10蛋白酶活力的测定

end
【实验结果】
光密度
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
酪氨酸标准曲线
y = 0.0011x R2 = 0.9999
100 200 300 400 500 600 700 酪氨酸含量
一、原理
一、酶活力的定义
酶活力是指酶催化某些化学反应的能力
二、酶活力和酶促反应速度的关系
三、测定方法
1、标准曲线的绘制
取6支10mL具塞比色管，编号，按下表将酪氨酸溶液稀释， 配制酪氨酸系列标准溶液：
试管 编号
酪氨酸溶液（100μg 稀释后的酪氨酸
蒸馏水
/mL） mL
标准溶液浓度（ug/ml） ( ml )
1
0
2
2
3
4
4
6
5
8
6
10
0
10
20
8
40
6
60
4
80
2
100
0
于上述各管中各吸取1mL于10mL比色管中，分别加入 5mL0.4mol/mL碳酸钠溶液、1mL Folin试剂使用液。摇匀，40毒 水浴显色20min后，680mn测定吸光度。以吸光度值和酪氨酸浓度 绘制标准曲线。
3、样品测定
第一步
操作步骤
样品管号 123
加预热酶液/ mL
加预热2%酪蛋白溶液/ mL
1.0
保温显色/min
10
加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/mL
2.00
保温/min
20
空白管号
操作步骤
1 23
加预热酶液/ mL
1.00
加0.4mol/mL三氯乙酸溶液/ mL 2.00
保温显色/min
10
加预热2%酪蛋白溶液/mL
第十章 蛋白酶活力测定
概述
蛋白酶定义
水解蛋白质肽链酶类的总称，适宜PH和温度下水解 蛋白为肽段和氨基酸。
蛋白酶分类
碱性蛋白酶、中性蛋白酶、 酸性蛋白酶（内肽酶）
蛋白酶 氨基肽酶
分类 金属蛋白酶
菠萝蛋白酶 羧肽酶A 羧肽酶B 羧肽酶Y 组织蛋白酶C 胰凝乳蛋白酶 胶原酶 dispase 内肽酶Arg-C 内肽酶Asp-N 内肽酶Glu-C 内肽酶Lys-C 肠激酶 Xa因子 无花果蛋白酶 激肽释放酶 木瓜蛋白酶 胃蛋白酶 纤溶酶 链霉蛋白酶 蛋白酶K 枯草杆菌蛋白酶 热溶素 凝血酶
胰蛋白酶
丝氨酸蛋白酶
作用位点 带有自由氨基的L-氨基酸氨基末端；不能分解由X-Pro、·D或·Q组成 的肽键 无特异性 带有自由氨基酸的L—氨基酸羧基端；不能分解R、P或羟脯氨酸 K，R羧基端 氨基酸羧基端 氨基端双肽，可通过K，R或P氨基端作为第二或第三个氨基酸封闭 在F，T或Y之后 在P-X-G-P肽链中X之后 无特异性 在R之后 在D和半胱氨酸之前 在E或D之后 在K之后 在D-D-D-D-K-肽链中K之后 在R之后 无特异性 在一些R之后 长期孵育时具有广泛特异性 广泛特异性 在K或R之后 无特异性 广泛特异性 无特异性 在非极性残基之前 在K之后
1.00
第二步
操作步骤
加对应的离心上清液/ mL c（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液/ mL 加Folin试剂使用液/ mL
保温显色/min 吸光度值 平均吸光度值
样品管号 1’ 2’ 3’
1.0 5.00 1.00 20
空白管号 1’ 2’ 3’
1.0 5.00 1.00 20
酶活力的大小可以用在一定条件下它 所催化的某一化学反应的速度来表示 测定酶活力就是测定酶促反应的速度
【实验原理】
三、酶促反应速度的测定方法及条件
通常用单位时间内
产物的生成量表示 酶
促
酶促反应的速度。
反 应
速
必须测定酶促反应
度 （
v
的初速度。
）
时间（t）
在K或R之后
已知抑制物 2，2，双吡啶，1．1()-菲咯啉
α2巨球蛋白，TPCK，TLCK，烷化 EDTA，EGTA EDTA，EGTA，碱性氨基酸 PMSF 醋酸碘， 甲醛 抑肽酶，PMSF，TPCK，α—巨球蛋白 EDTA，EGTA，还原剂，但无血清存在 EDTA，EGTA，Hg2+，重金属 α巨球蛋白，TLCK EDTA，α菲咯啉 α巨球蛋白，TLCK TLCK，抑肽酶，抑蛋白酶醛肽
以空白为对照，680mn测定吸光度值，求平均值。
从标准曲线上找到酪氨酸的质量A，ug；
OD
y=kx
测得的OD值
A=？ 酪氨酸质量，ug
四、计算
A
1
样品蛋白酶活力单位(以干基计)=
×4×n×
10
（1-w）
式中 A——标准曲线上查的酪氨酸质量，ug； 4——4mL反应液取出1mL测定； N——酶液稀释倍数； W——样品中水分，%。
福林试剂（Folin）：钨酸钠、钼酸钠、硫酸锂）金黄色溶液
二、仪器与试剂
1、仪器
电子天平、紫外分光光度计、电热恒温水浴锅
2、试剂
（1）福林试剂 贮存液和使用液 （2）2%酪蛋白溶液 （3）pH7.2磷酸缓冲溶液 （4）100ug/mL标准酪氨酸溶液 （5）0.4mol/L碳酸钠溶液 （6）0.4mol/L三氯乙酸溶液 （7）c（1/2 Na2CO3）=0.8mol/L Na2CO3溶液 （8）c（Hcl）=1mol/mL Hcl 溶液
以光密度OD为纵坐标，酪氨酸含量（μg） 为横坐标，绘制标准曲线。
光密度
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
酪氨酸标准曲线
y = 0.0011x R 2 = 0.9999
100
200
300
400
500
600
700
酪氨酸含量ug
2、待测酶液的制备（称取、溶解、稀释）
称取0.1g酶粉，用pH7.2磷酸缓冲溶液溶解并 定容至100mL，吸取5mL，再用pH7.2磷酸缓 冲溶液稀释定容至250mL，即稀释500倍待测。
巯基蛋白酶 锌金属蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸羧肽酶 琉基蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 金属蛋白酶 金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 琉基蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 巯基蛋白酶 酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 混合型 丝氨酸蛋白酶 丝氨酸蛋白酶 锌金属蛋白酶 丝氨酸蛋白酶
注意
严格按顺序加入试剂。 先加NaCO3，再加Follin试剂，后者只有 在碱性条件下才能被还原成兰色物质。
说明：酪蛋白在低温下有少量降解为酪氨酸， 此操作是与测定样品的条件保持一致， 消除系统误差。
注意：滤纸不能润湿。
校正： 用紫外分光光度计，以蒸馏水作对照， 在680nm处测定光密度。用1-6号管的光 密度值减去0号管的光密度值。
PMSF，APMSF，大豆胰蛋白酶抑制物 TPCK，TLCK，α-巨球蛋白 抑肽酶，抑蛋白酶醛肽 TPCK，TLCK，抑蛋白酶醛肽α—巨球蛋白，烷化剂 胃蛋白酶抑制素 PMSF，TLCK，抑肽酶，α—巨球蛋白 B．M．完整药片 PMSF，PefablocSc PMSF，α巨球蛋白，苯甲脒 EDTA TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽 抑肽酶，α巨球蛋白，苯甲脒 TLCK，PMSF，抑蛋白酶醛肽 抑肽酶，α巨球蛋白
应用
发酵：发酵酒精时，蛋白水解充分。 皮革脱毛和软化 丝绸脱胶 医药生产
要求
掌握测定蛋白酶活力的原理 理解制备标准曲线的目的和意义 学习制备标准曲线的基本操作
一、原 理
蛋白酶
酪蛋白 PH=10，40℃酪氨酸
Folin
钼蓝和钨蓝（蓝色）
680nm
OD
酶活力单位： 1mL液体或1g固体酶粉在一定温度、PH下，每分钟水解 酪蛋白产生1ug酪氨酸，为一个酶活力单位。