝胶电泳上观察抗性片段的大小。

此方法必须解决的一个问题是探针的长度，探针越长，分析就越灵敏，但长探针形成二级结构的概率大，将导致背景信号和无效杂交，而且较长的探针还可能包括噬菌体聚合酶不能有效延伸的DNA区域。

为避免产生大量不完全转录物，通常需要对较长的探针进行凝胶纯化。

4RACE(cDNA末端的迅速扩增)
RACE(cDNA末端的迅速扩增)[9-13]，首先将引物与mRNA 5′末端的100～200核苷酸处杂交，利用反转录酶和dNTPs将引物延伸至mRNA 5′末端。

利用RNA连接酶将序列已知的寡聚核苷酸片段和cDNA的3′末端连接，再利用和连接上的寡聚核苷酸片段互补的上游引物和用于合成上述cDNA的引物稍靠内的下游引物进行PCR扩增，将扩增产物插入到载体中，分离多个单质粒克隆，对每个克隆进行测序，通过对PCR混合物的许多克隆测序，可以推测RNA起始位点的位置。

RACE的优点是灵敏度高，可有效定位无效转录基因或其他方法不适用的基因转录起始位点；缺点是PCR可能优先扩增不代表真正转录物5′末端的产物，从而使定位的准确性降低。

5足迹法(footprint)
足迹法(footprint)[14]，指DNA序列一旦结合了某种蛋白质，便会排斥其他任何因子的进一步结合。

将DNA起始转录的限制片段分离出来，加RNA聚合酶使之结合。

再用DNA聚合酶部分水解，与RNA聚合酶结合的部位被保护而不水解，其余部位水解成长短不同的片段，经凝胶电泳即可测出酶所结合的部位，即启动子的位置。

此方法的优点是操作简单，足迹边界清晰。

缺点是酶分子本身过大，使得足迹往往大于实际结合区域。

6展望
启动子的鉴定是分析转录起始水平上基因调控的基础。

对进一步了解基因的调控机制、研究基因的功能具有深刻的意义，并为疾病诊断、新药开发、病毒分型、肿瘤发病的分子机制的研究提供依据。

参考文献
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(收稿日期：2011-12-28)(编辑：何玉勤)。