载体构建介绍
重组载体构建的方法和步骤
重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。
在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。
下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。
一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。
在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。
同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。
二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。
线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。
三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。
目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。
这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。
四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。
转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。
转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。
五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。
筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。
六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。
常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。
通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。
七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。
通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。
表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。
表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。
载体构建的原理及方法
载体构建的原理及方法
构建空间载体的原理及方法
一、基本原理
1、空间载体指的是能够携带、分配和转换信息的空间物体，可以将物理性能及计算机性能有效整合，进而实现数字与空间信息的融合，改变传统空间计算的构建方式，提高智能化水平，构建具有计算、存储和传输能力的空间系统。
2、空间载体的建构需要涉及到计算机软件、固体件和结构系统，而且各个领域不同，其构建即需考虑这些各种领域以及它们之间的耦合关系，以及服务体系结构、过程完整性、持续性等要素，实现价格、质量和效率协调综合利益最大化。
二、构建方法
1、软件设计
首先，软件设计是建构空间载体的重要环节，应该根据系统的需求特性，选择合适的架构设计，其中应包含各种功能模块的搭建、服务的封装、调用的接入以及模块之间的精心设计。
2、硬件设计
其次，空间载体的硬件设计也相当重要，通常包括硬件组件的搭建、驱动功能的设计和配置建立以及通信模块的配置，以此实现基于现有硬件设备的实体构建，使之达到最佳的可拓展性、可弹性扩展性以及故障检测和防御能力。
3、系统服务
系统服务是构建空间载体的核心，通常要包含空间服务、计算服务和通信服务，以及可靠性、安全性等服务，在这一环节需要确定各种服务细节，在确定之后可以根据模块分工，完善各种服务细节，从而顺利完成整个系统的建构。
4、联合优化
最后，联合优化应作为构建空间载体的最后重要环节，要在各个领域的计算、存储等资源进行综合优化，从而获得可靠性最高、计算能力最大、实现统一优化目标的服务框架，使得服务能够在满足系统特性要求的同时，达到客户对服务的期望。
1 载体构建流程
目录
载体构建概念 01 02 载体构建原理
载体构建流程 03 载体构建拓展 05
04 载体构建结果
01
载体构建概念
Ø载体构建的概念
载体构建的概念
酶切
连接
酶切
转化
鉴定
载体构建：在基因工程中，将能进入细胞、在装载了外来的NA片段后仍能照样复 制的运载体称为载体，常用的载体是人工构建的质粒。载体构建即是构建含外源 DNA的质粒，将其导入到宿主细胞并能正常复制和表达的过程。
05
载体构建拓展
Ø载体构建新技术
载体构建新技术
片段1
同源臂 片段3
同源臂
片段2
片段1
外切酶，50℃
片段3
片段2
50℃退火，外切酶逐渐失活
片段1
片段3 50℃连接酶修补切口
片段2
片段1
片段3
片段2
无缝克隆：载体末端和引物末端具有15-20个同源碱基，由此得到的PCR产物两端便分别带上了15-20个 与载体序列同源性的碱基，依靠碱基间作用力互补配对成环，无需酶连即可直接用于转化宿主菌，进入宿 主菌中的线性质粒(环状)依靠自身酶系将缺口修复。
目的条带
凝胶成像
电泳图
纯化PCR产物
目的条 带凝胶
含DNA 的结合液
离心
离心
离心
高纯度DNA
结合液60℃，
结合
10min
洗涤
洗脱
酶切与连接
AluⅠ
目的片段
BamHⅠ
目的片段
酶切
HaeⅢ
酶切
EcoRⅠ
平末端
粘性末端
22℃，T4 DNA 连接酶催化，连 接2h
引物设计和载体构建知识点
引物设计和载体构建知识点引物设计和载体构建是分子生物学中重要且基础的实验技术，它们在基因克隆、基因组编辑等方面起到了不可替代的作用。
本文将对引物设计和载体构建的相关知识点进行介绍。
一、引物设计引物是指在PCR等实验中用于扩增特定DNA片段的短寡核苷酸序列。
一个好的引物设计能够确保PCR扩增的特异性和高效性。
1. 引物长度引物的长度通常在18-30个碱基对之间，过短的引物可能导致扩增非特异性产物，而过长的引物则可能降低扩增效率。
2. 引物序列引物序列应该与目标DNA片段的序列互补，并且避免二聚体和头部稳定性等问题。
同时，还要注意避免引物内部和引物之间的序列相互互补。
3. 引物的Tm值引物的Tm值是指引物与目标DNA片段结合的解离温度。
引物的Tm值应该在50-65摄氏度之间，以确保引物的特异性和高效性。
4. 引物的GC含量引物的GC含量直接影响引物的稳定性和特异性。
过高或过低的GC含量可能导致非特异性扩增产物的生成。
通常情况下，GC含量在40-60%之间较为理想。
二、载体构建载体是指在基因工程中用于携带外源DNA片段并将其导入到宿主细胞中的分子。
载体构建是基因克隆和基因组编辑等实验的基础。
1. 选择合适的载体选择合适的载体是载体构建的第一步。
常用的载体包括质粒、病毒和噬菌体等。
根据实验需要选择合适的载体，例如质粒常用于DNA片段的克隆和表达，而病毒则常用于基因传递和基因治疗。
2. 载体的线性化和限制酶切线性化载体有助于DNA片段的插入和连接。
通过使用适当的限制酶对载体进行切割，生成具有完整黏性末端的线性载体。
3. DNA片段的连接将目标DNA片段与线性载体进行连接，一般采用DNA连接酶或者DNA ligation kit。
连接后的载体能够稳定地携带外源DNA片段。
4. 载体的转化和筛选将构建好的载体导入到宿主细胞中，通过培养基中的选择性抗生素或者其他筛选方法选择具有外源DNA片段的转化子。
总结：引物设计和载体构建是分子生物学实验中的重要环节，它们对于基因克隆、基因组编辑等研究具有重要意义。
载体构建介绍
1.2载体的功能
运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力 为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件
具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点 具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
3.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真酶 进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
1.2载体的分类
克隆载体
植 物 基 中间载体 因 工 程 卸甲载体 载 体
表达载体ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
一元表达载体 双元表达载体
1.2载体分类
克隆载体
可携带出入的外源 DNA片段并可转入受体 细胞中大量扩增的DNA 分子。通常含有筛选 标记，在插入外源的 基因的时候不会破坏 载体本身的自我复制 功能。
1.2载体分类
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体
野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期TDNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因Onc， 将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为卸甲载 体。
1.2载体分类
双元表达载体
一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗性 基因蛋白）的普通表 达载体。另一个载体 就是双元表达载体。
构建载体原理
构建载体原理
构建载体是指在特定的环境中，通过合适的材料和工艺，将所
需的物质或信息载载体上，实现其稳定传输和存储的过程。
构建载
体的原理是基于材料科学、物理学和工程学等多学科的知识，通过
对材料特性和工艺技术的理解和应用，实现对载体的设计、制备和
应用。
首先，构建载体的原理基于材料的选择和设计。
在构建载体的
过程中，首先需要选择合适的材料作为载体的基础，这需要根据所
需载体的特性和使用环境的要求进行综合考虑。
材料的选择应考虑
其稳定性、导热性、导电性、机械性能等因素，以确保载体在使用
过程中能够稳定传输和存储物质或信息。
其次，构建载体的原理还涉及到载体的结构设计和工艺制备。
在确定了载体所采用的材料后，需要进行结构设计和工艺制备，以
实现对载体的形态和性能的控制。
结构设计包括载体的形状、尺寸、表面特性等方面的考虑，工艺制备则包括材料加工、组装、表面处
理等过程，通过这些步骤，可以实现对载体性能的调控和优化。
最后，构建载体的原理还包括对载体的使用和维护。
一旦载体
制备完成，需要对其进行实际使用和维护，以确保其稳定性和可靠性。
在使用过程中，需要注意载体的环境适应性、耐久性、安全性
等方面的问题，并进行必要的维护和保养，以延长载体的使用寿命
和提高其性能。
总之，构建载体的原理是基于材料科学和工程技术的综合应用，通过对材料特性和工艺技术的理解和应用，实现对载体的设计、制
备和应用。
只有在充分理解和掌握构建载体的原理的基础上，才能
够实现对载体的有效控制和应用，从而满足不同领域的需求。
构建载体的方法和原理
构建载体的方法和原理宝子，咱今天来唠唠构建载体这事儿。
构建载体呢，有一些常见的方法。
比如说酶切连接法。
这就像是玩拼图一样呢。
我们有目标的基因片段，还有载体，就像两块拼图。
我们用特定的限制性内切酶把载体切开，就像在载体这个大拼图上弄出个合适的形状。
然后呢，把我们想要的基因片段也处理一下，让它的两端能和载体切开后的部分完美匹配。
再用DNA连接酶把它们连接起来，就像把两块拼图牢牢地粘在一起啦。
这个原理其实就是利用了酶的特异性，内切酶能识别特定的核苷酸序列，然后在特定的位置把DNA切开，连接酶又能把有相同末端的DNA连接起来。
还有一种是同源重组法。
这就有点像找亲戚搭伙过日子呢。
我们要把目的基因和载体放在一起，它们有些部分是同源的，就像有共同的家族特征一样。
在一些特殊的酶或者细胞环境的作用下，它们就会按照同源的部分进行重组，把目的基因整合到载体里面。
这个方法很巧妙，不需要像酶切连接法那样严格的末端匹配，只要有同源的部分就能完成重组。
另外呢，还有一种叫做 Gateway技术的构建载体方法。
这个就有点像走特殊通道啦。
它有专门的一套体系，有供体载体、目的基因和目的载体。
先把目的基因克隆到供体载体上，然后通过一种特殊的重组反应，就像通过一个特殊的门一样，把目的基因转移到目的载体上。
这种方法速度比较快，而且准确性也比较高呢。
构建载体的原理呀，总的来说就是要把我们想要的基因片段按照我们的想法整合到一个合适的载体里面。
这个载体就像一个小车子，可以带着基因片段到我们想要它去的地方，比如说把基因送到细胞里面，让细胞按照我们的想法生产出特定的蛋白质之类的。
这在基因工程里可是超级重要的步骤呢，就像盖房子打地基一样，没有构建好载体，后面好多关于基因操作的事儿都没法好好进行啦。
宝子，你现在是不是对构建载体有点感觉了呀 。
载体构建介绍说明
02
载体构建的方法和技术
基因克隆技术
基因克隆技术是载体构建的基础， 通过该技术可以将目的基因从原 始DNA中提取出来，并进行复
制和扩增。
该技术包括限制性核酸内切酶、 DNA连接酶等关键酶的作用， 以及质粒、噬菌体等克隆载体的
应用。
基因克隆技术能够将目的基因高 效地转移到受体细胞中，为后续 的基因表达和功能研究奠定基础。
酶切与连接技术
酶切技术是指利用限制性核酸内切酶对DNA进行切割，得到具有特定黏性末端的片 段。
连接技术则是将两个或多个DNA片段通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成完整 的基因表达载体。
酶切与连接技术是载体构建过程中必不可少的步骤，能够将目的基因与载体进行重 组，从而构建出能够表达目的基因的表达载体。
疫苗研发
载体构建也可用于疫苗研发，通过将 病原体的抗原基因导入细胞或组织， 诱导机体产生免疫反应，从而达到预 防和治疗疾病的目的。
基因编辑领域
CRISPR-Cas系统
载体构建在基因编辑领域中常用于CRISPR-Cas系统的构建和优化，通过将sgRNA和Cas9蛋白导入细胞，实现基 因敲除、敲入和定点突变的精准编辑。
基因治疗应用
载体构建在基因治疗中广泛应用于遗传性疾病、肿瘤、感染性疾 病等的治疗，通过将正常基因导入病变细胞，纠正或补偿缺陷基 因，达到治疗目的。
生物制药领域
药物研发
载体构建在生物制药领域中用于药物 研发，通过将药物基因或调节基因导 入细胞或组织，调控药物的表达和分 泌，提高药物的疗效和降低副作用。
载体构建的基本步骤
载体构建的基本步骤载体构建是分子生物学研究中不可或缺的过程，它涉及到将目标基因或蛋白质序列移植到不同的载体中，以便扩大其表达量、纯化和研究。
本文将介绍载体构建的基本步骤，包括质粒的选择、PCR扩增、连接和转化等过程。
质粒的选择质粒是最常用的载体类型之一，具有很多优点，如易于扩增、转化和操纵等。
在选择质粒时，需要考虑以下几个方面：1. 质粒大小和拷贝数质粒的大小和拷贝数会影响其扩增和表达，选择适当大小和拷贝数的质粒可以提高表达效率。
2. 基因水平选择标记质粒中常含有基因水平选择标记，如抗生素耐药基因等。
在构建载体时需要选择合适的标记，以便快速筛选到表达了目标基因的细胞。
3. 表达宿主质粒可以在不同的宿主中表达，选择合适的表达宿主可以提高表达效率和纯度。
常见的表达宿主包括大肠杆菌、酵母等。
PCR扩增PCR扩增是将目标序列扩增为质粒中适当长度的过程。
在进行PCR扩增之前，需要准备以下试剂和设备：•Taq DNA聚合酶•原始模板DNA•引物•正向引物和反向引物•dNTP混合物•PCR缓冲溶液在PCR扩增中，需要设置合适的反应体系和程序。
常见的PCR反应条件为：•94℃，5 min：初始变性•94℃，30 s：变性•50-60℃，30 s：退火•72℃，1 min/kb：延伸•72℃，7 min：最终延伸连接连接是将PCR扩增产物与质粒DNA连接的过程。
连接反应需要用到T4 DNA连接酶和DNA PCR产品凝胶提取试剂盒等试剂，具体操作步骤如下：1.将PCR扩增产物切割至合适长度。
2.提取PCR产物，并使用DNA PCR产品凝胶提取试剂盒纯化。
3.连接酶在37℃下反应数小时。
4.连接反应后，在大肠杆菌中进行转化。
转化转化是将连接成功的PCR产物转化为大肠杆菌的过程。
转化需要用到大肠杆菌、新鲜的LB培养基和适当的抗生素等试剂。
常见的转化条件为：80-90秒高温热冲击，加入细胞后在37℃，250rpm振荡培养1小时后添加适宜浓度的抗生素进行筛选。
载体构建简介
载体构建SOP载体构建(vectorconstruction)，为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。
理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。
载体构建即是构建含外源DNA的质粒。
载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。
主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。
载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。
原核重组表达常用载体构建策略有多种选择，（1）常用的酶切连接是较为广泛使用的克隆技术，主要优点是技术稳定，缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的失败，如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，需特别留意的是基因内部不能有与上述相同的酶切位点；（2）同源重组是目前流行的克隆技术。
同源重组（Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。
该技术可以任意载体任意基因片段快速实现多片段长片段定点定向克隆，最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，将目的片段和线性载体按照一定比例混合后，在重组酶的作用下即可发生重组，本实验室常用37℃的温度，30min反应即可完成。
一、目的载体进行双酶切（一）实验准备1.实验材料：质检合格的目的载体。
2.试剂与耗材：buffer，ddH2O，琼脂糖（Spain，9012-36-6）、TBE缓冲液、PCR 管（国产，81245）、1.5ml离心管（国产）、枪头（国产）、Axygen AxyPrep PCR cleanup Kit(Axygen，AP-PCR-250)、限制性内切酶A、限制性内切酶B。
3.仪器与设备：PCR仪（杭州博日，TC-96/G/H（b）A）、mini离心机（其林贝尔，LX600）、电泳槽（北京君意，JY-SPCT）、凝胶成像仪（Bio-rad，GelDoc/ChemiDocuniversal hood II）、分光光度计（天根，OSE-260-01）。
《载体构建流程》课件
案例三：物联网设备中的载体应用
要点一
总结词
要点二
详细描述
物联网设备中的载体构建主要关注设备的物理设计、通信 协议和数据传输等方面。
在物联网设备中，载体构建涉及设备的外观设计、内部结 构、通信协议选择和数据传输方案等。一个优秀的物理设 计能够确保设备的稳定性和耐用性；合理的通信协议选择 能够提高设备间的通信效率和稳定性；而高效的数据传输 方案则能够确保设备收集的数据能够及时准确地传输到中 心服务器进行处理。
使用调试技术定位和解决 载体构建过程中的错误和 异常，确保载体的稳定性 和可靠性。
04
载体构建的实际应用案例
案例一：网站建设中的载体应用
总结词
网站建设是载体构建的重要应用领域，通过合理的架构设计和内容规划，能够提高网站的可用性和用户体验。
详细描述
在网站建设中，载体构建主要涉及网站的页面设计、布局、导航、内容组织等方面。通过合理的页面设计，可以 提升网站的视觉效果和吸引力；合理的布局和导航设计，可以提高用户浏览和查找信息的效率；而合理的内容规 划，则能够确保网站提供的信息具有价值，满足用户需求。
载体制作
编程实现
根据设计稿，使用编程语言和工 具实现载体功能。
素材准备
准备所需的图片、音频、视频等 素材，确保内容质量。
测试与调试
在制作过程中，对载体进行测试 和调试，确保功能正常。
载体测试
功能测试
对载体的各项功能进行测试，确保其正常工作。
兼容性测试
测试载体在不同操作系统、浏览器等环境下的兼 容性。
案例四：游戏开发中的载体应用
总结词
游戏开发中的载体构建主要关注游戏画面的表现力、操 作体验和游戏机制等方面。
详细描述
表达载体构建
表达载体构建1. 背景介绍表达载体是在分子生物学领域中广泛使用的工具，用于将目标基因导入宿主细胞中并使其表达。
构建高效的表达载体对于基因功能研究和基因工程应用具有重要意义。
本文将介绍表达载体的构建方法及其在基因表达中的应用。
2. 表达载体的构建方法构建表达载体的一般步骤包括选择合适的载体骨架、选择适当的启动子和终止子、插入目标基因序列以及进行转染或转化等操作。
下面将详细介绍表达载体的构建方法。
2.1 选择合适的载体骨架常用的载体骨架包括质粒和病毒载体。
质粒是可以在细菌中复制的DNA分子，通常由起始位点、选择标记和多个限制酶切位点组成。
病毒载体包括腺病毒、慢病毒等，具有高效转染特性。
选择适合自己研究的载体骨架是表达载体构建的第一步。
2.2 选择适当的启动子和终止子启动子是基因表达的起始信号，终止子是基因表达的终止信号。
启动子的选择应根据目标基因的表达需求和宿主细胞的特性进行。
常用的启动子包括强启动子（如CMV启动子）、组织特异性启动子等。
终止子则可以选择常规的转录终止信号。
2.3 插入目标基因序列选择合适的酶切位点，在载体DNA上进行限制性内切酶切割，并将目标基因序列与载体连接。
连接的方法可以是经典的限制性酶切连接、PCR扩增连接、Ligase连接等。
连接完成后，应进行酶切鉴定和测序验证，确保目标基因序列插入准确。
2.4 进行转染或转化将构建好的表达载体导入宿主细胞中，实现基因表达。
转染方法包括化学转染、电穿孔转染、病毒介导转染等，转化方法包括细菌的电转化、植物的农杆菌介导转化等。
3. 表达载体的应用表达载体广泛应用于基因功能研究和基因工程应用，具有重要的实验意义和应用前景。
3.1 基因功能研究通过表达载体，可以实现外源基因的高效表达，进而研究基因的功能、调控机制等。
比如可以通过表达载体将目标基因在细胞中过度表达或进行基因敲除等，来研究该基因在细胞或生物体中的功能。
3.2 基因治疗表达载体在基因治疗中具有重要的应用价值。
载体构建方法
载体构建方法
载体构建方法是指通过合适的技术手段，创建出用于携带DNA等遗传物质的载体。
常见的载体包括质粒、噬菌体、大肠杆菌、酵母等微生物，以及病毒等。
以下是一些常用的载体构建方法：
1. 质粒构建方法：质粒是一种环状DNA分子，可用于携带外源DNA。
通常采用PCR扩增和限制性酶切等技术将外源DNA插入到质粒中，然后转化到宿主细胞中。
2. 噬菌体构建方法：噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的噬菌体构建方法包括重组噬菌体技术和噬菌体展示技术等。
3. 大肠杆菌构建方法：大肠杆菌是一种常见的细菌，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的大肠杆菌构建方法包括转化、电转化、化学转化等。
4. 酵母构建方法：酵母是一种单细胞真核生物，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。
常用的酵母构建方法包括转化、电转化、融合等。
5. 病毒构建方法：病毒是一种寄生于细胞的微生物，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。
常用的病毒构建方法包括重组病毒技术、腺病毒技术、AAV技术等。
以上是一些常见的载体构建方法，不同的载体构建方法适用于不同的实验需求。
在选择合适的载体构建方法时，需要考虑到载体的稳定性、转化效率、表达效率等因素。
载体构建详解
PCR得到目的基因
刚开始摸条件时， 都会先做一个梯 度PCR，选出最 适条件。 由于此步为获 取正确的目的基 因，所以尽量避 免PCR的突变格 外重要。其中所 采取的措施有： 使用高保真酶、 循环次数控制在 20cycle左右、引 物设计合理等。
高温变性 低温退火 适温延伸 温 度 72 （℃）
1
载体构建流程cdna提取mrna得到目的基因rtpcrpcr产物纯化酶切目的基因和载体纯化酶切产物连接转化菌落pcr挑取阳性克隆去测序测序正确的摇菌提质粒导入表达宿主测试表达情况获取目的基因序列http
载体构建流程详解
I 载体构建流程
提取mRNA
RT PCR
cDNA
得到目的基因
PCR产物纯化
菌落PCR
转化
连接
纯化酶切产物
酶切目的基因和载体
保菌
挑取阳性克隆去测序
测序正确的摇菌提质粒 导入表达宿主
测试表达情况
获取目的基因序列
引物设计相关软件
引物设计（primer 5.0、Oligo 6）
序列比较（DNASTAR、Omiga）
转化
基本步骤： （1）将100μl感受态细胞于冰上解冻。 （2）取5μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以 混匀内容物。 在冰上放置30分钟。 （3）将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将 管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。 （4）每管中加700μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行 复苏。 （5）室温4,000rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100μl 培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面。注意： 细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。 （6）将平板置于室温直至液体被吸收。 （7）倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。
载体构建
载体构建载体构建所需条件：作为重组基因的载体，1，必须能够在宿主细胞中复制，使重组基因能够在宿主基因中复制，从而稳定保存下来，这是作为运载体的必须条件。
2.具有多个限制酶切点，从而可以使不同的粘性末端与之相连，增强实用性3.拥有标记基因是为了方便质粒进入宿主细胞后容易被检测出来，以便检测目的基因是否导入受体。
下面说说载体所需的序列结构目的基因就是能够产生所需蛋白质的DNA片段，比如抗虫棉就是植入能产生抗虫蛋白的目的基因。
启动子、终止子：启动子、终止子是目的基因DNA上特殊排序的碱基。
RNA从启动子开始转录、翻译，到终止子结束。
整个过程完成后便产生所需蛋白质。
如果不清楚RNA的转录翻译过程，可以再细说。
标记基因：用于检测是否已经植入目的基因。
植入的成功率其实很低，所以有必要选出已经植入的个体。
比如抗虫棉，判断是否植入，用种植后让虫子吃的方法判断周期太长。
所以在目的基因前或后植入比如抗四环素基因（如果目的基因成功植入，抗四环素基因也一起植入），然后用四环素来淘汰植入失败的个体，剩下的都是还有目的基因的个体。
除了抗四环素基因，还有荧光基因等，总之就是方便检测。
如果构建成功，就会破坏了原来位于该“特定启动子”和“终止子”之间的四环素抗性基因，即“目的基因－载体连接物”不具有四环素抗性。
又因为青霉素抗性基因在该特定启动子和终止子之外，无论构建是否成功，都不会影响青霉素的抗性。
综上，“目的基因－载体连接物”的受体细胞具有青霉素抗性但不具有四环素抗性。
因此，可以首先利用青霉素抗性筛选出全部连接产物（在青霉素抗性培养基上可以存活），然后再利用四环素抗性进行筛选剔除“载体－载体连接物”（这种连接没有破坏原有的四环素抗性）。
也就是说所有既抗青霉素又抗四环素的都丢掉，只留下只抗青霉素不抗四环素的克隆。
takara的DNA ligation kit ver.2.1很好用，每次反应：vector 一微升，DNA片段一微升，两微升的那个试剂盒的solution 1，连接半个小时就行了。
载体构建原理
载体构建原理
载体构建原理指的是一种基于特定结构的方法，通过构建一个可用于携带、传递或触发特定信息、物质或能量的载体，以达到特定目的的技术或方法。
在载体构建的过程中，通常需要考虑以下几个方面的设计原则：
1. 材料选择：选择合适的基础材料来构建载体，这些材料应具有所需的物理、化学或机械性能，以满足特定的使用要求。
2. 结构设计：根据需要，设计载体的形状、大小和内部结构。
这些设计应考虑使用环境，以及所需的载体承载能力、稳定性和灵活性。
3. 功能添加：根据具体需求，在载体中添加特定的功能单元或组件，以实现所需的信息、物质或能量的携带、传递或触发。
这些功能单元可以是化学传感器、生物分子、电路元件等。
4. 检测与控制：设计合适的检测和控制系统，以监测和调节载体所携带、传递或触发的信息、物质或能量。
这些系统可以是传感器、反馈回路、控制电路等。
5. 优化与改进：通过实验、模拟或理论分析等方法，不断优化和改进载体的性能和功能。
这可以包括调整材料组成、优化结构设计、改进传输效率等。
通过以上的设计原则和方法，可以构建出各种类型的载体，如
纳米粒子、纤维素基质、基因载体等。
这些载体可以应用于药物传递、生物传感、能源存储等领域，为科学研究和技术应用提供了重要的工具和平台。
质粒载体构建原理
质粒载体构建原理
质粒载体构建原理是通过将目标基因插入质粒中，然后将质粒转化到适当的宿主细胞中，使质粒在宿主细胞中复制和表达目标基因。
质粒载体通常由数千到数百万碱基对组成的双链DNA构成，具有自主复制和表达功能。
构建质粒载体的过程主要分为以下几个步骤：
1. 选择合适的质粒：根据实验需要选择合适的质粒，常用的质粒包括pUC18和pBR322等。
2. 提取质粒DNA：通过DNA提取方法从大肠杆菌等质粒存在的细菌中提取质粒DNA。
3. 制备目标基因DNA：从适当的源中提取目标基因的DNA
序列，常用的方法有PCR扩增、酶切和合成等。
4. 质粒和目标基因DNA连接：通过DNA连接酶将质粒DNA 和目标基因DNA连接起来，形成重组质粒。
5. 转化宿主细胞：将重组质粒转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌等。
6. 筛选正常质粒：通过添加适当的抗生素等筛选条件，筛选出携带目标基因的正常质粒。
7. 质粒扩增：将筛选得到的正常重组质粒进行扩增，得到足够量的质粒。
8. 表达目标基因：将扩增得到的质粒转化到目标宿主细胞中，通过细胞内转录和翻译过程，使得目标基因得以表达。
通过以上步骤，可以成功构建质粒载体，将目标基因插入其中，并实现在宿主细胞中的表达。
这为基因工程研究和生物技术应用提供了重要的平台。
分子生物学技术和载体构建
分子生物学技术和载体构建分子生物学技术是现代生物学研究中的重要工具，因为它可以用于研究生物分子的结构和功能，从而可以帮助人们更好地理解和探索生命的本质。
其中最常用的技术之一就是载体构建。
载体构建是指将DNA片段或基因插入特定的细胞或组织中的过程。
通常，载体是指一种特殊的DNA序列，它能够携带外源DNA片段并将其转导到宿主细胞内。
常用的载体包括质粒、病毒、细胞色素等。
在载体构建中，最常见的方法是克隆技术。
克隆技术是一种可以在体外合成和操作DNA分子的技术，它涉及重组DNA分子，从而生成新的DNA序列。
克隆技术主要有四个步骤：1)DNA分子的制备和剪切；2)载体的制备和切割；3)连接DNA分子和载体；4)将重组的DNA片段转导至宿主细胞内。
克隆技术中最基本的部分是限制酶切割。
限制酶是一种酶，它可以切割双链DNA分子，从而产生具有黏性末端的断裂末端。
这些黏性末端可以与其他黏性末端互补，并通过连接构建出新的DNA序列。
载体制备和切割是另一个关键步骤。
常用的载体包括质粒、病毒等。
质粒是一种环状的DNA分子，它可以自重复复制并携带外源DNA片段。
切割质粒通常使用限制酶，以产生具有黏性末端的质粒。
通过这种方法，外源DNA片段可以与黏性末端连接起来，从而构建出新的质粒。
连接DNA分子和载体是分子克隆技术中的另一个重要步骤。
这可以通过酶切操作和DNA连接酶来完成。
DNA连接酶是一种酶，它能够将不同的DNA分子连接起来，从而构建出新的DNA序列。
连接后的DNA序列可以重组，生成新的DNA片段，也可以被插入到特定的载体中。
将重组的DNA片段转导至宿主细胞内是最后一步。
该过程通常是通过电击、热休克和化学处理来完成。
这些过程可以改变细胞膜的通透性，并允许DNA片段进入细胞内。
在一些情况下，还可以使用特殊的病毒载体，将DNA片段直接注射到宿主细胞内。
综上所述，载体构建是分子生物学研究中至关重要的技术。
它可以通过重组DNA分子产生新的DNA序列，并将其插入到特定的细胞或组织中。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
5.常见问题
选择标记类型和选择 1、选择性标记类型 药物抗性（如Kan，Amp等） 营养依赖性标记（如SC-Leu 等） 2、如何选择 根据所选载体上所带的标记
5.常见问题
Gateway系统引物设计-需要对读码框
这是因为中间载体和终载体上某些编码氨基酸或者抗性 基因同目的片段共用一个起始密码子。
载体构建
戎浩 2015.12
C
ONTENTS
目录
1 2 3 4
载体简介 载体构建
注意事项 常见问题
1.载体简介
目的基因的克隆与鉴定
ห้องสมุดไป่ตู้
生理检测 纯化
载体构建
大肠转化，质粒 提取与鉴定
移栽
分子检测
继代繁殖 农杆菌的转化与活化
外植体制备
筛选
浸
染
共培养
1.1载体
载体（vector） ，能将外源DNA或基因片段携带入 宿主细胞内的一个具有自我复制能力的DNA分子。
退火温度不合适，设置梯度，选择最适退火温度
2、条带不单一
引物不特异，适当增长引物序列长度；
适当提高退火温度
5.常见问题
载体酶切的问题 1、酶切质粒浓度和纯度要好 2、酶切温度和时间
如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在
用另一个酶切，时间最好过夜切。 3、没有切开 可能是酶失活，建议酶切时增加阳性对照，确定酶是 否好用
5.常见问题
克隆基因的酶切位点及引物问题 1、单酶切 单酶切后进行连接，质粒自连、目的片段自连、目的
片段之间连接、目的片段和载体各种错误连接、目的片段
反向连接等等，尽量不选单酶切 2、保护碱基数目的问题。 在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保 护碱基，这会使得酶切效率大大提高。
5.常见问题
5.常见问题
连接过程中的问题 1、连接时间和温度：一般16℃，2个小时就可以了，如果后续 实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功
率；
2、未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照 组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的
克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，
中间载体
1.2载体分类
卸甲载体 野生型的Ti质粒不能直接作为基因工程的载体，期 T-DNA区存在一段阻碍细胞分化和植株再生的基因 Onc，将其切除，即“解除”其“武装”，因此称为 卸甲载体。
1.2载体分类
双元表达载体 一般植物表达载体 是成套使用的，一套 中有两个，一个是带 有可以供插入外源表 达基因的MCS和筛选 标签的融合蛋白（通 常是GFP，GUS或抗 性基因蛋白）的普通 表达载体。另一个载 体就是双元表达载体。
1.2载体的功能
运送外源基因高效的转入到受体细胞中 为外源基因提供复制能力或整合能力
为外源基因的扩增或表达提供条件
1.3载体应具备的条件
具有对受体细胞的可转移性 具有与特定受体细胞相适应的复制位点或整合位点 具有多种单一的酶切位点
具有合适的选择性标记
2.载体构建（酶切连接）
1.2载体的分类
噬菌体载体 利用噬菌体作载体， 主要是将外来目的DNA 替代或插入中段序列， 使其随左右臂一起包装 成噬菌体，去感染大肠 杆菌，并随噬菌体的溶 菌繁殖而繁殖。
1.2载体的分类
病毒载体 感染动物的病毒可改造用作动物细胞的载体。由于 动物细胞的培养和操作较复杂、花费也较多，因而病 毒载体构建时一般都把细菌质粒复制起始序列放置其 中。使载体及其携带的外来序列能方便地在细菌中繁 殖和克隆，然后再引入真核细胞。 现在人们还在不断寻找新的载体，如叶绿体或线粒体 DNA也有可能成为载体。
目的基因获得 酶切 连接
引物设计
质粒提取
大肠杆菌转化
目的片段扩增
大肠杆菌转化
农杆菌转化
PCR产物纯化
TA克隆
依赖于限制性核酸内切酶，DNA连接酶和其他修饰酶的作用，分
别对目的基因和载体DNA进行适当切割和修饰后，将二者连接在一 起，再导入宿主细胞，实现目的基因在宿主细胞内的正确表达。
2.1目的基因的获得
1.2载体的分类
质粒载体 质粒载体是一种相对分子 质量较小、独立于染色体 DNA之外的环状DNA(一般有 1～200 kb左右)，有的一 个细菌中有一个，有的一 个细菌中有多个。质粒能 通过细菌间的接合由一个 细菌向另一个细菌转移， 可以独立复制，也可整合 到细菌染色体DNA中，随着 染色体DNA的复制而复制。
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真 酶进行目的片段的扩增。（加尾）
3.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
3.5 BP反应
3.6 大肠杆菌转化 3.7 质粒提取
3.8 LR反应
3.9 大肠杆菌转化 3.10 农杆菌转化
3、双酶切引物设计 a、所选的酶切位点必须是载体上的，而目的片段中没 有的。
b、酶切位点不能太近，靠的太近的话，一般只能切开
一个。 c、两个酶切位点最好不要是同尾酶（效果相当与单酶 切）。 d、最好使用相同buffer的酶 e、使用实验室已有的酶
5.常见问题
目的片段的扩增失败 1、无条带 引物设计错误；
2.6 大肠杆菌转化 2.7 质粒提取
2.8 酶切
体系：限制性核酸内切酶 2.5 μL 10 × buffer 5.0 μL 质粒 20 μL 37℃，2h ddH2O to 50 μL 对pMD19-目的基因和表达载体（如PSB130）分别 进行酶切
2.9 连接
体系：T4连接酶 T4 buffer 表达载体 目的片段 0.5 μL 1.0 μL 1.0 μL 7.5 μL
M + -
M + -
5.常见问题
表达鉴定 有的克隆前面的步骤都正确，可就是不表达 1、有的载体质粒为单顺反子，且启动子位于多克隆位点
之后，这种情况要求在扩增目的片段时引物要含有起始密
码子，否则是无法表达出相应蛋白的。 2、注意表达细胞系的状态及转染效率，转染效率可以用 带荧光标签的载体进行检测。
16℃，8h
2.10 大肠肝转化
2.11 农杆菌转化
3.载体构建（同源重组）
目的基因获得 LR反应 大肠杆菌转化
引物设计
质粒提取
农杆菌转化
目的片段扩增
大肠杆菌转化
PCR产物纯化
BP反应
3.1目的基因的获得
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
3.2引物设计
加attB的接头，对读码框
3.3 PCR
4.注意事项
PCR产物可短时间在-20℃保存，使用时可以取出进行后
续实验；
在细胞转化时，冰浴和热激要严格控制好时间； 连接反应是DNA重组过程中的关键步骤，其成败的重要 参数之一就是温度，因此要控制好连接温度。
进行黏末端连接时，会产生一定数量的载体自身环化分子，
导致转化菌中过高的假阳性克隆背景。针对这一问题，常 采用牛小肠碱性磷酸酶（CIP）去掉载体的5’-磷酸以抑制 DNA片段的自身环化。
从NCBI或者相应的数据库，文献等等获得。
2.2引物设计（合适的酶切位点） 2.3 PCR
为获得和目的基因完全相同的序列，一般使用高保真 酶进行目的片段的扩增。（加尾）
2.4 PCR产物纯化
目的片段
琼脂糖凝胶电泳
切胶回收（方法参照试剂盒）
1.避免一些非特性条带 2.防止PCR体系中一些成分对转化的影响
重新酶切，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改 变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可 继续进行后续验证。
5.常见问题
M + - 1 2 3 4
菌落PCR 为了方便发现问题，菌落PCR要设置阳性对照 组（原始目的片段做模板）和阴性对照组（以 双蒸水为模板） 1、多次PCR均无阳性克隆存在 假阳性过高，可能是由于抗性失效，建议换 培养皿； 2、 阴性对照组也有条带 可能是因为引物或其他试剂被模板污染了， 建议跟换试剂，酒精擦拭PCR仪； 3、阳性对照也无条带 酶失活或者其它试剂发生问题或忘记添加， 重 新换试剂PCR鉴定 鉴定为阳性的克隆记得保存原菌液，避免后续 转化过程发生突变而丢失连接成功的克隆。
1.2载体的分类
克隆载体 植 物 基 因 工 程 载 体
中间载体
卸甲载体 一元表达载体
双元表达载体
表达载体
1.2载体分类
克隆载体 可携带出入的外源 DNA片段并可转入受 体细胞中大量扩增的 DNA分子。通常含有 筛选标记，在插入外 源的基因的时候不会 破坏载体本身的自我 复制功能。
1.2载体分类
2.5 TA克隆
聚合酶链反应产物的克隆载体，线性化后两侧3′端各多 出一个脱氧胸苷酸(T)。由于PCR产物两侧3′端通常含单 个脱氧腺苷酸(A)，与T载体（pMD19）之间的A-T互补， 因此称为TA克隆。
体系： T载体 目的片段 Solution I 0.5 μL 4.5 μL 5.0 μL
16℃，8h