10蛋白酶活力的测定
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法有多种，常见的方法包括：
1. 比色法：基于酶催化底物的产物与染色剂之间发生化学反应的原理。
测定过程中，酶水解底物产生的产物与染色剂发生反应形成有色产物，通过测定产物的吸光度来估计酶活性的强弱。
2. 荧光法：利用荧光底物的酶催化产物发出的荧光信号来测定酶活性。
荧光强度与酶催化产物的浓度成正比，通过测定荧光强度来分析酶活性。
3. 放射性标记法：将底物标记上放射性同位素，使其具有放射性。
通过测定底物放射性崩解的程度来估计酶活性的大小。
4. 免疫学方法：利用特异性抗体与酶结合形成抗原-抗体-酶复合物，测定抗原-抗体-酶复合物的活性来检测酶活性的强弱。
5. 吸收光谱法：利用特定的酶底物，通过测量其吸收光谱的变化来分析酶活性的强弱。
需要根据具体实验目的和条件选择适合的测定方法。
蛋白酶酶活测定方法
蛋白酶酶活测定方法一、实验原理：一定条件下不仅能够水解蛋白质中的肽键，也能够水解酰胺键和酯键，因此可用蛋白质或人工合成的酰胺及脂类化合物作为底物来测定蛋白酶的活力。
本实验选用酪蛋白为底物，测定微生物蛋白酶水解肽键的活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后，降解成相对分子质量较小的肽和氨基酸，在反应混合物中加入三氯醋酸溶液，相对分子质量较大的蛋白质和肽沉淀下来，相对分子质量较小的肽和氨基酸仍留在溶液中，溶解于三氯醋酸（TCA）溶液的肽的数量与酶的数量和反应时间成正比。
在280nm波长下测定溶液吸光度的增加，计算酶的活力。
一分钟内1mg牛血清蛋白（BSA）相当的非蛋白性Lowry试液显色物质的增量值定义为一个蛋白酶活性单位（IU）。
二、试剂配制：A溶液：含2%KCl，1%TrltonX-100的50mM磷酸盐缓冲溶液（pH 6.0）试样TG酶溶液：直接取发酵样12000rpm离心5min，取上清测定。
底物溶液：精确称取底物二甲基酪蛋白0.250g，加入50mM PB缓冲溶液（pH 6.0）10mL，常温搅拌30min使其溶解后备用。
三、操作步骤：1. 试样1）将底物溶液放入37℃恒温水浴中预热备用2）试管中加入试样TG酶溶液0.2mL后放入恒温水浴中，10min后加入已预热的底物溶液1mL，立即振荡混合，于37℃反应60min3）反应结束后，加入12% TCA溶液1mL，再于37℃反应30min，使反应终止4）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
2.空白1）试管中加入已预热底物溶液1mL，再加入12% TCA溶液1mL，振荡混合后，于37℃反应60min2）加入试样TG酶溶液0.2mL，振荡混合后，于37℃反应30min3）20℃,3000rpm，20min离心后取上清备用。
四、Lowry法显色反应试管中分别加入试样清液和空白清液各0.2mL，加入A溶液1mL，振荡混合后室温下放置10min，然后加入试剂B 0.1mL，振荡混合后，于37℃反，空白的吸应30min。
蛋白酶活力测定方法
酸性蛋白酶产品概述:蛋白质由氨基酸组成，是自然界中发现的最复杂的有机化合物之一。
由盐酸和蛋白酶分解成易被高等动物的肠道和微生物有机体的细胞膜吸收的氨基酸。
包括人类在内的每种动物，必须要有足够的蛋白质来维持自身生长，来生成每个细胞所必需的氨基酸，一些特种蛋白质还是某些特殊细胞、腺体分泌物、酶和激素的功能性组成元素。
蛋白酶是指一些有催化功能的酶，能够水解（断裂）蛋白质，因此也被称为蛋白水解酶。
蛋白水解酶在许多的生理和病理过程中发挥着重要作用，在食品和乳品加工业也有着广泛应用。
工作机理蛋白水解酶制剂本产品能在酸性条件下水解蛋白质食品中的缩氨酸键，释放氨基酸或者多肽。
在酒精、葡萄酒、果汁、啤酒、黄油和酱油生产中，添加酸性蛋白酶可澄清发酵液中的雾气。
酵母在发酵阶段的生长可以通过悬浮蛋白质转化的氨基酸来加以促进，从而加速发酵并提高产量。
本产品是一种酸性蛋白酶制剂，在酸性条件下具有较高活性，由酸性蛋白酶高产菌株——曲霉菌深层发酵而成。
它广泛应用于饲料、纺织、废水处理和果汁提纯方面。
酸性蛋白酶（Acid protease ）是指蛋白酶具有较低的最适pH，而不是指酸性基团存在于酶的活性部位，酸性蛋白酶的最适PH从2左右（胃蛋白酶）到4左右。
从酶的活力-PH曲线分析，在酶的活性部位中含有一个或更多的羟基。
这一类蛋白酶中研究最彻底的是胃蛋白酶。
（酸性蛋白酶537容易失活）简介：酸性蛋白酶是由隆科特黑曲霉优良菌种经发酵精制提炼而成，它能在低PH条件下，有效水解蛋白质，广泛应用于酒精、白酒、啤酒、酿造、食品加工、饲料添加、皮革加工等行业。
1、产品规格：，规格有5万u/g～10万u/g液体型为黑褐色液体，规格有50000u/ml～10000u/ml.2、酶活力定义：一个酶活力单位是1g酶粉或1ml酶液在40℃，PH3.0条件下，1分钟水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位（u/g或u/ml）特性1、温度范围为：最适温度范围为40℃-50℃2、PH为：最适PH范围为2.5～3.5使用方法1、白酒工业：本品用以淀粉为原料的生产酒精及白酒行业，提高出酒率0.25%个酒分，提高发酵速度。
蛋白酶活力的测定
蛋白酶活力的测定1范围本文件规定了酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定方法。
本文件适用于酱油和黄豆酱的菌种、种曲、成曲酶活力的测定。
2规范性引用文件下列文件中的内容通过文中的规范性引用而构成本文件必不可少的条款。
其中，注日期的引用文件，仅该日期对应的版本适用于本文件；不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本文件。
GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法3术语和定义3.1中性蛋白酶活力单位neutral protease active unit在温度为40℃、pH值为7.2的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个中性蛋白酶活力单位。
3.2酸性蛋白酶活力单位acidic protease active unit在温度为40℃、pH值为3.0的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个酸性蛋白酶活力单位。
3.3碱性蛋白酶活力单位alkaline protease active unit在温度为40℃、pH值为10.5的条件下，在1min内水解酪蛋白产生相当于1μg酪氨酸的酶量，定义为1个碱性蛋白酶活力单位。
4原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪蛋白底物产生含有酚基的氨基酸（如：酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，可将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝与钨蓝，其颜色的深浅与酚基氨基酸含量成正比。
采用分光光度计（波长660nm）测定其吸光度，进而计算蛋白酶活力。
5试剂和材料5.1试剂除非另有说明，本方法所用试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的三级水。
5.1.1钨酸钠（Na 2WO 4·2H 2O）。
5.1.2钼酸钠（Na 2MoO 4·2H 2O）。
5.1.3硫酸锂（Li 2SO 4）。
5.1.4溴（Br）。
5.1.5无水碳酸钠（Na 2CO 3）。
5.1.6三氯乙酸（CCl 3COOH）。
蛋白酶活力的测定
1 蛋白酶活力的测定1.1 原理采用福林-酚试剂法。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色(钼蓝和钨蓝混合物)，由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸(如酪氨酸、色氨酸等)，可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白筹沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比;酪氨酸含量用分光光度计在660nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
1.2 试剂1.2.l 福林-酚试剂向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4?2H2O)、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入150g的硫酸锂(LiSO4)、50mL去离子水及数滴溴水，再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色(如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤)，加去离子水定容至1000mL乱，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:3比例用去离子水稀释。
1.2.2 0.4mol/L三氯乙酸(TCA)溶液精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
1.2.3 0.4mo1/L碳酸钠溶液精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
1.2.4 pH值3～6醋酸缓冲液精确取NaAc?3H2O16g与268mL浓度为6mol/L醋酸溶液混合，用去离子水稀释定容至1000mL。
1.2.5 2%酪蛋白底物缓冲液1.2.5.1 测试酸性蛋白酶缓冲液精确称取酪蛋白20g，加入0.1mol/L氢氧化钠20mL(用去离子水配制)，在水浴中加热溶解，然后用pH值3.6醋酸缓冲液定容至1000mL。
蛋白酶活性测定方法
水产动物酶活性测定方法一、分析样品的采取与处理每箱随机各取 3 尾异育银鲫，称重,于冰盘上解剖，取出肠道和肝胰脏,测定肠道长度，剔除脂肪组织，用4C冷却的去离子水冲洗；然后用滤纸轻轻吸去水分，放入一26C冰箱中迅速冷却保存，供测酶活性用。
二、酶液的制备将肝胰脏及肠组织缓慢解冻后，肠道匀分三等份，从前、中、后肠分别取有代表性食靡0.5g，放入离心塑料管中，加4ml, 4C冷却去离子水稀释，4C下离心20min（13, OOOg）, 上清液标号分装，并与4C冰箱中冷却保存，24Hr待测。
将肝胰脏及肠道组织用4C去离子水清除肠道内容物后，用滤纸吸去表面水，取样各1.0g。
按样品重量加10倍的4C冷却去离子水在冰浴下匀浆（稀释匀浆液匀浆4min,800rpm 匀浆玻璃管外设冰浴）。
匀浆液在4C下离心20分钟（13, OOOg）,上清液标号分装，并于4C 冰箱冷却保存，24Hr 内测定完毕。
酶粉及饲料：取2 . 0克酶粉，先用10倍PH7.0缓冲液溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
测定前再稀释10倍，20倍，100倍即可。
取2.0克饲料，加PH7.0缓冲液20ml溶解，并放在40C水浴中恒温30分钟，过滤留置滤液待测。
三、酶活性测定1. 蛋白酶测定：前、中、后肠,肝胰脏。
方法：福林—酚试剂法1.1 原理：蛋白酶从变性的酪蛋白中分解出可溶于三氯乙酸（TCA ）的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸等） ,这些氨基酸可用福林试剂使之发色（蓝色反应）,用分光光度计测定。
1.2 蛋白酶活性单位：1克食靡或组织在30C, PH在7.0的条件下，每分钟水解酪蛋白产生1微克酪氨酸的酶量为 1 个酶活力单位。
1.3 试剂1. 福林试剂（已配）2. 0.4M 碳酸钠溶液：取无水碳酸钠（Na2CO3 ）42.4g 用水溶解和定容至1,000ml，存放与具胶塞的试剂瓶中。
3. 0.1M三氯醋酸（TCA ）:用小烧杯称取65.4g三氯醋酸，加水溶解后定容为1 , 000ml 。
蛋白酶测定方法
蛋白酶活性测定方法一蛋白酶活力单位定义1g 固体酶粉(或1mL液体酶)，在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1μg酪氨酸为一个活力单位，以u/g(u/mL)表示。
二测定原理蛋白酶在一定的温度与pH条件下，水解酪素底物，然后加人三氯乙酸终止酶反应，并使未水解的酪素沉淀除去，滤液对紫外光有吸收，可用紫外分光光度法测定。
根据吸光度计算其酶活力。
三应用范围本法适用于各种含有酸性蛋白酶的复合酶和液体酶及单酶的测定。
四测定条件4.1 底物：酪蛋白4.2 pH： 3.004.3 温度：40℃±0.5℃4.4 保温时间： 10min五仪器5.1 紫外分光光度计5.2 超级恒温水浴40±0.2℃5.3 秒表5.4 分析天平：感量0.0001g六试剂和溶液6.1.2 碳酸钠溶液c(Na2CO3)=0.4 mol/L称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。
6.1.3 三氯乙酸c(CCI3·COOH)=0.4 mol/L称取三氯乙酸65.4 g ，用水溶解并定容至1000 mL。
6.1.4 氢氧化钠溶液c(NaOH)=0.5mol/L按 GB 601配制。
6.1.5 盐酸溶液c(HCl)=1 mol/L及0.1 mol/L按 GB 601配制。
6.1.6 缓冲溶液a.磷酸缓冲液(pH=7.5)，适用于中性蛋白酶称取磷酸氢二钠(Na2HP04·12H20)6.02 g和磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H20)0.5 g，加水溶解并定容至1000 mL。
b.乳酸缓冲液(pH=3.0 ) 适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸(80%～90%)10.6 g，加水溶解并定容至1000 mL。
乙液称取乳酸钠(70%)16 g，加水溶解并定容至1000 mL。
使用溶液取甲液8 mL，加乙液1 mL,混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
蛋白酶活力测定方法
中华人民共和国专业标准蛋白酶活力测定法 SB/T 10317-1999Measurement of proteinase activity━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━本方法适用于酿造酱油时在制品菌种、成曲的蛋白酶活力测定。
1 福林法1.1 试剂及溶液: 以下试剂都为分析纯1.1.1 福林试剂(Folin试剂):于2000mL磨口回流装置内,加入钨酸钠(Na2WO4·2H2O) 100g,钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)25g,蒸馏水700mL,85%磷酸50mL,浓盐酸100mL,文火回流10h。
取去冷凝器,加入硫酸锂(Li2SO4)50g,蒸馏水50mL,混匀,加入几滴液体溴,再煮沸15min,以驱逐残溴及除去颜色,溶液应呈黄色而非绿色。
若溶液仍有绿色,需要再加几滴溴液,再煮沸除去之。
冷却后,定容至1000mL,用细菌漏斗(No4～5)过滤,置于棕色瓶中保存。
此溶液使用时加2倍蒸馏水稀释。
即成已稀释的福林试剂。
1.1.2 0.4mol碳酸钠溶液: 称取无水碳酸钠(Na2CO3)42.4g,定容至1000mL。
1.1.3 0.4mol三氯乙酸(T C A)溶液: 称取三氯乙酸(CCL3COOH)65.4g,定容至1000mL。
1.1.4 pH7.2磷酸盐缓冲液:称取磷酸二氢钠(NaH2PO4·2H2O)31.2g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(A液)。
称取磷酸氢二钠(Na2HPO4·12H2O)71.63g,定容至1000mL,即成0.2mol溶液(B液)。
取A 液28mL 和B 液72mL,再用蒸馏水稀释1倍,即成0.1mol pH7.2的磷酸盐缓冲液。
1.1.5 2%酪蛋白溶液:准确称取干酪素2g,称准至0.002g,加入0.1N氢氧化钠10mL,在水浴中加热使溶解(必要时用小火加热煮沸),然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
蛋白酶酶活的测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
蛋白酶酶活力的测定
五、心得体会
一、在本实验中的对照组是为了证明在酸性条件下，胰蛋白酶无法催化酪蛋白水解；空白对照是要排除蒸馏水能与Folin试剂产生蓝色这种可能的存在。
二、稀释的酶溶液不能长期使用。因为酶的活性并不能长期保持，放置时间过长会导致酶活性丧失而引起较大实验误差，甚至无法完成实验。
六、参考文献
实验报告
课程名称：食品化学与分析实验指导老师：_冯凤琴_____成绩：__________________
实验名称：蛋白酶酶活力的测定实验类型：定量实验
一、实验目的二、实验原理三、材料、仪器与试剂
四、实验步骤五、结果及分析六、讨论七、参考文献
一、实验目的
1、了解蛋白酶的作用机理和作用条件。
2、掌握测定酶活力的方法及其原理。
三、材料、仪器与试剂
（一）材料：木瓜蛋白酶、酪蛋白、酪氨酸
（二）仪器：可见-紫外分光光度计、水浴锅、天平、具塞刻度试管(10、15ml)、试管架，容量瓶(100、500ml、1000mL)、移液管(1、10ml)、烧杯(25ml)、玻璃棒。
（三）试剂：
1、0.5mol/LNaOH溶液：取4gNaOH固体，溶解后，定容在100mL蒸馏水中
四、实验步骤
（一）酪氨酸标准曲线制作
1、取6只干燥、洁净的试管，编号为1~6。
2、按照下表所示配方，分别用移液管向各试管中加入相应物质，震荡混匀。
3、在40℃水浴中显色20分钟，于680nm波长处进行比色，以1号试管为空白组，测各组溶液的吸光值并进行记录。
试管编号
1
2
3
4
5
6
200μg /mL标准酪氨酸溶液(mL)
1、《食品化学》作者冯凤琴，陆柏益等出版社：浙江大学出版社
蛋白酶活性的测定方法
蛋白酶活性的测定方法(GB/T23527-2009)1 原理蛋白酶对酪蛋白、乳清蛋白、谷物蛋白等都有很好的水解作用。
磷钨酸和磷钼酸混合试剂，即福林-酚试剂，碱性条件下极不稳定，易被酚类化合物还原而呈蓝色反应（钨兰和钨兰混合物）。
由于蛋白质中含有具有酚基的氨基酸（酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸），因此，蛋白质及其水解产物也呈此反应。
利用蛋白酶分解酪素（底物）生成含酚基氨基酸的呈色反应，来间接测定蛋白酶的活力。
2 仪器和设备2.1 分析天平：精度0.0001g2.2 恒温水浴：精度±0.2℃2.3 计时表2.4 分光光度计2.5 沸水浴器2.6 振荡混合器2.7 pH计: 精度0.01pH单位3 试剂和溶液3.1 乳酸缓冲液（pH=3.0）适用于酸性蛋白酶甲液：称取乳酸（80%-90%）10.6g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取乳酸钠（70%）16g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液8ml,加乙液1ml,摇匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲溶液。
3.2 磷酸缓冲液的制备（pH=7.5）适用于中性蛋白酶准确称取磷酸氢二钠（Na2HPO3.12H2O）6.02和磷酸二氢钠（NaH2PO3.2H2O）0.5g,加水定容至1000ml3.3 硼酸缓冲液(pH=10.5) 适用于碱性蛋白酶甲液：称取硼酸钠19.08g,加水溶解并定容至1000ml。
乙液：称取氢氧化钠4.0g,加水溶解并定容至1000ml.使用溶液：取甲液500ml,加乙液400ml,摇匀，用水稀释至1L。
3.4 0.4mol/L碳酸钠溶液：准确称取无水碳酸钠42.4g,以蒸馏水溶解定溶至1000ml.3.5 0.4mol/L的三氯醋酸液：准确称取65.4三氯醋酸,以蒸馏水溶解定溶至1000ml3.6 0.5mol/L的NaOH：准确称取2g NaOH溶解并定至100ml3.7 10.00mg/ml酪素溶液称取酪素1.000g,准确至0.001g,用少量的0.5mol/L的氢氧化钠溶液(若为酸性蛋白酶则用浓乳酸2-3滴)润湿,,加入适量的各适宜的缓冲液约80ml,在沸水浴中边加热边搅拌,直至完全溶解,冷却后,转入100ml容量瓶中,用适宜的缓冲液稀释至刻度,此溶液在冰箱内贮存,有效期为三天.3.8 100μg/ml酪氨酸标准溶液3.8.1 准确称取预先于105℃干燥至恒重的L-酪氨酸0.1000g ,用1mol/L 的盐酸60ml 溶解后定容至100ml,即为1.00mg/ml的酪氨酸溶液.3.8.2 吸取1.00mg/ml酪氨酸标准溶液10.00ml,用0.1mol/L盐酸定容至100ml,即得100.0μg/ml L-酪氨酸标准溶液.3.9 酶样的制备准确称取1.000g固体酶或移取1ml液体酶样，用少量的适宜缓冲液溶解并用玻璃棒捣研,然后将上清液倒入100ml容量瓶,沉渣中再添入少量缓冲液捣研多次,最后全部移入容量瓶,稀释到刻度,用四层纱布过滤。
蛋白酶活力的测定
实验:蛋白酶的活力测定一、实验目的1、学习蛋白酶活力的测定方法。
2、深入了解酶的活力和比活力的概念。
二、实验原理1、酶活力的大小，是以该酶在适宜的温度和pH下，酶催化一定时间后，反应底物的减少量或者反应产物的增加量来表示。
2、本实验蛋白酶的活力大小是以分解出的酪氨酸的量来表示，其单位为：每分钟内分解出1微克酪氨酸的酶量称为1单位。
3、本实验采用福林-酚与蛋白质水解出的酪氨酸生成兰色物，从兰色的深浅程度可以求知酪氨酸的多少，从而确定酶活力的大小。
4、在测酶活力前，先用福林-酚与用已知的不同浓度的酪氨酸作用，作出兰色深浅程度（用光密度表示）与酪氨酸浓度关系的标准曲线。
5、将酶与底物反应产生的产物与福林-酚试剂作用后测光密度，从标准曲线上查出相当于多少微克的酪氨酸，就可以计算出酶的单位了。
三、实验材料、仪器和试剂1.实验材料1398中性蛋白酶粗酶粉（上海新型发酵厂）、滤纸2.仪器（1）试管（1.5*15cm*24) (2)移液管（3）电热恒温水浴（4）721型分光光度计3.试剂（1）福林-酚试剂B（2）标准酪氨酸溶液称取50毫克酪氨酸（预先在105摄氏度烘至恒重），加0.2MHCL溶液后定容至100ml，在加水稀释5倍得到100微克/毫升的酪氨酸溶液。
（3）酪蛋白溶液称取酪蛋白2克，置150ml三角烧瓶中，加入0.2M磷酸氢二钠61ml，在水浴上搅拌使溶解，再加入39ml0.2M磷酸二氢钠，得到pH7的酪蛋白液，倾出上清液备用。
（4）0.4M三氯醋酸溶液（TCA）（5）0.4M碳酸钠溶液四、操作步骤1、酪氨酸标准曲线制作：按下列次序加入试剂，混合均匀，保温，然后在分光光度计上进行比色，测出650nm处的光密度值。
以酪氨酸浓度为横坐标，光密度值为纵坐标，作出标准曲线。
管号 1 2 3 4 5 62、蛋白酶活力测定 （1）浸出酶液称取0.5克酶粉加入40ml 水，在室温下放置1小时并时加搅动。
将酶浸出液过滤，取滤液1ml 用水稀释至20ml ，即为稀释1600倍的酶液。
酶活性检测
④分光光度法利用底物和产物光吸收性质的不同，可直接测定反应混合物中底物的减少量或产物的增加量。
几乎所有的氧化还原酶都使用该法测定。
如还原型辅酶Ⅰ(NADH2)和辅酶Ⅱ(NADPH2)在340nm有吸收，而NAD和NADP在该波长下无吸收，脱氢酶类可用该法测定。
该法测定迅速简便，自动扫描分光光度计的使用对酶活力的快速准确的测定提供的极大的方便。
酶在食品加工中的作用就像一把双刃剑，我们要趋利避害。
酶的积极作用我们要加强，在食品加工过程中添加酶制剂，使其作用充分发挥;消极作用我们要尽量避免，可以通过加热等方法将酶灭活，消除其不利影响。
为了将酶更好地应用于食品加工，研究酶的性质是十分必要的。
而紫外-可见分光光度法是研究酶性质的重要方法之一。
下面我们来介绍用-可见分光光度计测定酶活的具体方法。
紫外-可见分光光度法测定酶活：1. β一半乳糖苷酶β一半乳糖苷酶，又称乳糖酶(Lactase)。
能水解乳糖来降低乳制品的乳糖含量，从而提高乳制品的可消化性，用于低乳糖牛奶和非结晶型浓缩牛奶的生产及奶酪风味的改变，同时还可用于生产低聚半乳糖。
【酶活测定】以ONPG为底物测定β-半乳糖苷酶活力。
【酶活定义】以ONPG为底物，37℃保温酶解，每分钟释放lμmol/L邻硝基酚的酶量，定义为1个酶活力单位。
2. 超氧化物歧化酶超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，简称SOD)是一种十分重要的生物体防止氧化损伤的酶类，是生物体内超氧阴离子清除剂，保护细胞免受损伤。
SOD广泛存在于各类生物体内，所有好氧微生物细胞中都含有SOD。
自1969年Mccord等人首次发现了SOD 生物活性后，医学界对其医疗作用做了许多研究，证明它具有抗衰老、抗肿瘤、抗辐射、抗缺血、提高人体免疫力等作用，被专家称为21世纪最有前途的药用酶。
欧美国家已开始将其应用于医疗、食品、保健、化妆品等领域。
【酶活测定】在25℃4.5ml 50mmol/L pH8.3的K2HPO4- KH2PO4缓冲液中加入待测SOD样液，再加入10ul 50mmol/L的连苯三酚，迅速摇匀，倒人光径lcm 的比色杯，在325nm波长下每隔30s测一次A值。
蛋白酶活性测定
华南农业大学综合实验报告实验项目名称：酶活力测定实验项目性质：综合实验计划学时：所属课程名称：食物与发酵工业分析实验完成时间：2013.05.10糖化酶活力测定（直接滴定法）一、原理采用可溶性淀粉为底物，在必然的pH值与温度下，使之水解为葡萄糖 (还原糖)，以直接滴定法测定。
二、试剂及仪器（1）碱性酒石酸铜钾溶液（使历时等体积混合甲、乙溶液）：甲液：称取15.693g硫酸铜(Cu2SO4·5H2O)，0.05g次甲基蓝，用水溶解并稀释定容至1000mL；乙液：称取50g酒石酸钠钾，54g氢氧化钠，4g亚铁氰化钾，用水溶解并稀释定容至1000mL（2） 0.1%标准葡萄糖溶液：准确称取1g无水葡萄糖（预先在100-1050C 烘干），用水溶解，加5mL浓盐酸，用水定容至1000mL。
（3） pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲溶液：0.2mol/L乙酸溶液：量取11.8mL冰乙酸，用水稀释至1000mL；0.2mol/L 乙酸钠溶液：称取27.2g乙酸钠（CH3COONa·3H2O），用水定容至1000mL；pH4.6乙酸-乙酸钠缓冲液：取0.2mol/L的乙酸溶液和0.2mol/L的乙酸钠溶液等体积混合。
（4） 0.1mol/L氢氧化钠溶液：称取4g氢氧化钠，用水溶解并定容至1000mL。
（5） 2%可溶性淀粉溶液：准确称取2g可溶性淀粉（预先于10-105 0C烘干），加少量水调匀，倾入80mL滚水中，继续煮沸至透明，冷却后用水定容至100mL。
（6）固体曲（7）滴定管、电子天平、烧杯、恒温水浴锅、脱脂棉、容量瓶、移液管、三角瓶3、测定步骤（1） 5%固体曲浸出液制备：称取5.0g固体曲（以绝干曲计），置于250mL 烧杯中，加90mL水和10mL pH4.6乙酸－乙酸钠缓冲溶液，搅匀，于30℃水浴中保温浸1小时，每隔15min搅拌一次。
用脱脂棉过滤，滤液为5％固体曲浸出液。
（2）固体曲糖化液的制备：吸取25mL 2％可溶性淀粉溶液，置于50mL容量瓶中，于30℃水浴预热10min。
蛋白酶活性的测定
实验四蛋白酶活力得测定一、实验目得1、了解蛋白酶活力测定得原理;2、掌握蛋白酶活力测定得方法。
二、实验原理蛋白酶在一定条件下不仅能够水解蛋白质中得肽键,也能够水解酰胺键与酯键,因此可用蛋白质或人工合成得酰胺及酯类化合物作为底物来测定蛋白酶得活力、本实验选用酪蛋白为底物,测定微生物蛋白酶水解肽键得活力。
酪蛋白经蛋白酶作用后,降解成相对分子质量较小得肽与氨基酸,在反应混合物中加入三氯醋酸溶液,相对分子质量较大得蛋白质与肽就沉淀下来,相对分子质量较小得肽与氨基酸仍留在溶液中,溶解于三氯醋酸溶液中得肽得数量正比于酶得数量与反应时间。
在２８0ｎm波长下测定溶液吸光度得增加,就可计算酶得活力。
三、实验试剂①微生物蛋白酶萃取液(0、01g/ml):称取１。
0ｇ酶制剂,加１00ｍl蒸馏水搅拌30min,在4℃下离心分离后,将上层清夜置于冰箱中保存,使用前稀释一定倍数;② 0。
０2mol/L磷酸盐缓冲液(ｐH7.5);③ 1％酪蛋白溶液:取1、0g酪蛋白,加10０ml 0。
2mｏl/L磷酸盐缓冲液(PＨ7。
５),加热并搅拌使它完全分散,然后置于冰箱中保存;④ 5%三氯醋酸(TCA)溶液。
四、实验步骤1、将5％TCA溶液与1％酪蛋白溶液在37℃下保温。
２、取四支1５ml具塞试管,分别标上记号A1、Ａ０、Ｂ1与B０、在A１与A ０试管中各吸入0、20ml酶液,在Ｂ１与B0试管中各吸入0.４0ml酶液,分别用0.2mｏl/L磷酸盐缓冲液定容至２、00ml。
在A0与B0试管中各吸入6.00ml5%三氯醋酸溶液,上述四支试管都置于37℃水浴中保温、3、在各试管中吸入2。
00mｌ1％酪蛋白溶液,在３7℃下保温10ｍin(准确计时)后,再向A1与Ｂ1试管中吸入6。
00ml５％三氯醋酸溶液。
4、将试管从水浴中取出,在室温下放置1h,用少量上清液润湿滤纸后过滤,保留滤出液。
5、在2８０ｎｍ波长下,分别以A0与B0滤液为空白,测定A1与B１滤液得吸光度。
实验二十一(10) 蛋白酶活力的测定
实验目的
掌握测定蛋白酶活力的原理和方法
学习酶活力的计算方法
蛋白酶概述
内肽酶 外肽酶 二肽酶
氨肽酶 羧肽酶
蛋 白 酶
中性蛋白酶
枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）发酵产生
焙烤行业； 啤酒工业； 医药工业； 纺织工业； 皮革工业； 饲料工业；
2. 酶液的制备（已制备）
3. 活力测定 3.1 将2%酪蛋白溶液放入40℃恒温水浴，5 min； 3.2 按照下表操作，进行酶催化反应；
0
待测酶液 0.4 M 三氯乙酸 2% 酪蛋白溶液 0.4 M 三氯乙酸 1 mL 2 mL 1 mL ——
1
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
2
1 mL —— —— 1 mL 2 mL
40℃恒温水浴锅保温，20 min 测定680 nm处吸光值 酶活力单位定义： 40℃，最适pH条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的 酶量为1U。 计算公式
4 酶活力= 10 ×K× n×A680
思考题
该方法测定蛋白酶活力的误差来源主要有哪些
5. 1.398中性蛋白酶 (neutral protease) 6. 2% 酪蛋白溶液（casein solution） 7. 标准酪氨酸溶液（100 μg mL-1）
仪器
分光光度计
试管
烧杯 移液管
恒温水浴锅
离心机 漏斗
实验步骤
1. 标准曲线 （已完成） 参考标曲，求出K值,K=94. n=20 000
1.398中性蛋白酶
分子量约43kD
最适pH 7. 2- 7. 4,
蛋白酶酶活测定方法(福林法)
蛋白酶酶活的测定方法（福林法）1. 酶单位定义: 1g固体酶粉（或1mL液体酶），在一定温度和pH值条件下，1min水解酪素产生1ug酪氨酸为一个酶活力单位，以u /g（u/mL）表示。
2.原理蛋白酶在一定温度和pH值条件下，水解酪素底物，产生含有酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），在碱性条件下，将福林试剂（Folin）还原，生成钼蓝和钨蓝，用分光光度法测定，计算其酶活力。
3.试剂和溶液3.1福林试剂的准备于2000mL磨口回流装置中加入钨酸钠（Na2WO4.2H2O）100g，钼酸钠（Na2MoO4.2H2O）25g，水700mL、85%磷酸50mL、浓盐酸100mL，小火沸腾回流10h，取下回流冷却器，在通风橱中加入硫酸锂（LiSO4）50g，水50mL和数滴浓溴水（99%），再微沸15min，以除去多余的溴（冷却后仍有绿色需要再加入溴水，再煮沸除去过量的溴），冷却，加水定容至1000mL，混匀，过滤。
制得得试剂应呈金黄色，贮存于棕色瓶内。
使用溶液：一份福林试剂与二份水混合，摇匀。
3.2碳酸钠溶液c（Na2CO3）=0.4mol/L称取无水碳酸钠（Na2CO3）42.4g，加水溶解并定容至1000mL。
3.3三氯乙酸c（CCl3.COOH）=0.4mol/L称取三氯乙酸65.4g,加水溶解并定容至1000mL。
3.4 氢氧化钠溶液c（NaOH）=0.5mol/L按GB601配制。
3.5 盐酸溶液c（HCl）=1mol/L及0.1 mol/L按GB601配制。
3.6 缓冲溶液a．磷酸缓冲液（pH=7.5），适用于中性蛋白酶。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4.12H2O）6.02g和磷酸二氢钠（NaH2PO4. 2H2O）0.5g，加水溶解并定容至1000mL。
b．乳酸缓冲液（pH=3.0），适用于酸性蛋白酶甲液称取乳酸（80%~90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
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end
【实验结果】
光密度
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
酪氨酸标准曲线
y = 0.0011x R2 = 0.9999
100 200 300 400 500 600 700 酪氨酸含量
一、原理
一、酶活力的定义
酶活力是指酶催化某些化学反应的能力
二、酶活力和酶促反应速度的关系
三、测定方法
1、标准曲线的绘制
取6支10mL具塞比色管，编号，按下表将酪氨酸溶液稀释， 配制酪氨酸系列标准溶液：
试管 编号
酪氨酸溶液（100μg 稀释后的酪氨酸
蒸馏水
/mL） mL
标准溶液浓度（ug/ml） ( ml )
1
0
2
2
3
4
4
6
5
8
6
10
0
10
20
8
40
6
60
4
80
2
100
0
于上述各管中各吸取1mL于10mL比色管中，分别加入 5mL0.4mol/mL碳酸钠溶液、1mL Folin试剂使用液。摇匀，40毒 水浴显色20min后，680mn测定吸光度。以吸光度值和酪氨酸浓度 绘制标准曲线。
3、样品测定
第一步
操作步骤
样品管号 123
加预热酶液/ mL
加预热2%酪蛋白溶液/ mL
1.0
保温显色/min
10
加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/mL
2.00
保温/min
20
空白管号
操作步骤
1 23
加预热酶液/ mL
1.00
加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/ mL 2.00
保温显色/min
10
加预热2%酪蛋白溶液/mL
第十章 蛋白酶活力测定
概述
蛋白酶定义
水解蛋白质肽链酶类的总称，适宜PH和温度下水解 蛋白为肽段和氨基酸。
蛋白酶分类
碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 酸性蛋白酶（内肽酶）
蛋白酶 氨基肽酶
分类 金属蛋白酶
菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 组织蛋白酶C 胰凝乳蛋白酶 胶原酶 dispase 内肽酶Arg-C 内肽酶Asp-N 内肽酶Glu-C 内肽酶Lys-C 肠激酶 Xa因子 无花果蛋白酶 激肽释放酶 木瓜蛋白酶 胃蛋白酶 纤溶酶 链霉蛋白酶 蛋白酶K 枯草杆菌蛋白酶 热溶素 凝血酶
胰蛋白酶
丝氨酸蛋白酶
作用位点 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、·D或·Q组成 的肽键 无特异性 带有自由氨基酸的L—氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸 K，R羧基端 氨基酸羧基端 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F，T或Y之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R之后 在D和半胱氨酸之前 在E或D之后 在K之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R之后 无特异性 在一些R之后 长期孵育时具有广泛特异性 广泛特异性 在K或R之后 无特异性 广泛特异性 无特异性 在非极性残基之前 在K之后
1.00
第二步
操作步骤
加对应的离心上清液/ mL c（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液/ mL 加Folin试剂使用液/ mL
保温显色/min 吸光度值 平均吸光度值
样品管号 1’ 2’ 3’
1.0 5.00 1.00 20
空白管号 1’ 2’ 3’
1.0 5.00 1.00 20
酶活力的大小可以用在一定条件下它 所催化的某一化学反应的速度来表示 测定酶活力就是测定酶促反应的速度
【实验原理】
三、酶促反应速度的测定方法及条件
通常用单位时间内
产物的生成量表示 酶
促
酶促反应的速度。
反 应
速
必须测定酶促反应
度 （
v
的初速度。
）
时间（t）
在K或R之后
已知抑制物 2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉
α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 EDTA，EGTA EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 醋酸碘， 甲醛 抑肽酶，PMSF，TPCK，α—巨球蛋白 EDTA，EGTA，还原剂，但无血清存在 EDTA，EGTA，Hg2+，重金属 α巨球蛋白，TLCK EDTA，α菲咯啉 α巨球蛋白，TLCK TLCK，抑肽酶，抑蛋白酶醛肽
以空白为对照，680mn测定吸光度值，求平均值。
从标准曲线上找到酪氨酸的质量A，ug；
OD
y=kx
测得的OD值
A=？ 酪氨酸质量，ug
四、计算
A
1
样品蛋白酶活力单位(以干基计)=
×4×n×
10
（1-w）
式中 A——标准曲线上查的酪氨酸质量，ug； 4——4mL反应液取出1mL测定； N——酶液稀释倍数； W——样品中水分，%。
福林试剂（Folin）：钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂）金黄色溶液
二、仪器与试剂
1、仪器
电子天平、紫外分光光度计、电热恒温水浴锅
2、试剂
（1）福林试剂 贮存液和使用液 （2）2%酪蛋白溶液 （3）pH7.2磷酸缓冲溶液 （4）100ug/mL标准酪氨酸溶液 （5）0.4mol/L碳酸钠溶液 （6）0.4mol/L三氯乙酸溶液 （7）c（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液 （8）c（Hcl）=1mol/mL Hcl 溶液
以光密度OD为纵坐标，酪氨酸含量（μg） 为横坐标，绘制标准曲线。
光密度
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
酪氨酸标准曲线
y = 0.0011x R 2 = 0.9999
100
200
300
400
500
600
700
酪氨酸含量ug
2、待测酶液的制备（称取、溶解、稀释）
称取0.1g酶粉，用pH7.2磷酸缓冲溶液溶解并 定容至100mL，吸取5mL，再用pH7.2磷酸缓 冲溶液稀释定容至250mL，即稀释500倍待测。
巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 琉基蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 金属蛋白酶 金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 琉基蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 巯基蛋白酶 酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 混合型 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶
注意
严格按顺序加入试剂。 先加NaCO3，再加Follin试剂，后者只有 在碱性条件下才能被还原成兰色物质。
说明：酪蛋白在低温下有少量降解为酪氨酸， 此操作是与测定样品的条件保持一致， 消除系统误差。
注意：滤纸不能润湿。
校正： 用紫外分光光度计，以蒸馏水作对照， 在680nm处测定光密度。用1-6号管的光 密度值减去0号管的光密度值。
PMSF，APMSF，大豆胰蛋白酶抑制物 TPCK，TLCK，α-巨球蛋白 抑肽酶，抑蛋白酶醛肽 TPCK，TLCK，抑蛋白酶醛肽α—巨球蛋白，烷化剂 胃蛋白酶抑制素 PMSF，TLCK，抑肽酶，α—巨球蛋白 B．M．完整药片 PMSF，PefablocSc PMSF，α巨球蛋白，苯甲脒 EDTA TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽 抑肽酶，α巨球蛋白，苯甲脒 TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽 抑肽酶，α巨球蛋白
应用
发酵：发酵酒精时，蛋白水解充分。 皮革脱毛和软化 丝绸脱胶 医药生产
要求
掌握测定蛋白酶活力的原理 理解制备标准曲线的目的和意义 学习制备标准曲线的基本操作
一、原 理
蛋白酶
酪蛋白 PH=10，40℃酪氨酸
Folin
钼蓝和钨蓝（蓝色）
680nm
OD
酶活力单位： 1mL液体或1g固体酶粉在一定温度、PH下，每分钟水解 酪蛋白产生1ug酪氨酸，为一个酶活力单位。