16SrRNA SOP文件

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检测方法：

（一）细菌基因组DNA的提取：

向200µl的无菌PCR管中加入50µl无菌水，挑取已纯化的单个菌落于其中充分混匀，调制菌液至1-2浊度，震荡15秒钟，盖好管盖置100℃沸水中煮沸

10min，取出后于冰上放置3—5分钟后，13000转离心5分钟，取上清液约

30ul即为DNA提取液

（二）16SrRNA基因的PCR扩增：50 µl 体系

2×PCR Mix 25 µl

上游引物：1µl

下游引物：1µl

Taq DNA聚合酶（5 U/µl）0.5µl

DNA 模板 1 µl

ddH2O 21.5µl

16SrRNA基因的检测引物：

27F：5’-AGAGTTTGATC(C/A)TGGCTCAG-3’

1492R: 5’-TACGG(C/T)TACCTTGTTACGAC-3’

16SrRNA基因的PCR反应参数：

94 ℃8 min；

94 ℃40 s

55 ℃(53℃) 40 s 30循环

72 ℃1 min 30 s

72 ℃8 min

4℃保存

注：每次配制PCR反应体系时，应多制备一个体积，以防由于（三）琼脂糖电泳检测：

1×TAE电泳缓冲液的配制：

50×TAE缓冲液：Tris碱121g，冰醋酸28.56mL，0.5mol/LEDTA（pH8.0）50mL，加去离子水定容至500ml室温保存备用，使用时先将50×TAE缓冲液稀释成1×TAE缓冲液。1%琼脂糖凝胶的配制：

称取0.3g琼脂糖，加入30 mL 1×TAE电泳缓冲液，于微波炉中加热溶解，取出后用水冷却至50℃，加入,3µl的goldview核酸染料；将上样梳固定于胶槽内，将制备好的胶液小心地倒入胶板内，使胶液缓慢展平，确保没有气泡后，将胶槽于室温放置使胶液完全凝固。

胶液完全凝固后，将凝胶置于电泳槽内，添加1×TAE电泳缓冲液至没过胶板1—2mm，取4µl产物于胶孔内，100V电泳25分钟。

检测：

将电泳后的凝胶于紫外线下观察，16SrRNA基因的条带位于1500bp处