{5S6S现场管理}实验一16SrRNA基因的PCR扩增电泳及系统发育分析
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72℃ ；1min30s 72℃ ；10min
72℃ (10min)
琼脂糖凝胶电泳：
(1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需 浓度的胶；10×TAE 缓冲液配制：0.4M Tris-乙酸；0.02M EDTA，pH8.0 (2) 置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解； (3) 按照每20ml胶加入1µl Goldview/20ml； (4) 凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡， 室温放置，至胶凝固； (5) 小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE 缓冲液的水平电泳槽 中； (6) 样品中加入1/5 体积的6×loading buffer，混匀，用移液器小 心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm) 电泳；6×加样指示剂 配方:0.25% 溴酚蓝;40%(W/V) 蔗糖水溶液； (7) 取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离 子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正
种类：
普通DNA RNA
水平
琼脂糖
垂直
聚丙烯酰胺
小分子量 核酸
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。 加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。
琼脂糖
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力
实验内容
♣16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 ♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
16S rRNA基因的PCR扩增、电泳 及系统发育分析 窦桂铭
实验目的
1. 掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 2. 掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题
Ribosomal RNA Sequences 核糖体RNA序列与进化
小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）
（1）具有重要且恒定的生理功能； （2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当
的保守性； （3）分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%) （4）高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不
研究奠定基础。
PCR技术的反应原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链 反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
设想—实现—改进与完善
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术的反应原理
5´
DNA或RNA模板
DNA引物
5´
DNA聚合
5´
酶dNTPs
基因组DNA Taq酶
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
操作步骤
循环次数
1 30
1 1
反应条件
95℃（10min） 94℃；30s 58℃ ；1min
同的各类生物亲缘关系的研究。
16S rRNA的系统发育分析
1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC 61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACACGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG 121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG 181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGGAC 361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 421 CCTCTTTCAG CGGGGACGAA GCGCAAGTGA CGGTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAACT 481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA 541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT 601 GCTTTCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG 721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG 781 TAAACGTTGG GCGCTAGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT 841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC 901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT 961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGGAGAC TGCCGGGGTC 1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC 1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA 1261 AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT 1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC 1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC 1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA
16S rRNA的系统发育分析
MEGA 软件构建系统发育树
FASTA格式文件
找到刚才保存的文件
核酸
分子量的大 小
分子状态
物理
电压 缓冲液 温度
电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。 电泳染色剂：溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr)， 扁平染料， 嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。
DNA Marker
1.2kb 800bp
操作步骤
成分 水
10×GC Buffer dNTPs 16Sp1 16S p2
凝胶浓度
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
1,000～30,000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围: 0.2-50kb
DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素 的影响：
5´
退火 引
5´
5´
物5´
5´
5´
延伸
5´
5´
5´ 5´
5´ 5´
一个标准的PCR过程
核酸的时，它们就会以一定的速度移向适 当的电极。
这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。 迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分 子与支持介质的摩擦系数等。
Mg2+（缓冲液） 5´
待扩增DNA区域
5´
变性
94℃ 5 min
1
退火
3´
聚合
3´
5´
55℃
5´
70℃ 3´
3´
5´
循环25-30
次
①
2
目的基因
30个循环：230
5´
变性 加热
5´ 2
目标DNA片段达
5´
退火
5´
延伸
引物 底物
106-107
5´
2
5´
变性－退火－延伸
5´ 5´
变性 加热
5´ 4
5´
72℃ (10min)
琼脂糖凝胶电泳：
(1) 称取琼脂糖，用适当的电泳缓冲液(常用1×TAE)配成所需 浓度的胶；10×TAE 缓冲液配制：0.4M Tris-乙酸；0.02M EDTA，pH8.0 (2) 置微波炉中加热煮沸，直至琼脂糖完全溶解； (3) 按照每20ml胶加入1µl Goldview/20ml； (4) 凝胶溶液冷却至50℃左右，倒入电泳胶盘，避免出现气泡， 室温放置，至胶凝固； (5) 小心拔出梳子，将胶盘放到有1×TAE 缓冲液的水平电泳槽 中； (6) 样品中加入1/5 体积的6×loading buffer，混匀，用移液器小 心加到点样孔中，以稳定电压(4-5V/cm) 电泳；6×加样指示剂 配方:0.25% 溴酚蓝;40%(W/V) 蔗糖水溶液； (7) 取出凝胶，紫外灯下观察电泳结果，如有必要，拍照记录。
在生理条件下，核酸分子的糖-磷酸骨架中的磷酸基团是呈离 子化状态的——叫做多聚阴离子。方向：负→正
种类：
普通DNA RNA
水平
琼脂糖
垂直
聚丙烯酰胺
小分子量 核酸
二、琼脂糖凝胶电泳
琼脂糖：线性多糖聚合物、从红色海藻产物琼脂中提取而来。 加热→凝固：网孔状的电泳介质，密度由琼脂糖的浓度决定。
琼脂糖
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的能力
实验内容
♣16S rRNA基因的PCR扩增、电泳及系统发育分析 ♣染色体步移法克隆已知序列的侧翼序列 ♣ 大肠杆菌β-半乳糖苷酶的诱导表达 ♣ 利用SDS-PAGE分析融合蛋白的可溶性 ♣ 绿色糖单胞菌的发酵及孢外酶的提取
16S rRNA基因的PCR扩增、电泳 及系统发育分析 窦桂铭
实验目的
1. 掌握PCR的原理，增强对PCR重要性的认识； 2. 掌握电泳技术及系统发育分析的方法，为将来课题
Ribosomal RNA Sequences 核糖体RNA序列与进化
小核糖体亚单位RNA（16S rRNA，18S rRNA）
（1）具有重要且恒定的生理功能； （2）普遍存在于原核生物和真核生物中，而且在系统发育上具有适当
的保守性； （3）分子量大小适中，在细胞中含量大(约占细胞中RNA的90%) （4）高度保守、中度保守和高度变化的序列区域，适用于进化距离不
研究奠定基础。
PCR技术的反应原理
PCR（Polymerase Chain Reaction）法，又称为聚合酶链 反应或PCR扩增技术，是一种高效快速的体外DNA聚合程序
设想—实现—改进与完善
94℃
55℃
72℃
PCR循环
PCR技术的反应原理
5´
DNA或RNA模板
DNA引物
5´
DNA聚合
5´
酶dNTPs
基因组DNA Taq酶
贮液浓度 ——
Mg2+ Plus 2.5mmol 10pmol/μl 10pmol/μl 100μg/ml
5U/μl
使用量(20μl体系) 14μl 2μl 0.5μl 1 μl 1μl 1μl 0.5μl
操作步骤
循环次数
1 30
1 1
反应条件
95℃（10min） 94℃；30s 58℃ ；1min
同的各类生物亲缘关系的研究。
16S rRNA的系统发育分析
1 AGAGTTTGAT CCTGGCTCAG GACGAACGCT GGCGGCGTGC TTAACACATG CAAGTCGAGC 61 GGTAAGGCTC CTTCGGGAGT ACACGAGCGG CGAACGGGTG AGTAACACGT GAGTAATCTG 121 CCCTCCACTT TGGGATAAGC CTCGGAAACG AGGTCTAATA CCGAATACGA CCACTTCCTG 181 CATGGGATGG TGGTGGAAAG TTTTTTCGGT GGGGGATGTG CTCGCGGCCT ATCAGCTTGT 241 TGGTGGGGTA ATGGCCTACC AAGGCTTCGA CGGGTAGCCG GCCTGAGAGG GTGACCGGCC 301 ACACTGGGAC TGAGACACGG CCCAGACTCC TACGGGAGGC AGCAGTGGGG AATATTGGAC 361 AATGGGCGGA AGCCTGATCC AGCAACGCCG CGTGAGGGAT GACGGCCTTC GGGTTGTAAA 421 CCTCTTTCAG CGGGGACGAA GCGCAAGTGA CGGTACCCGC AGAAGAAGCA CCGGCCAACT 481 ACGTGCCAGC AGCCGCGGTA ATACGTAGGG TGCGAGCGTT GTCCGGAATT ATTGGGCGTA 541 AAGGGCTCGT AGGCGGTTTG TCGCGTCGGG AGTGAAAACA CCGGGCTTAA CTCGGTGCTT 601 GCTTTCGATA CGGGCAGACT AGAGGTATTC AGGGGAGAAC GGAATTCCTG GTGTAGCGGT 661 GAAATGCGCA GATATCAGGA GGAACACCGG TGGCGAAGGC GGTTCTCTGG GAATATCCTG 721 ACGCTGAGGA GCGAAAGTGT GGGGAGCGAA CAGGATTAGA TACCCTGGTA GTCCACACCG 781 TAAACGTTGG GCGCTAGGTG TGGGATCCAT TCCACGGGTT CCGTGCCGCA GCTAACGCAT 841 TAAGCGCCCC GCCTGGGGAG TACGGCCGCA AGGCTAAAAC TCAAAGGAAT TGACGGGGGC 901 CCGCACAAGC GGCGGAGCAT GCGGATTAAT TCGATGCAAC GCGAAGAACC TTACCTGGGT 961 TTGACATACA CCGGAAAGCT GCAGAGATGT AGCCCCTTTT AGTCGGTGTA CAGGTGGTGC 1021 ATGGCTGTCG TCAGCTCGTG TCGTGAGATG TTGGGTTAAG TCCCGCAACG AGCGCAACCC 1081 TCGTCCTATG TTGCCAGCAA GCCTTCGGGT GTTGGGGACT CATAGGAGAC TGCCGGGGTC 1141 AACTCGGAGG AAGGTGGGGA TGACGTCAAG TCATCATGCC CCTTATGTCC AGGGCTTCAC 1201 GCATGCTACA ATGGCCGGTA CAAAGGGCTG CGATCCCGTG AGGGGGAGCG AATCCCAAAA 1261 AGCCGGTCTC AGTTCGGATT GGGGTCTGCA ACTCGACCCC ATGAAGTCGG AGTCGCTAGT 1321 AATCGCAGAT CAGCAACGCT GCGGTGAATA CGTTCCCGGG CCTTGTACAC ACCGCCCGTC 1381 ACGTCACGAA AGTCGGCAAC ACCCGAAGCC GGTGGCCTAA CCCTTGTGGA GGGAGCCGTC 1441 GAAGGTGGGG CTGGCGTTTG GGACGAAGTC GTAACAAGGT AGCCGTA
16S rRNA的系统发育分析
MEGA 软件构建系统发育树
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核酸
分子量的大 小
分子状态
物理
电压 缓冲液 温度
电泳指示剂：溴芬兰，距边缘1cm左右停止电泳。 电泳染色剂：溴化乙锭(ethidium bromide,简称EtBr)， 扁平染料， 嵌到DNA或RNA分子的碱基之间，借助紫外灯观察。
DNA Marker
1.2kb 800bp
操作步骤
成分 水
10×GC Buffer dNTPs 16Sp1 16S p2
凝胶浓度
0.5% 0.7% 1.0% 1.2% 1.5% 2.0%
线形DNA的最佳分辨范围（bp）
1,000～30,000 800～12,000 500～10,000 400～7,000 200～3,000 50～2,000
琼脂糖凝胶分辨DNA片段的范围: 0.2-50kb
DNA分子在电泳过程中迁移的距离受以下几个因素 的影响：
5´
退火 引
5´
5´
物5´
5´
5´
延伸
5´
5´
5´ 5´
5´ 5´
一个标准的PCR过程
核酸的时，它们就会以一定的速度移向适 当的电极。
这种电泳分子在电场作用下的迁移速度——电泳的迁移率。 迁移率的影响因素：电场长度、电泳分子的电荷数量、电泳分 子与支持介质的摩擦系数等。
Mg2+（缓冲液） 5´
待扩增DNA区域
5´
变性
94℃ 5 min
1
退火
3´
聚合
3´
5´
55℃
5´
70℃ 3´
3´
5´
循环25-30
次
①
2
目的基因
30个循环：230
5´
变性 加热
5´ 2
目标DNA片段达
5´
退火
5´
延伸
引物 底物
106-107
5´
2
5´
变性－退火－延伸
5´ 5´
变性 加热
5´ 4
5´