发酵提取工艺基础知识-王静

发酵液提取工艺基础知识
发酵液
预处理
菌体分离
菌体破碎
细胞碎片分离
收集上清液
成品加工
浓缩精制
初步纯化
发酵液预处理的原因
由于所需的产品在培养液和菌体中浓度很低，并 与许多杂质夹杂在一起，所以必须进行预处理。
预处理的目的： ⑴改变发酵液的物理性质，促进从悬浮液中分
离固形物的速度，提高固液分离器的效率； ⑵尽可能使产物转入便于后处理的一相中（多 数是液相）； ⑶去除发酵液中的部分杂质，以利于后续各步 操作。
当发酵液不易被过滤纯化时，我们可以采用离心 的方法来分离。 离心分离是基于固体颗粒和周围液体密度存在差 异，在离心场中使不同密度的固体颗粒加速沉降的 分离过程，当静置悬浮液时，密度较大的固体颗粒 在重力作用下逐渐下沉，这一过程称为沉降。
旋转式真空过滤设备
常见的离心机有： 1.管式离心机 最简单，可提供较大离心力； 管状离心机可以冷却，在蛋白质生产中很有利； 悬浮液由管底进，澄清液由管口流出。 管壁上沉积物为浓浆；可连续加料至流出物固 体损失使离心不能正常进行；须定时拆卸、清 洗，这种间断性操作也是最大的缺点。
方法 化学法
技术 渗透冲击 酶消化法 增溶法 脂溶法 碱处理法
原理 渗透压破坏细胞 细胞壁被消化，使 细胞破碎 表面活性剂溶解细 胞壁 有机溶剂溶解细胞 壁并使之失稳 碱的皂化作用使细 胞壁融解
效果 温和 温和 温和 适中 剧烈
成本 便宜 昂贵 适中 碎酵母 细胞

纳滤：以压力差为推动力，从溶液中分离300~1000 小分子量的膜分离过程，孔径分布在平均2nm
各种膜的分离特性
微滤 悬浮颗粒
超滤
大分子有机物
纳滤
糖类等小分子有机物，二价盐 或多价盐
反渗透
单价盐
水
膜的分类

按孔径大小：微滤膜、超滤膜、反渗透膜、
纳滤膜 按膜结构：对称性膜、不对称膜、复合膜 按材料分：合成有机聚合物膜、无机材料 膜
膜本身是均一的一相或由两相以上凝聚物构成
的复合体
被膜分开的流体相物质是液体或气体 膜的厚度应在0.5mm以下，否则不能称其为膜
膜分离技术的类型和定义

膜分离过程的实质是物质透过或被截留于 膜的过程，近似于筛分过程，依据滤膜孔 径大小而达到物质分离的目的，故而可以 按分离粒子大小进行分类：
◆萃取剂选择原则：使溶质在萃取相中有最大的 溶解度
Light phase
杂质
溶质 萃取剂 原溶剂
Heavy phase
单级萃取
使含溶质的溶液（h） 和萃取剂（L）解出混 合，静止后分成两层。

多级萃取

多级萃取是多级串联的设备中进行多级萃取的方 法，是工业生产最常用的萃取流程 分离效率高 产品回收率高 溶剂用量少


微滤（MF）：以多孔细小薄膜为过滤介质，压 力差为推动力，使不溶性物质得以分离的操作， 孔径分布范围在0.025~14μm之间； 超滤（UF）：分离介质同上，但孔径更小，为 0.001~0.02 μm，分离推动力仍为压力差，适 合于分离酶、蛋白质等生物大分子物质；

反渗透（RO）：是一种以压力差为推动力，从溶液 中分离出溶剂的膜分离操作，孔径范围在 0.0001~0.001 μm之间；（由于分离的溶剂分子往 往很小，不能忽略渗透压的作用，故而成为反渗透）
染料工业
细胞壁和细胞膜简介
植物细胞壁的主要成分是纤维素、半纤维素、木质素蛋白质、酶类以及 脂肪酸等。 细菌的细胞壁的主要成分是肽聚糖。 真菌细胞壁中的主要成分为几丁质、纤维素、葡聚糖、甘露聚糖等，这 些都是单糖的聚合物。
细胞膜的结构
细胞破碎的方法
◆细胞化学破碎法 ◆细胞物理破碎法
细胞破碎化学方法中最简单的是渗透冲击法。此法将 一定体积的细胞液加到2倍体积的水中，细胞中溶质浓 度高，水不断进入细胞，使细胞膨胀，最后导致破裂。 细胞破裂后释放到周围环境中的胞内物。
预处理常用方法： ⑴加热法 ⑵助滤剂上的吸附 ⑶凝聚和絮凝
加热 最简单、最经济的预处理方法是加热，加热 不仅可以增加料液的操作特性，也可以对其进行 灭菌。但加热变性的方法只适合于对热稳定性的 产物。
助滤剂上的吸附 在过滤操作中，为了降低过滤阻力，增加过滤 速率或得到高度澄清的滤液所加入的一种辅助性的粉 粒状物质，称为助滤剂。 常用的助滤剂有硅藻土、纸粕、活性炭、金属 屑和炉渣等。硅藻土具有很大的比表面积，能吸附胶 体物质，并形成空隙率很高的滤饼，是应用最广泛的 助滤剂。纸粕多用作预涂层，可防止滤布的早期堵塞。 助滤剂只用于以获得清净滤液为目的的过滤操 作。

膜过滤的基本概念和理论
目的：将溶质通过一层具有选择性的薄膜，
从溶液中分离出来。
分离时的推动力都是压强，由于被分离物质
的分子量和直径大小差别及膜孔结构不同， 其采用的压强大小不同。
纳米膜过滤技术

介于反渗透与超滤膜之间，能截留有机小分子而使大部 分无机盐通过； 特点：
在过滤分离过程中，能截留小分子有机物，并可以
常用絮凝剂
聚丙烯酰胺类和聚乙烯亚胺衍生物，根据活性基团
在水中解离情况不同，可分为非离子型、阴离子型 （含有羧基）和阳离子型（含有胺基）三类。 聚丙烯酸类阴离子絮凝剂和聚苯乙烯类衍生物。 无机高分子聚合物也是较好的一类絮凝剂，如聚合 铝盐和聚合铁盐等。
天然有机高分子絮凝剂，如壳聚糖和葡聚糖等聚

同时透析除盐，集浓缩与透析为一体；
操作压力低
纳滤膜的性质与特点

有多层聚合薄膜组成，滤膜为多孔性材料，平均孔径 为2nm，截留分子量范围在100~200道尔顿之间；同样 要求其具有良好的热稳定性、pH稳定性、有机溶剂稳 定性。 （云芝糖肽发酵液经板框过滤后得到的滤液，经过纳 滤处理达到脱盐浓缩的目的）
萃取过程： (ZR)－+(HU)＋→(HU)(ZR)
浓缩精制
膜分离技术

膜分离的概念：利用膜的选择性（孔径大小）， 以膜的两侧存在的能量差作为推动力，由于溶 液中各组分透过膜的迁移率不同而实现分离的 一种技术。
膜的概念

在一种流体相间有一层薄的凝聚相物质， 把流体相分隔开来成为两部分，这一薄层 物质称为膜。
酶消化法和碱处理法都是细胞破碎的有效方法，但是也都 有各自的缺点。
酶消化法的缺点在于酶的价格昂贵限制了在大规模生产 中的使用，虽然条件温和、具有选择性。细胞悬浮液中加入 酶能迅速和细胞壁反应并破坏它们。酶选择性的催化细胞壁 反应，不破坏细胞内的其它物质。 碱处理法和酶消化法相反，反应激烈，不具选择性，而且 较便宜。碱加入细胞悬浮液中后和细胞壁进行了多种反应， 包括使磷脂皂化。该操作是细胞增溶的很好的例子，因为它 使细胞壁的成分溶于表面活性剂，也使蛋白质变性。该法不 仅破坏了细胞壁也破坏了产物，因此即便很便宜，碱处理也 是一种很不常用的方法。
化学萃取

利用可与被萃目标物发生反应的物质作为萃取剂 进行的反应 络合萃取分离有机酸（醋酸） 季铵盐 叔胺

阳离子交换反应
被萃取物为待正电的阳离子（Z+） 萃取剂一般为弱酸有机物HA或H2A
萃取过程：Z+(W)+HA(O)→ZA(O)+H+( W)

阴离子缔合反应
金属离子在水相中以络合阴离子存在 萃取剂与H+结合成阳离子
糖类，还有明胶、骨胶、海藻酸钠等。 微生物絮凝剂是近年来研究和开发的新型絮凝剂， 它是一类由微生物产生的具有絮凝细胞功能的物 质。主要成分是糖蛋白、粘多糖、纤维素及核酸 等高分子物质。微生物絮凝剂和天然絮凝剂与化 学合成的絮凝剂相比，最大的优点是安全，无毒 和不污染环境。
菌体分离主要采用过滤和离心两种方法。 当发酵液不易被过滤纯化时，我们可以采用 离心的方法来分离， 与过滤设备相比，离心设 备的价格昂贵。但当固体颗粒细小而难以过滤时， 离心操作往显得十分有效。
珠磨破碎法
剧烈
便宜
机械法主要有匀浆法和研磨法。这两种方法中，细 胞通过高的机械剪切力被破坏。热量的产生是该法的一 个缺点，而且不容易规模放大，是一种可以在实验室规 模下操作方法。
◆冻结-融化法 机理：一是在冷冻过程中会使细胞膜的疏水键结构破裂，从而增加细胞 的亲水性；二是冷冻时细胞内水结晶形成冰晶粒，引起细胞膨胀而破裂。 缺点：反复冻融会使蛋白质变性，从而影响活性蛋白质的回收率。 ◆干燥法 机理：采用空气干燥、真空干燥、喷雾干燥和冷冻干燥等，改变膜的通 透性。 缺点：条件变化较剧烈，容易引起蛋白质或其它组织变性。 ◆自溶法 机理：是酶解的另一种方法，所需溶胞的酶是由微生物本身产生的。 缺点：容易引起所需蛋白质的变性，自溶后的细胞培养液过滤速度也会 降低。
凝聚和絮凝 凝聚：胶体粒子(10-100nm)中性盐促进下脱稳相 互聚集成大粒子（1mm） 机理： a 中和粒子表面电荷 b 消除双电层结构 絮凝：大分子聚电解质将胶体粒子交联成网状， 形成絮凝团的过程 机理：架桥作用
凝聚和絮凝 通过电解质的加入促进原始溶液的凝聚和絮凝， 试剂有简单的电解质、酸、碱、合成的聚合电解质。 简单电解质降低了胶体粒子间的排斥电位，从 而使得范德华引力起主导作用，聚合成较大的胶粒， 粒子的密度越大，越易分离。 预处理时加入合成聚合电解质既能降低排斥电 位，又吸附了周围的微粒，形成桥架作用，促使胶 粒形成粗大，密度低的絮凝团。这些絮凝团很容易 被过滤得到。
纳滤的应用
行 业 制药工业 处理对象 母液中有效成分的回收 抗菌素的分离纯化 维生素的分离纯化 氨基酸的脱盐与纯化 乳清脱盐与浓缩 苛性碱回收 活性染料的脱盐与回收 行 业 化工行业 处理对象 酸碱纯化、回收 电镀液中铜的回收
食品工业
纯水制备 废水处理
超高纯水 水的脱盐 地下水的净化 印染厂废水脱色 造纸厂废水净化

加压过滤
压滤器
工作原理：用加压或者减压的方法将料液压入滤器内， 通过包有滤布或滤纸的多孔性空心钢柱。固体被截留在柱 外滤材上，滤液经柱内自滤器上端压出 。

板框过滤机
工作原理：滤浆由机头（封头）进入，经滤过介质，由滤 液流出口排出。
过滤设备从传统的板框式过滤机到旋转式真空过 滤设备，种类很多。
细胞碎片分离
◆离心分离 ◆板框过滤 ◆萃取
萃取概念
利用在两个互不相溶的液相中各种组分（包括目的产物） 溶解度的不同，从而达到分离的目的
◆物理萃取
◆化学萃取
物理萃取
◆利用溶剂对需分离组分有较高的溶解能力，分 离过程纯属物理过程 ◆萃取体系的构成
溶质：被萃取的物质 原溶剂：原先溶解溶质的溶剂 萃取剂：加入的第三组分
过滤是将料液通过固体支持或者过滤介质时， 使得固体物质从溶液中分离，对于好定形的晶 体，这是一种最直接的步骤。
滤饼
过滤方法和设备


常压过滤 过滤器：玻璃漏斗、搪瓷漏斗、金属夹层保温漏斗 过滤介质：滤纸或脱脂棉 减压过滤 过滤器：布氏漏斗（多用于非黏稠性料液和含不可压缩性 滤渣的料液） 过滤介质：滤纸
碟片式离心机
第三种篮式过滤机是离心和过滤方法的结 合。它具有一个多孔可高速旋转的圆筒 。
悬浮液延着圆筒的旋转轴 连续加入，通过筒壁上的 小孔流出， 中空柱状料 液的内径基本为一个常数， 不随料液的加入而改变， 滤饼在筒壁上沉积。
概述
发酵液提取的第一步是将生物机体从发酵液中分离， 通常使用过滤和离心等方法，上面已有陈述。大多数情况 下，抗生素，胞外酶，一些多糖，及氨基酸等目标产物存 在于在发酵液中。在上述过程中，需被分离的发酵液可被 看作一种副产物来处理，以此分离和纯化产物。 有些目标产物不在发酵液中，而是存在于生物体中。 尤其是由基因工程菌产生的大多数蛋白质不会被分泌到发 酵液中，而是在细胞内沉积。脂类物质和一些抗生素也是 包含在生物体中。还有一些目标产物就是细胞本身，如面 包酵母。大多数情况下，产物还是包裹在生物体内，属胞 内产物。
方法 机械法
技术 匀浆法（片型）
原理 细胞被搅拌器劈碎
效果 适中
成本 适中
举例 动物组织及动 物细胞
研磨法
超声波法 匀浆法（孔型）
细胞被研磨物磨碎
用超声波的空穴作 用使细胞破碎 须使细胞通过的小 孔，使细胞受到剪 切力而破碎 细胞被玻璃珠或铁 珠捣碎
适中
适中 剧烈
便宜
昂贵 适中 细胞悬浮液小 规模处理 细胞悬浮液大 规模处理 细胞悬浮液和 植物细胞的大 规模处理