如何构建载体
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
载体构建流程
载体构建SOP流程:GenBank查询目的基因序列→根据ORF序列利用引物设计软件设计引物→表达目的基因的组织或细胞总RNA提取→RT-PCR获取目的基因→酶切目的基因和载体→分别纯化酶切的目的基因和载体并建立连接反应→转化→初步筛选阳性克隆→阳性克隆测序→测序正确的质粒保种并重提质粒I.获取目的基因/序列片段一.获取序列信息通过GENBANK数据和生物信息的方法设计目的基因或目的片段引物（shRNA、miRNA）。
PCR引物的设计原则：①引物应用核酸系列保守区内设计并具有特异性。
②产物不能形成二级结构。
③引物长度一般在15~30碱基之间。
④ G+C含量在40%~60%之间。
⑤碱基要随机分布。
-⑥引物自身不能有连续4个碱基的互补。
⑦引物之间不能有连续4个碱基的互补。
⑧引物5′端可以修饰。
⑨引物3′端不可修饰。
⑩避免在引物的3’端使用碱基A。
在实际设计引物中由于ORF两末端序列本身的限制，不能完全按照上述理想的设计原则，但也切记引物不能过长或过短。
过长的引物不容易打开其二级结构，与模板结合缓慢，也容易形成引物二聚体，通常不超过35bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
过短的引物特异性差，扩出其它不相关片段，最终很难得到目的片段，通常不短于18bp(不包括酶切位点和保护碱基)。
要将目的基因定向克隆至相应载体，需要在上下游引物两端设计不同的酶切位点，由于酶切位点位于线性末端时酶对其识别切割能力大大降低，需依据NEB目录添加相应保护碱基，酶切时可相应增加时间。
二.制备模板1.分离高质量RNA：成功的cDNA合成来自高质量的RNA。
高质量的RNA至少应保证全长并且不含逆转录酶的抑制剂，如EDTA或SDS。
RNA的质量决定了能够转录到cDNA上的序列信息量的最大值。
现在实验室通常使用Trizol试剂法提取总RNA，可以从多种组织和细胞中提取高质量的非降解RNA。
Trizol试剂法可以从最少100个细胞或1mg组织中提取RNA。
载体构建流程课件
I 载体构建流程
提取mRNA RT
PCR
cDNA
得到目旳基因
PCR产物纯化
菌落PCR 转化 连接
纯化酶切产物
酶切目旳基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确旳摇菌提质粒
导入体现宿主 测试体现情况
提取mRNA
假如可能，试验室应辟出专门RNA操作区，离心 机、移液枪、试剂等均应专用。RNA操作区应保 持清洁，并定时进行消毒。.操作过程中应自始至 终佩戴口罩和手套，并经常更换，以防止将手、 臂上旳细菌和真菌以及人体本身分泌旳RNA酶带 入试管或污染用具。操作过程所用器材都要经过 特殊处理。一次性枪头、离心管等塑料制品 采用 连续灭菌两次来灭活RNA酶。研钵 180℃ ，4h。
注意将甘油旳终浓度控制在10%下列，以防止出 现星号活性，可经过增长反应体系旳总体积旳措 施实现这一要求。
酶切常见问题
纯化酶切产物
一般此步是必要旳，能够对比未经纯化旳酶切产 物进行连接后取得旳阳性克隆大大低于胶回收酶 切产物连接所得阳性克隆。
此步旳目旳是清除多出旳片段，得到单一纯化旳 目旳基因与载体骨架，使之连接不受其他序列干 扰。
谢谢！
复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl
培养基重悬细胞并涂布到含抗性旳LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞旳效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
菌落PCR
此步以适应当代分子生物学试验室批量工作 旳高效性，一般只需挑半个菌落直接作为模 板进行常规PCR就能初步检测阳性克隆。
切胶回收PCR产物时，防止DNA在紫外线下暴露时间过长 从而形成嘧啶二聚体，造成PCR产物不能连接。
载体构建
载体构建分为以下步骤：1.载体的选择和引物设计以扩增目标基因2.目标片段的PCR扩增3.载体和目标片段的限制性酶切4.连接转化5.挑取克隆提质粒6.单克隆的验证及送样测序。
载体的选择实验室常用的载体有pUC19（扩繁目标片段），pet28a（原核表达载体Kna+），pGEX-4T-1(原核表达载体Amp+)，pCI-NEO(真核表达载体Amp+)，pCDNA3.1(真核表达载体Amp+)，pLKO.1(shRNA构建Amp+)。
根据所要构建的质粒目的的差异以及载体和目标片段的酶切位点分析结果来选择载体。
举例如下：实验目的是将MYC基因插入到载体中，转染进细胞中表达。
应选用真核表达载体pCI-NEO 或pCDNA3.1。
引物设计引物设计的目的是将目标片段扩增出来以便与载体连接，所以在引物的两端应人为加上酶切位点，酶切位点前加上保护碱基。
在选择酶切位点是应注意，选择的应该是目的基因片段中没有而载体上有的限制性内切酶，防止目标片段被切不完整，也便于和载体连接。
载体构建之后我们的目的是要表达，所以应该加入标签以便western blot检测蛋白是否表达。
常用的标签有Flag标签、6XHis标签、HA标签和Myc标签。
Flag标签：D Y K D D D D KGAT TAC AAG GAT GAC GAC GAT AAG6XHis标签：H H H H H HCAC CAC CAC CAC CAC CACHA标签：Y P Y D V P D Y ATAC CCA TAC GAT GTT CCA GAT TAC GCTMyc标签：E Q K L I S E E D L这些标签被表达成氨基酸后，特定的氨基酸序列会与相应抗体结合，在western blot时可被检测。
因此，在设计引物时，这些核酸序列应位于起始密码子ATG之后。
翻译是从mRNA的5‘端开始，而蛋白质合成是从N端到C端，所以若要把标签加在N端，标签所对应的核苷酸序列应位于ATG之后，若是加在C端，则应该将标签所对应的核苷酸序列置于终止密码子TAA之前。
载体构建注意事项
载体构建注意事项在进行载体构建时，我们需要注意一些重要的事项，以确保构建的效果和质量。
本文将就这些注意事项进行详细介绍，希望能对大家有所帮助。
一、选择合适的载体材料在进行载体构建时，首先需要选择合适的载体材料。
载体材料应具备以下特点：具有良好的生物相容性，能够与生物体组织良好地结合；具有适当的力学性能，能够承受所需的载荷；具有良好的可加工性，便于进行构建和加工等。
常用的载体材料包括生物陶瓷、生物高分子材料、金属材料等。
二、考虑载体的结构设计在进行载体构建时，其结构设计也是非常重要的。
合理的结构设计可以提高载体的稳定性和功能性。
在设计载体的结构时，应充分考虑载体的应用场景和所需功能，并结合材料的特性进行合理设计。
例如，如果需要构建一个用于骨组织工程的载体，可以设计成多孔结构，以增加载体与细胞的接触面积和生物活性。
三、注意载体的表面处理载体的表面处理对于载体的性能和功能起着重要的影响。
通过合适的表面处理可以改善载体的生物相容性、生物活性和降解性能等。
常用的载体表面处理方法包括化学处理、物理处理和生物处理等。
例如，可以通过表面改性、离子注入等方法改变载体表面的化学性质；通过等离子体处理、激光处理等方法改变载体表面的形貌和结构。
四、选择适当的载体构建技术载体构建技术是实现载体构建的关键。
目前常用的载体构建技术包括三维打印、溶胶-凝胶法、纺丝法、电化学沉积法等。
在选择载体构建技术时，应根据载体的形态和所需功能选择合适的技术。
同时，还应考虑技术的成本、工艺复杂度、构建速度等因素。
五、进行载体的性能测试与评估在完成载体的构建后，还需要对其进行性能测试与评估，以确保其满足设计要求。
常用的性能测试包括载体的力学性能测试、生物相容性测试、生物活性测试等。
通过这些测试可以评估载体的稳定性、生物相容性和功能性等指标。
六、注意载体的保存与运输在完成载体构建后，应注意其保存与运输。
一般来说，载体应存放在干燥、阴凉和无菌的环境中，以防止载体的污染和降解。
植物载体构建流程
植物载体构建流程植物载体构建是个还挺有趣的事儿呢，咱就像搭积木一样把各种元素组合起来，让植物能按照我们想要的方式生长或者表达特定的基因。
一、载体选择。
我们得先挑个合适的载体，就像给植物找个合适的房子一样。
这载体有很多种哦，像质粒载体就比较常用。
它就像一个小小的工具箱，里面有各种工具（不同的功能元件）。
我们要根据自己的目的来选，要是想把某个基因送到植物细胞里去，就得选那种能在植物细胞里好好工作的质粒载体。
比如说，有的质粒是专门为双子叶植物设计的，有的呢又更适合单子叶植物。
这就好比不同的房子适合不同的住户，可不能选错啦。
二、目的基因获取。
接下来就是找我们想要的那个“小秘密”——目的基因。
这目的基因可以从很多地方来，有时候是从其他植物里发现的一个特别厉害的基因，能让植物抗虫或者抗旱啥的。
我们就像寻宝一样把这个基因找出来。
找的方法也有不少哦，可以用基因文库筛选，就像是在一个装满各种基因宝贝的大仓库里找我们要的那个小宝贝。
还有一种是通过PCR（聚合酶链式反应）来扩增这个基因，这就像是用复印机把这个基因复印很多份一样，让我们有足够的量可以用。
三、基因连接。
把目的基因找到后，就要把它和我们选好的载体连接起来啦。
这就像是给小宝贝找个合适的座位，让它能稳稳地待在载体这个小房子里。
我们会用到一些酶，比如说限制性内切酶，这个酶可神奇了，它就像一把小剪刀，能在载体和目的基因的特定位置剪开，然后再用DNA连接酶把它们像缝衣服一样缝起来。
这过程得小心翼翼的，要是连接错了地方，那可就麻烦啦，就像把东西放错了口袋一样。
四、转化。
连接好之后呢，就要把这个带着目的基因的载体送到植物细胞里去啦。
这就像是给植物送个小礼物。
转化的方法有很多种哦。
最常见的一种是农杆菌介导转化法。
农杆菌就像是一个小邮差，它天生就有把自己身上带着的一些东西送到植物细胞里的能力。
我们就把构建好的载体放到农杆菌里，然后让农杆菌去感染植物细胞，这样载体就跟着进去了。
基因表达载体构建的具体操作流程
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构建载体的方法和原理
构建载体的方法和原理宝子，咱今天来唠唠构建载体这事儿。
构建载体呢，有一些常见的方法。
比如说酶切连接法。
这就像是玩拼图一样呢。
我们有目标的基因片段，还有载体，就像两块拼图。
我们用特定的限制性内切酶把载体切开，就像在载体这个大拼图上弄出个合适的形状。
然后呢，把我们想要的基因片段也处理一下，让它的两端能和载体切开后的部分完美匹配。
再用DNA连接酶把它们连接起来，就像把两块拼图牢牢地粘在一起啦。
这个原理其实就是利用了酶的特异性，内切酶能识别特定的核苷酸序列，然后在特定的位置把DNA切开，连接酶又能把有相同末端的DNA连接起来。
还有一种是同源重组法。
这就有点像找亲戚搭伙过日子呢。
我们要把目的基因和载体放在一起，它们有些部分是同源的，就像有共同的家族特征一样。
在一些特殊的酶或者细胞环境的作用下，它们就会按照同源的部分进行重组，把目的基因整合到载体里面。
这个方法很巧妙，不需要像酶切连接法那样严格的末端匹配，只要有同源的部分就能完成重组。
另外呢，还有一种叫做 Gateway技术的构建载体方法。
这个就有点像走特殊通道啦。
它有专门的一套体系，有供体载体、目的基因和目的载体。
先把目的基因克隆到供体载体上，然后通过一种特殊的重组反应，就像通过一个特殊的门一样，把目的基因转移到目的载体上。
这种方法速度比较快，而且准确性也比较高呢。
构建载体的原理呀，总的来说就是要把我们想要的基因片段按照我们的想法整合到一个合适的载体里面。
这个载体就像一个小车子，可以带着基因片段到我们想要它去的地方，比如说把基因送到细胞里面，让细胞按照我们的想法生产出特定的蛋白质之类的。
这在基因工程里可是超级重要的步骤呢，就像盖房子打地基一样，没有构建好载体，后面好多关于基因操作的事儿都没法好好进行啦。
宝子，你现在是不是对构建载体有点感觉了呀 。
载体构建介绍说明
02
载体构建的方法和技术
基因克隆技术
基因克隆技术是载体构建的基础， 通过该技术可以将目的基因从原 始DNA中提取出来，并进行复
制和扩增。
该技术包括限制性核酸内切酶、 DNA连接酶等关键酶的作用， 以及质粒、噬菌体等克隆载体的
应用。
基因克隆技术能够将目的基因高 效地转移到受体细胞中，为后续 的基因表达和功能研究奠定基础。
酶切与连接技术
酶切技术是指利用限制性核酸内切酶对DNA进行切割，得到具有特定黏性末端的片 段。
连接技术则是将两个或多个DNA片段通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成完整 的基因表达载体。
酶切与连接技术是载体构建过程中必不可少的步骤，能够将目的基因与载体进行重 组，从而构建出能够表达目的基因的表达载体。
疫苗研发
载体构建也可用于疫苗研发，通过将 病原体的抗原基因导入细胞或组织， 诱导机体产生免疫反应，从而达到预 防和治疗疾病的目的。
基因编辑领域
CRISPR-Cas系统
载体构建在基因编辑领域中常用于CRISPR-Cas系统的构建和优化，通过将sgRNA和Cas9蛋白导入细胞，实现基 因敲除、敲入和定点突变的精准编辑。
基因治疗应用
载体构建在基因治疗中广泛应用于遗传性疾病、肿瘤、感染性疾 病等的治疗，通过将正常基因导入病变细胞，纠正或补偿缺陷基 因，达到治疗目的。
生物制药领域
药物研发
载体构建在生物制药领域中用于药物 研发，通过将药物基因或调节基因导 入细胞或组织，调控药物的表达和分 泌，提高药物的疗效和降低副作用。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤Company Document number：WUUT-WUUY-WBBGB-BWYTT-1982GT载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1H2O 7将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
构建载体的详细过程
构建载体的详细过程
构建载体的详细过程包括四个步骤：
第一步：确定载体设计模式。
在设计载体时，首先要确定使用哪种设计模式，即采用什么样的结构或布局来促进载体的质量和性能。
载体设计模式应考虑载体的功能，大小，材料，成本等设计要求。
第二步：确定载体配置。
其次，需要确定载体的配置，即主要构成元件，以及它们之间的安装排列和连接方式。
第三步：加工制造载体。
根据确定的设计模式和配置来加工制造载体。
第四步：测试载体。
最后，对载体进行测试，以确保其功能和性能达到设计要求，确保质量达标。
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的主要步骤包括：
1.目的基因的获得：即使用限制性核酸内切酶切割质粒，露出黏性末端，再用同一种限制性核酸内切酶切割目的基因，使其产生相同的黏性末端。
2.载体和目的基因的限制性酶切：用相同的限制性酶酶切载体和目的基因，使它们产生相同的黏性末端。
3.连接转化：将切下的目的基因的片段插入质粒的切口处，再使碱基互补配对结合，两个黏性末端吻合在一起，碱基之间形成氢键。
4.加入适量的DNA连接酶，催化两条DNA链之间形成磷酸二酯键，从而将相邻的脱氧核糖核酸连接起来，形成一个重组DNA分子。
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程
构建表达载体的一般流程如下：
1. 选择合适的载体：根据需要表达的基因或蛋白质，选择一个合适的表达载体。
常用的载体有质粒、病毒、合成RNA等。
2. 插入目标基因：将需要表达的基因插入到载体的多克隆位点中。
可以通过PCR 扩增目标基因并使用限制性内切酶切割载体和基因，然后进行连接。
3. 连接启动子和终止子：为确保基因在宿主细胞中能够正常表达，需要在基因的上游添加启动子和在基因的下游添加终止子。
这些序列将调控基因的表达方式和水平。
4. 检验构建质量：通过限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法，验证所构建的载体和目标基因的正确性和完整性。
5. 转化宿主细胞：将构建好的表达载体导入到宿主细胞中。
常用的转化方法有电穿孔、热激冲击和化学转化等。
6. 筛选和鉴定：通过特定的筛选方法或选择标记，在转化的宿主细胞中筛选和鉴定表达目标基因的阳性克隆。
7. 表达优化：根据需要，可以通过调节培养条件、添加诱导剂或使用特定的宿主菌株等方法，优化目标基因的表达水平和质量。
8. 收获表达产物：经过一段时间的培养后，收获表达的基因产物，如蛋白质，进行后续的纯化、鉴定和应用等。
需要注意的是，具体的构建流程和方法可能会因实验的目的和要求而有所不同。
在实施过程中，需要对不同步骤和条件进行优化和调整，以确保表达载体的构建和表达目标基因的成功。
《载体构建流程》课件
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
构建表达载体的实验流程及其注意事项
质粒纯化：
1、PEG纯化
缺点：摇菌液几百毫升，耗时长，步骤繁多 优点：质粒纯度高（不含线状DNA）
浓度大
2、过柱法：
缺点：柱子吸附能力有限，浓度低，纯度差（甚至有RNA） 优点：省时省力
29
质粒的电泳
Marker是酶切片段； 质粒是环形的，还会形成超螺旋结构。
30
质粒验证
1、酶切验证
一般将质粒切成2-3个片段，片段大小是否相符？ 如：连接后酶切的载体片段、目标片段大小与连接前相同？
三、人工化学合成
最后的选择。公司会将合成片段连入克隆载体。需测序验证。
12
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
13
基因工程所用的酶
限制性内切酶 从商品目录上得到有关信息
EcoR I
Pst I
GAATTC CTTAAG
CTGCAG GACGTC
验证每步产物，设置对照以检查每一反 应的效率，都是可取的良策。而要对上述问题应对自 如，又必须透彻理解每一步实验流程所涉 及的实验原理。
——第一版前言（p11）
《分子克隆实验指南》 第二版 ，1996，科学出版社
2
汇报内容
1 表达载体的分类 2 目的基因的获得 3 酶切 4 片段回收 5 连接 6 质粒的检测
质粒提取：碱裂解法
收获细菌：含有质粒的DH5α、TOP10等 LB可富集2-3次，Teriffic可2次。
溶液Ⅰ： Tris-HCl, EDTA, 葡萄糖 溶液Ⅱ： NaOH, SDS
冰上3-5min，时间过长会： 质粒断裂；羟基化影响酶切
溶液Ⅲ：乙酸钾，冰乙酸 迅速颠倒3次混匀后，置于冰上
载体构建中的常见技巧与注意事项
载体构建中的常见技巧与注意事项在广告和宣传活动中，载体构建是至关重要的一环。
通过选择恰当的载体，可以更好地传达信息，吸引目标受众，并提升品牌形象。
本文将介绍一些常见的技巧和注意事项，帮助您在载体构建过程中取得更好的效果。
1.准确定位目标受众在选择载体的过程中，首先要明确目标受众是谁。
不同载体针对的受众群体有所不同，因此准确地定位目标受众是十分重要的。
例如，如果目标受众是年轻人群体，可以选择在社交媒体平台发布宣传信息；而如果目标受众是中年人群体，可以选择在电视或报纸上发布广告。
2.选择合适的载体类型根据目标受众的特点和传播需求，选择合适的载体类型也是至关重要的。
常见的载体类型包括电视广告、网络广告、报纸广告、户外广告等。
不同载体类型有其独特的优势和适用场景。
例如，电视广告可以通过图像和声音相结合的方式，更好地吸引人们的注意力；网络广告可以精确地投放，从而实现更精准的推广效果。
3.注意载体的媒体影响力在选择载体时，要注意媒体的影响力。
媒体的影响力可以通过其受众数量、知名度和影响力等方面来评估。
选择具有较高媒体影响力的载体，可以使广告更好地传达给目标受众，并获得更多的曝光机会。
然而，高媒体影响力的载体通常价格昂贵，因此需要权衡成本和效果之间的关系。
4.内容制作要有创意与独特性在进行载体构建时，创意和独特性是非常重要的。
传播内容需要有吸引力，能够引起目标受众的兴趣和共鸣。
创造性的广告内容可以通过新颖的表达方式、巧妙的叙事手法或具有情感共鸣的故事来实现。
同时，广告内容也要与品牌形象和宣传目标保持一致，以达到更好的传播效果。
5.注意广告的可视性和易识别性在载体构建中，广告的可视性和易识别性是需要考虑的重要因素。
广告应该能够在受众的视线范围内被发现，并且能够迅速传递出自己的信息。
因此，广告的内容和设计要简洁明了，避免过于复杂或混乱的布局。
同时，字体、颜色和图片等元素的选择也要符合受众的审美和习惯，以增强广告的易识别性。
载体构建方法
载体构建方法
载体构建方法是指通过合适的技术手段，创建出用于携带DNA等遗传物质的载体。
常见的载体包括质粒、噬菌体、大肠杆菌、酵母等微生物，以及病毒等。
以下是一些常用的载体构建方法：
1. 质粒构建方法：质粒是一种环状DNA分子，可用于携带外源DNA。
通常采用PCR扩增和限制性酶切等技术将外源DNA插入到质粒中，然后转化到宿主细胞中。
2. 噬菌体构建方法：噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的噬菌体构建方法包括重组噬菌体技术和噬菌体展示技术等。
3. 大肠杆菌构建方法：大肠杆菌是一种常见的细菌，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的大肠杆菌构建方法包括转化、电转化、化学转化等。
4. 酵母构建方法：酵母是一种单细胞真核生物，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的酵母构建方法包括转化、电转化、融合等。
5. 病毒构建方法：病毒是一种寄生于细胞的微生物，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的病毒构建方法包括重组病毒技术、腺病毒技术、AAV技术等。
以上是一些常见的载体构建方法，不同的载体构建方法适用于不同的实验需求。
在选择合适的载体构建方法时，需要考虑到载体的稳定性、转化效率、表达效率等因素。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤集团文件发布号：（9816-UATWW-MWUB-WUNN-INNUL-DQQTY-载体构建一、原理依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
二、操作步骤1、摇菌（制作感受态细胞备用）取装有液体培养基的3ml试管两支（依情况而定），每管加40-100μl菌种，过夜摇。
2、提质粒（也就是载体）依照提质粒试剂盒中的说明书操作（根据情况最后一步洗脱时可以多洗1-2次）。
3、酶切（双酶切产生粘性末端）反应所需试剂体积（单位：ul）质粒 10所需内切酶反应缓冲液 2所需限制性内切核酸酶 1O 7H2将加好的EP管置于37℃保温1-2h。
（依照提酶切的具体步骤操作；为了达到最佳酶切的效果，最好根据所选用的酶确定所需要的反应温度）4、电泳检测将酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，检测酶切是否成功。
回收胶：琼脂糖与缓冲液一比一制胶，经过切胶回收目的产物，也有目的产物纯化的功能；检测胶：琼脂糖与缓冲液一比二制胶，为了检测目的条带与预期是否相符。
切胶回收与产物纯化是差不多的过程，所达到的目的是一样的：切胶回收也是一种纯化过程，它能去除非目的片段，然后用回收试剂盒进行纯化，能将很不纯的DNA溶液纯化；产物纯化是将较纯的DNA溶液进一步除去多余的杂质，用纯化试剂盒，你会发现纯化试剂盒和回收试剂盒的步骤几乎一样。
5、载体与目的基因连接如果电泳检测酶切成功的话，则仔细将所需的片段切割下来，将胶体回收（依照胶回收试剂盒说明书操作）；之后将回收的片段和载体连接。
置于温箱，12-16℃，保温8-16h6、转化（连接产物转化到感受态细胞中）依照转化具体操作步骤做感受态，将上述连接产物进行转化实验，涂板培养，37℃，12-16h。
7、单克隆检测（1）挑单克隆先将AMP从冰箱中取出，待融化后，在3ml装有LB液体培养基的试管中加入3μL的AMP，用枪头混匀；取1.5 mlEP管5支（依情况可以多挑几管），给每支管中加500μL上述培养液，然后用接种环（或黄枪头）挑单克隆，挑完后用枪吹打；之后，将挑好的菌摇4-5小时，至混浊即可。
构建基因表达载体的步骤
构建基因表达载体的步骤基因表达载体是用来将外源基因转录和翻译为蛋白质的重要工具。
构建一个高效的基因表达载体是基因工程的重要一步。
下面将介绍构建基因表达载体的步骤。
第一步：选择合适的表达载体在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己研究对象的表达载体。
一般来说，常用的表达载体有质粒、病毒载体和细胞质表达系统等。
对于不同的表达载体，其表达效率和表达特点也有所不同，需要根据自己的实验需要进行选择。
第二步：选择合适的启动子和信号序列在表达载体中，启动子和信号序列是控制基因表达的关键元素。
启动子是转录起始位点上游的DNA序列，可以控制基因的转录水平；信号序列则可以控制基因的翻译和定位。
因此，在构建基因表达载体之前，需要选择适合自己实验需要的启动子和信号序列。
第三步：克隆外源基因在构建基因表达载体时，需要将外源基因克隆到载体中。
一般来说，可以使用PCR扩增方法或限制性内切酶切割方法将外源基因克隆到载体中。
此外，还需要选择合适的克隆位点，以便快速筛选出正确的克隆子。
第四步：构建表达载体在将外源基因克隆到载体中后，需要构建表达载体。
具体操作包括将启动子和信号序列插入到载体中，以实现对基因表达的控制。
此外，还需要进行质粒线性化和酶切等操作，以实现转染或转化细胞。
第五步：筛选表达载体在构建表达载体后，需要进行筛选，以确定正确的表达载体。
此时可以通过限制性内切酶酶切、PCR扩增和测序等方法进行筛选，以确保表达载体的正确性。
第六步：转染或转化细胞在确定正确的表达载体后，需要将其转染或转化到细胞中。
转染方法包括热激转染、电穿孔转染和基因炮转染等；转化方法则包括化学转化和电转化等。
根据自己的实验需要选择合适的转染或转化方法。
第七步：检测基因表达在转染或转化细胞后，需要检测外源基因的表达情况。
检测方法包括Western blotting、RT-PCR和荧光显微镜等。
根据自己的实验需要选择合适的检测方法。
总结构建基因表达载体是基因工程研究的重要一步。
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如何构建载体1 启动子的选用和改造外源基因表达量不足往往是得不到理想的转基因植物的重要原因。
由于启动子在决定基因表达方面起关键作用，因此，选择合适的植物启动子和改进其活性是增强外源基因表达首先要考虑的问题。
目前在植物表达载体中广泛应用的启动子是组成型启动子，例如，绝大多数双子叶转基因植物均使用CaMV35S启动子，单子叶转基因植物主要使用来自玉米的Ubiquitin启动子和来自水稻的Actinl启动子。
在这些组成型表达启动子的控制下，外源基因在转基因植物的所有部位和所有的发育阶段都会表达。
然而，外源基因在受体植物内持续、高效的表达不但造成浪费，往往还会引起植物的形态发生改变，影响植物的生长发育。
为了使外源基因在植物体内有效发挥作用，同时又可减少对植物的不利影响，目前人们对特异表达启动子的研究和应用越来越重视。
已发现的特异性启动子主要包括器官特异性启动子和诱导特异性启动子。
例如，种子特异性启动子、果实特异性启动子、叶肉细胞特异性启动子、根特异性启动子、损伤诱导特异性启动子、化学诱导特异性启动子、光诱导特异性启动子、热激诱导特异性启动子等。
这些特异性启动子的克隆和应用为在植物中特异性地表达外源基因奠定了基础。
例如，瑞士CIBA-GEIGY公司使用PR-IA启动子控制转基因烟草中Bt毒蛋白基因的表达，由于该启动子可受水杨酸及其衍生物诱导，通过喷酒廉价、无公害的化学物质，诱导抗虫基因在虫害重发生季节表达，显然是一个十分有效的途径。
在植物转基因研究中，使用天然的启动子往往不能取得令人满意的结果，尤其是在进行特异表达和诱导表达时，表达水平大多不够理想。
对现有启动子进行改造，构建复合式启动子将是十分重要的途径。
例如，Ni等人将章鱼碱合成酶基因启动子的转录激活区与甘露碱合成酶基因启动子构成了复合启动子，GUS表达结果表示：改造后的启动子活性比35S启动子明显提高。
吴瑞等人将操作诱导型的PI-II基因启动子与水稻Actinl基因内含子1进行组合，新型启动子的表达活性提高了近10倍（专利）。
在植物基因工程研究中，这些人工组建的启动子发挥了重要作用。
2 增强翻译效率为了增强外源基因的翻译效率，构建载体时一般要对基因进行修饰，主要考虑三方面内容：2.1添加5｀-3｀-非翻译序列许多实验已经发现，真核基因的5｀-3｀-非翻译序列（UTR）对基因的正常表达是非常必要的，该区段的缺失常会导致mRNA的稳定性和翻译水平显著下降。
例如，在烟草花叶病毒（TMV）的126kDa 蛋白基因翻译起始位点上游，有一个由68bp核苷酸组成的Ω元件，这一元件为核糖体提供了新的结合位点，能使Gus基因的翻译活性提高数十倍。
目前已有许多载体中外源基因的5｀-端添加了Ω翻译增强序列。
Ingelbrecht等曾对多种基因的 3｀-端序列进行过研究，发现章鱼碱合成酶基因的3｀-端序列能使NPTII基因的瞬间表达提高20倍以上。
另外，不同基因的3｀-端序列增进基因表达的效率有所不同，例如，rbcS3｀-端序列对基因表达的促进作用比查尔酮合酶基因的3｀-端序列高60倍。
2.2 优化起始密码周边序列虽然起始密码子在生物界是通用的，然而，从不同生物来源的基因各有其特殊的起始密码周边序列。
例如，植物起始密码子周边序列的典型特征是AACCAUGC,动物起始密码子周边序列为CACCAUG，原核生物的则与二者差别较大。
Kozak详细研究过起始密码子ATG周边碱基定点突变后对转录和翻译所造成的影响，并总结出在真核生物中，起始密码子周边序列为ACCATGG时转录和翻译效率最高，特别是-3位的A对翻译效率非常重要。
该序列被后人称为Kozak序列，并被应用于表达载体的构建中。
例如，有一个细菌的几丁质酶基因，原来的起始密码周边序列为UUUAUGG，当被修饰为ACCAUGG，其在烟草中的表达水平提高了8倍。
因此，利用非植物来源的基因构建表达载体时，应根据植物起始密码子周边序列的特征加以修饰改造。
2.3对基因编码区加以改造如果外源基因是来自于原核生物，由于表达机制的差异，这些基因在植物体内往往表达水平很低，例如，来自于苏云金芽孢杆菌的野生型杀虫蛋白基因在植物中的表达量非常低，研究发现这是由于原核基因与植物基因的差异造成了mRNA稳定性下降。
美国Monsanto公司Perlak等人在不改变毒蛋白氨基酸序列的前提下，对杀虫蛋白基因进行了改造，选用植物偏爱的密码子，增加了GC含量，去除原序列下影响mRNA稳定的元件，结果在转基因植株中毒蛋白的表达量增加了30～100倍，获得了明显的抗虫效果。
3 消除位置效应当外源基因被移人受体植物中之后，它在不同的转基因植株中的表达水平往往有很大差异。
这主要是由于外源基因在受体植物的基因组内插入位点不同造成的。
这就是所谓的"位置效应"。
为了消除位置效应，使外源基因都能够整合在植物基因组的转录活跃区，在目前的表达载体构建策略中通常会考虑到核基质结合区以及定点整合技术的应用。
核基质结合区（matrix association region,MAR）是存在于真核细胞染色质中的一段与核基质特异结合的DNA序列。
一般认为，MAR序列位于转录活跃的DNA环状结构哉的边界，其功能是造成一种分割作用，使每个转录单元保持相对的独立性，免受周围染色质的影响。
有关研究表明，将MAR置于目的基因的两侧，构建成包含MAR-gene-MAR结构的植物表达载体，用于遗传转化，能明显提高目的基因的表达水平，降低不同转基因植株之间目的基因表达水平的差异，减少位置效应。
例如，Allen等人研究了异源MAR（来自酵母）和同源MAR（来自烟草）对Gus基因在烟草中表达的影响，发现酵母的MAR能使转基因表达水平平均提高12倍，而烟草本身的MAR能使转基因的表达水平平均提高60倍。
使用来源于鸡溶菌酶基因的MAR也可起到同样作用。
另一可行的途径是采用定点整合技术，这一技术的主要原理是，当转化载体含有与寄主染色体同源的DNA片段时，外源基因可以通过同源重组定点整合于染色体的特定部位。
实际操作时首先要分离染色体转录活性区域的DNA片段，然后构建植物表达载体。
在微生物的遗传操作中，同源重组定点整合已成为一项常规技术，在动物中外源基因的定点整合已获得成功，而在植物中除了叶绿体表达载体可实现定点整合以外，细胞核转化中还很少有成功的报道。
4 构建叶绿体表达载体为了克服细胞核转化中经常出现的外源基因表达效率低，位置效应及由于核基因随花粉扩散而带来的不安全性等问题，近几年出现的一种新兴的遗传转化技术--叶绿体转化，正以它的优越性和发展前景日益为人们所认识并受到重视。
到目前为止，已在烟草、水稻、拟南芥、马铃薯和油菜（侯丙凯等，等发表）5种植物中相继实现了叶绿体转化，使得这一转化技术开始成为植物基因工程中新的生长点。
由于目前多种植物的叶绿体基因组全序列已被测定，这就为外源基因通过同源重组机制定点整合进叶绿体基因组奠定了基础，目前构建的叶绿体表达载体基本上都属于定点整合载体。
构建叶绿体表达载体基本上都属于定点事例载体。
构建叶绿体表达载体时，一般都在外源基因表达盒的两侧各连接一段叶绿体的DNA序列，称为同源重组片段或定位片段（Targeting fragment）。
当载体被导入叶绿体后，通过这两个片段与叶绿体基因组上的相同片段发生同源重组，就可能将外源基因整合到叶绿体基因组的特定位点。
在以作物改良为目的的叶绿体转化中，要求同源重组发生以后，外源基因的插入既不引起叶绿体基因原有序列丢失，又不致于破坏插入点处原有基因的功能。
为满足这一要求，已有的工作都选用了相邻的两个基因作为同源重组片段，例如rbcL/accD，16StrnV/rpsl2rps7,psbA/trnK,rps7/ndhB。
当同源重组发生以后，外源基因定点插入在两个相邻基因的间隔区，保证了原有基因的功能不受影响。
最近，Daniel等利用烟草叶绿体基因trnA和trnI作为同源重组片段，构建了一种通用载体（universal vector）。
由于trnA和trnI的DNA 序列在高等植物中是高度保守的，作者认为这种载体可用于多种不同植物的叶绿体转化。
如果这种载体的通用性得到证实，那么这项工作无疑为构建方便而实用的新型叶绿体表达载体提供了一个好的思路。
由于叶绿体基因组的高拷贝性，定点整合进叶绿体基因组的外源基因往往会得到高效率表达，例如McBride等人首次将Bt CryIA(c)毒素基因转入烟草叶绿体，Bt毒素蛋白的表达量高达叶子总蛋白的3%～5%，而通常的核转化技术只能达到0.001%～0.6%。
最近，Kota等将Bt Cry2Aa2蛋白基因转入烟草转入烟草叶绿体，也发现毒蛋白在烟草叶子中的表达量很高，占可溶性蛋白的2%～3%，比细胞核转化高出20～30倍，转基因烟草不仅能抗敏感昆虫，而且能够百分之百地杀死那些产生了高抗性的昆虫。
Staub等最近报道，将人的生长激素基因转入烟草叶绿体，其表达量竟高达叶片总蛋白的7%，比细胞核转化高出300倍。
这些实验充分说明，叶绿体表达载体的构建和转化，是实现外源基因高效表达的重要途径之一。
5 定位信号的应用上述几种载体优化策略主要目的是提高外源基因的转录和翻译效率，然而，高水平表达的外源蛋白能否在植物细胞内稳定存在以及积累量的多少是植物遗传转化中需要考虑的另一重要问题。
近几年的研究发现，如果某些外源基因连接上适当的定位信号序列，使外源蛋白产生后定向运输到细胞内的特定部位，例如：叶绿体、内质网、液泡等，则可明显提高外源蛋白的稳定性和累积量。
这是因为内质网等特定区域为某些外源蛋白提供了一个相对稳定的内环境，有效防止了外源蛋白的降解。
例如，Wong等将拟南芥rbcS亚基的转运肽序列连接于杀虫蛋白基因之前，发现杀虫蛋白能够特异性地积累在转基因烟草的叶绿体内，外源蛋白总的积累量比对照提高了10～20倍。
最近，叶梁、宋艳茹等也将rbcS亚基的转运肽序列连接于PHB合成相关基因之前，试图使基因表达产物在转基因油菜种子的质体中积累，从而提高外源蛋白含量。
另外，Wandelt等和Schouten 等将内质网定位序列（四肽KDEL的编码序列）与外源蛋白基因相连接，发现外源蛋白在转基因植物中的含量有了显著提高。
显然，定位信号对于促进蛋白质积累有积极作用，但同一种定位信号是否适用于所有的蛋白还有待于进一步确定。
6 内含子在增强基因表达方面的应用内含子增强基因表达的作用最初是由Callis等在转基因玉米中发现的，玉米乙醇脱氢酶基因（Adhl）的第一个内含子（intron 1）对外源基因表达有明显增强作用，该基因的其他内含子（例如intron8,intron9）也有一定的增强作用。