DNA重组载体构建

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重组载体构建的方法和步骤

重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体构建是基因工程领域中非常重要的一项技术，它可以用来将特定的基因插入到目标细胞中，实现基因的转移和表达。

在科学研究、医学诊断和治疗等领域中都有广泛的应用。

下面我们来详细介绍一下重组载体构建的方法和步骤。

一、选择载体首先我们需要选择一个适合的载体作为基础，常见的载体有质粒、病毒、原核生物等。

在选择载体时需要考虑载体的大小和特性，以及目标基因的大小和需要表达的水平。

同时还需要考虑载体的复制原点、抗生素抗性基因等相关元件。

二、线性化载体接下来我们需要将选择的载体进行线性化处理，以便将目标基因插入到载体中。

线性化可以通过受控的限制酶酶切处理来实现，将载体的环状DNA骨架切割成线性DNA片段。

三、插入目标基因将目标基因与线性化的载体进行连接。

目前常用的方法包括：内切酶切割连接法、PCR扩增连接法、接头连接法等。

这些方法可以有效地将目标基因插入到载体中，并确保插入的正确性和稳定性。

四、转化目标宿主将构建好的重组载体导入到目标宿主细胞中，使其稳定地存在和复制。

转化的方法多样，包括热激转化、电穿孔转化、化学法转化等。

转化效率和载体稳定性是评价转化效果的主要因素。

五、筛选重组子对转化后的细胞进行筛选，筛选出含有目标基因的重组子。

常用的筛选方法包括抗生素筛选、荧光筛选、酵素检测等。

筛选过程中需要注意筛选压力和筛选条件的优化，以提高筛选效率。

六、鉴定重组子对筛选出的重组子进行鉴定，确保其构建正确。

常用的鉴定方法包括PCR扩增、酶切鉴定、序列分析等。

通过这些方法可以验证重组子的结构和功能是否正确，确保后续实验的准确性和可靠性。

七、表达目标基因对鉴定合格的重组子进行表达。

通过选用适当的启动子和调控元件，可以实现目标基因的高效表达。

表达的方法有多种选择，包括转染法、感染法、转基因法等。

表达的效果可以通过荧光显微镜观察、酶活性测定、Western blot等方法进行检测和验证。

DNA重组质粒的构建概述

DNA重组质粒的构建概述引言DNA重组质粒是现代生物学研究中常用的工具，它可以用来携带外源基因并在目标生物体中表达，从而实现对基因功能的研究和利用。

本文将概述DNA重组质粒的构建过程，包括选择质粒载体、外源基因的克隆插入以及构建质粒的鉴定等内容。

选择质粒载体质粒是细胞内独立存在的环状DNA分子，广泛存在于细菌和酵母等单细胞生物中。

在构建DNA重组质粒时，选择一个适合的质粒载体非常关键。

常用的质粒载体有pUC19、pET28a、pET-DEST42等，在选择时可以根据实验需求考虑载体大小、选择标记物和基因表达系统等因素。

外源基因的克隆插入1. DNA片段的获取首先，需要获取外源基因的DNA片段。

这可以通过PCR扩增、基因合成或其他方法来获得。

在PCR扩增时，需要设计一对引物，使其能够特异性地扩增目标基因。

合成基因片段时，可以利用现代合成生物学的技术，将目标基因序列按照设计的引物进行人工合成。

2. 酶切和连接接下来，使用限制酶将质粒载体和外源基因片段酶切开。

酶切的目的是产生互补的黏性末端，使得质粒载体和外源基因片段可以互相连接。

选择适当的限制酶在切割时产生互补的黏性末端，使得连接更加有效。

然后，将质粒载体和外源基因片段连接在一起。

这可以使用DNA连接酶和连接试剂，在适当的条件下进行连接。

连接后的质粒称为重组质粒。

3. 转化宿主细胞将构建好的重组质粒转化到适当的宿主细胞中，使其能够在细胞内进行复制和表达。

常用的宿主细胞有大肠杆菌和酵母等。

构建质粒的鉴定通过一系列实验，对构建好的质粒进行鉴定，以确保其正确性和完整性。

常用的鉴定方法有限制酶切鉴定、测序验证、PCR扩增鉴定等。

1. 限制酶切鉴定利用正确的限制酶将质粒进行切割，然后经过琼脂糖凝胶电泳进行分析。

根据不同的切割模式，可以判断质粒是否正确构建。

2. 测序验证通过测序技术对质粒进行测序分析，确保质粒中的外源基因片段的完整性和准确性。

3. PCR扩增鉴定使用特异性引物对质粒进行PCR扩增，在琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物的大小，判断质粒中的目标基因是否存在。

实验八DNA重组子的构建与鉴定

1.取新的0.5ml eppendorf管，编号。 2.依次加入：
ddH2O
2μl
T-vector
1 μl
PCR product 10×T4 DNA ligase buffer
5μl 1μl
T4 DNA ligase
1μl
3.混匀后将液体全部甩到管底涂板及培养
因pUCm-T载体带有Ampr基因，而外源片段上不带该基因，故转化受体菌后只有带有pUCm-T的受体菌（转化子）才能在含有Amp的LB平板上存活；只带有自身环化外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。
α-互补
-互补的插入失活 pUC载体上LacZ’基因的5‘端有一段多克隆位点(MCS)区，本身虽不干扰LacZ’ （ -片段）的合成，但插入外源目的基因后就会阻止LacZ’的合成，使不能互补
5’ MCS lacZ’ 3’ 5’ 外源DNA lacZ’ 3’
肽互补
肽移码突变不互补
蓝－白斑筛选示意图
α互补(蓝白斑)筛选
pUCm-T上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序
列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），但并没有破坏lacZ的阅读框架，不影响其正常功能。 E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列
重组体导入受体细胞后的筛选培养
大部分是含空载体的转化子（非重组子）少部分是含目的基因的转化子（重组子）少数是不含载体的受体细胞（非转化子）
常用鉴定方法
小规模制备质粒DNA进行限制酶切分析互补杂交筛选
a
12
酶切和电泳方法
➢ 琼脂糖凝胶电泳分离鉴定大小不等的酶解片段：

DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤

DNA重组技术(Recombinant DNA)实验原理、用品和步骤【实验原理】1．DNA重组技术重组DNA(Recombinant DNA)技术是遗传工程的核心技术，也是人类在基因和DNA分子水平进行操作的技术。

它包括以下几个步骤：1）重组DNA分子的构建：即将目的基因（DNA或cDNA片段）与载体DNA重组，应用TA 克隆方法,将PCR扩增产物快速克隆至质粒载体中。

该方法利用了PCR过程中使用的热稳定聚合酶(Taq酶)在所复制的双链分子末端加上单一脱氧腺苷酸(A),从而产生一A-粘性末端的性质,设计一种线性载体,使之含有一T-粘性末端,可直接插入PCR产物,在DNA连接酶作用下，目的DNA和载体DNA连接形成重组DNA分子。

2）将重组DNA分子转化宿主细胞。

3）克隆选择增殖：将转化后的液体涂布于琼脂培养基表面，培养基中含有宿主菌敏感的抗生素，重组DNA（TA克隆载体分子）含有相应抗生素的抗性基因，转化的细菌能在培养基上生长形成集落。

挑取菌落，置液体培养基中培养，得到大量含重组DNA的细菌。

4）收获扩增后的培养细胞，提取重组DNA分子（质粒），并纯化，获得某一基因或DNA片段的大量拷贝。

2．质粒DNA的小量制备常见的质粒DNA提取方法有简易一步提取法、碱裂解法和煮沸法。

本实验采用的是碱裂解法，碱裂解法的原理：在PH 12.0~12.6碱性环境中，线性的大分子量细菌染色体DNA变性，而共价闭环质粒（CC）DNA仍为自然状态。

将pH调至中性并有高盐浓度存在的条件下，染色体DNA之间交联形成不溶性网状结构。

大部分染色体DNA和蛋白质在去污剂SDS的作用下形成沉淀，而质粒DNA仍为可溶状态。

通过离心，将可去除大部分细胞碎片、染色体DNA、RNA及蛋白质，质粒DNA尚在上清中，再用乙醇沉淀回收质粒DNA。

3．质粒DNA的限制性内切核酸酶（限制酶）切分析限制酶存在于原核生物体内，根据其结构和功能特性分为：Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型。

重组载体构建的方法和步骤

重组载体构建的方法和步骤
1. 选择载体，首先需要选择合适的载体，常用的载体包括质粒、病毒、人工染色体等。

选择载体时需要考虑载体大小、复制方式、
宿主范围等因素。

2. 线性化载体，将所选载体进行线性化处理，通常采用限制性
内切酶对载体进行切割，生成线性化的载体。

3. 外源基因插入，将待插入的外源基因与线性化载体进行连接。

这一步通常需要利用DNA连接酶或者DNA重组酶来实现。

4. 载体转化，将重组后的载体导入到宿主细胞中。

这一步通常
采用转化、转染或者电穿孔等方法。

5. 筛选正常重组子代，经过载体转化后，需要进行筛选以获得
正常重组的子代细胞。

通常采用抗生素筛选或者标记基因筛选的方式。

6. 鉴定重组子代，对筛选得到的细胞进行PCR、酶切、测序等
方法进行鉴定，确保重组载体的构建成功。

总的来说，重组载体构建的方法和步骤包括选择载体、线性化载体、外源基因插入、载体转化、筛选正常重组子代和鉴定重组子代。

这些步骤需要严格操作，并且需要根据具体实验情况进行调整和优化。

希望这些信息能够对你有所帮助。

基因工程-5-重组DNA构建与筛

重组DNA技术的应用领域
基因治疗
利用重组DNA技术对病变细胞进行基因修饰，以达到治疗疾病的目的。
农业生物技术
通过重组DNA技术改良农作物，提高产量和抗性。
基因克隆
通过重组DNA技术将目的基因插入到载体中，实现基因的克隆和扩增。
生物制药
利用重组DNA技术生产具有特定功能的蛋白质或抗体，用于药物研发和生产。
重组DNA技术的发展趋势
随着科学技术的不断进步，重组DNA技术将不断发展和完善，有望在疾病治疗、生物制药、农业育种等领域发挥更大的作用。
重组DNA技术面临的挑战
尽管重组DNA技术具有广泛的应用前景，但同时也面临着一些挑战，如技术难度、安全性问题、伦理问题和法规限制等。
重组DNA技术的未来发展方向
重组DNA技术安全性评估标准
对重组DNA技术的安全性进行评估，需要遵循国际公认的安全性评估标准，如美国食品药品监督管理局（FDA）和世界卫生组织（WHO）等机构制定的相关指南和规定。
重组DNA技术安全性评估内容
评估内容包括重组DNA技术的操作过程、使用的载体、宿主细胞、目的基因等，以及潜在的基因突变、基因转移和基因表达等方面。
SUMMAR Y
01
重组DNA技术概述
重组DNA技术的定义
重组DNA技术是指通过人工手段将不同来源的DNA片段进行剪切、拼接和重组，从而构建出新的DNA分子，实现基因的修饰、表达和调控。
该技术涉及基因克隆、载体构建、 DNA转化和筛选等多个环节，是现代生物技术领域中的核心技术之一。
重组DNA技术的历史与发展
T4 DNA连接酶连接
将目的基因与载体进行连接，形成重组DNA分子。常用的连接方法是T4 DNA连接酶连接法。

实验十载体构建

实验十载体构建
实验目的：能够综合运用DNA回收、酶切、连接、
转化、质粒提取、酶切鉴定筛选重组质粒等分子生物学技术。
设计重组载体时的注意事项
• 目的DNA插入克隆载体
在克隆载体的MCS中选择合适的酶切位点：通过引物设计在目的片段两端加上酶切位点注意在外源DNA片段的内部不• 第三天：
保存平板，留待下周提质粒鉴定电泳鉴定或 PCR鉴定
乙组提pUC18
2000 1000
20ng/μl
2000 1000
HindIII、EcoRI双酶切50 μl体系
• 待酶切DNA：不超过2.5 μg • 10×Y buffer: 10 μl （工作液浓度为2×) • EcoRI: 1 μl • HindIII: 1μl -1.5 μl • 加ddH2O至总体积为50 μl
• 目的DNA插入表达载体
除上述注意事项，引物设计时还要注意读码框要和表达载体的读码框一致
实验流程
• 第一天：
– 电泳PCR产物并回收 – 双酶切目的片段及质粒 – 电泳检测、回收上述两种DNA – 电泳检测回收产物 – 连接反应（过夜）
空闲时间准备LA（含50μg/ml氨苄青霉素）平板，LB培养基，试管及牙签灭菌。
37℃孵育≥1小时
T4 DNA 连接酶 20 μl体系
• pUC18 200-400ng 载体与插入片段的摩尔比： • 待插入的DNA片段 1: （3~10） • 10 × buffer：2 μl • T4 DNA 连接酶： 1.5 μl • 加ddH2O至总体积为20 μl
15℃孵育4-18小时或室温3小时或 4 ℃ 过夜

表达载体的构建方法及步骤

表达载体的构建方法及步骤一、载体的选择及如何阅读质粒图谱目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：（1）复制起始位点Ori 即控制复制起始的位点。

原核生物DNA 分子中只有一个复制起始点。

而真核生物DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如Amp+ ,Kan+（3）多克隆位点MCS 克隆携带外源基因片段（4）P/E 启动子/增强子（5）Terms 终止信号（6）加poly（A）信号可以起到稳定mRNA 作用选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。

如果构建的目的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：【1】构建DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位；表达天然蛋白质或融合蛋白作为相应载体的参考。

【3】载体MCS 中的酶切位点数与组成方向因载体不同而异，适应目的基因与载体易于链接，不能产生阅读框架错位。

综上所述，选用质粒（最常用）做载体的5点要求：（1）选分子量小的质粒，即小载体（1－1.5kb）→不易损坏，在细菌里面拷贝数也多（也有大载体）；（2）一般使用松弛型质粒在细菌里扩增不受约束，一般10个以上的拷贝，而严谨型质粒<10个。

（3）必需具备一个以上的酶切位点，有选择的余地；（4）必需有易检测的标记，多是抗生素的抗性基因，不特指多位Ampr（试一试）。

（5）满足自己的实验需求，是否需要包装病毒，是否需要加入荧光标记，是否需要加入标签蛋白，是否需要真核抗性（如Puro、G418）等等。

DNA重组-载体构建常见问题及解决方法

载体构建中常见问题及解决方法重组质粒构建是常用的分子生物学手段，是研究相关分子及蛋白功能的基础，是生化分子实验中最基本的方法，但是其中还是有些基本的技巧需要掌握。

下面我总结一下自己的经验，以期能为虫友们提供借鉴，希望多少给大家一下借鉴。

所涉及内容如下：1)克隆基因的酶切位点问题2)目的片段的扩增3) 载体酶切的问题4) 连接片段浓度比的问题5）菌液的提取6）酶切鉴定7）表达鉴定一、克隆基因的酶切位点问题1、克隆位点选择的问题。

首先要对目标基因进行酶切位点扫描分析，列出其所含酶切位点清单。

然后对照质粒多克隆位点，所选择的克隆位点必须是目标基因所不含的酶切位点。

双酶切时尽量选择酶切温度相同，buffer一致，双酶切效率高的两个内切酶，二者最好是您实验室常用的酶。

2、保护碱基数目的问题。

在设计PCR引物时，引入酶切位点后，常常要加入保护碱基，这是大家所熟知的。

但是保护碱基数量多少，可能被新手所忽视。

这种忽视可能会大大影响后续的实验进展。

参考常用的酶切位点保护碱基，选择酶切时间短且酶切效率高的碱基数。

注释：1．如果要加在序列的5‘端，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的5’端加上相应的碱基（黑色），相同如果要在3‘端加保护碱基，就在酶切位点识别碱基序列（红色）的3’端加上相应的碱基（黑色）。

2．切割率：正确识别并酶切的效率3. 加保护碱基时最好选用切割率高时加的相应碱基二目的片段的扩增目的片段扩增失败的原因和可采取措施：1）无条带：引物设计错误，找人帮忙看看引物设计是否合理；退火温度不合适，设置梯度，选择最合适的退火温度；2）条带不单一：引物不特异，适当增长或引物序列长度；3）出现引物二聚体，适当提高退火温度或者重新设计引物。

三载体酶切的问题酶切效率直接影响后续实验的成功率，酶切过程的注意事项：1）酶切质粒浓度和纯度要好2）酶切温度和时间，如果两个酶的最适温度不同，建议单酶切，回收后在用另一个酶切，时间最好过夜切四连接片段浓度比的问题1）连接比例的确定：上一步酶切产物回收后，用琼脂糖凝胶电泳比较载体和目的片段的亮度，确定体积比，一般载体：片段=1:3~1:5；2）连接时间和温度：现在很多连接酶都比较高效了，室温2个小时就可以了，如果后续实验检测阳性克隆较少，可采用16℃过夜连接提高连接成功率；3）未避免后续菌落PCR的假阳性情况，建议连接转化时做对照组：酶切后的载体做自连接对照，如果对照组与实验组长出的克隆数相差不大则很可能存在载体自连或者没完全切开的情况，建议先不要做后续验证，重新从酶切开始，增加酶量及酶切时间、适当减少所切载体的量、改变连接比等；如果对照组没有克隆形成或鲜有克隆形成，则可继续进行后续验证。

DNA重组技术概述

DNA重组技术概述DNA重组技术（DNA recombinant technology）是利用DNA序列的组合、修饰和重排等方法来获得特定目的的DNA分子的一种技术。

该技术被广泛应用于基因工程、生物医药、农业、食品工业等领域，并在科研、生产和临床医学中产生了重要的影响。

DNA重组技术的主要原理是通过DNA分子的切割、粘接、合成等操作，改变DNA序列的结构和组合关系。

这样一来，就可以将不同来源的DNA片段进行组合，重组为新的DNA分子，从而实现对DNA序列的改变和修饰。

DNA重组技术的核心技术包括PCR扩增、限制酶切割、DNA连接、酶体定向克隆、DNA测序等。

PCR扩增是一种常用的DNA重组技术，它可以在短时间内扩增出目标DNA片段。

PCR的原理是通过DNA聚合酶酶作用下的连续循环体系，将目标DNA片段从少量模板DNA中扩增出来。

这种方法简单、高效，广泛应用于分子生物学研究、基因克隆、医学诊断等领域。

限制酶切割是DNA重组技术中常用的一种手段。

限制酶能识别并切割DNA特定的序列，从而产生特定的DNA片段。

通过选择不同的限制酶，可以将DNA分子切割为具有不同片段和末端特性的DNA片段，从而实现希望的DNA重组效果。

限制酶的切割操作常用于基因克隆、DNA分析和重组等实验中。

DNA连接是DNA重组技术的另一个核心环节。

DNA连接是将两条DNA片段的末端通过DNA连接酶的作用连接在一起，形成一个新的DNA分子。

DNA连接的方法有多种，如末端连接、中间连接等。

不同的连接方式和连接酶的选择，可以实现不同的DNA重组目的。

通过DNA连接技术，可以将来自不同源的DNA片段进行连接，从而构建出具有特定功能的DNA分子。

酶体定向克隆是DNA重组技术中的一种重要方法。

它通过酶体（vector）的选择和DNA片段的连接来实现目标DNA片段的克隆和表达。

常用的酶体有质粒、噬菌体和人工染色体等。

酶体定向克隆技术常用于基因工程研究，用于将外源基因导入到宿主细胞中，并在宿主细胞中表达和复制。

重组载体构建的方法和步骤

重组载体构建的方法和步骤全文共四篇示例，供读者参考第一篇示例：重组载体是基因工程领域中的一个非常重要的技术手段，通过对DNA序列的重组，可以构建出具有特定功能的载体，进而实现对目标基因的操控和表达。

在生物学研究、新药开发、农业生产等领域都有着广泛的应用。

下面将介绍一下重组载体构建的方法和步骤。

一、选择载体和目标基因在进行重组载体构建之前，首先要选择适合的载体和目标基因。

一般来说，选择的载体应该具有良好的表达性能和较高的复制稳定性，常用的载体有质粒、病毒等。

而目标基因则应该是我们需要研究或者操控的基因，例如编码重要酶类、蛋白质、抗性蛋白等。

二、获取目标基因目标基因的获取可以通过多种方式，包括PCR扩增、基因合成、基因克隆等。

其中PCR扩增是最为常用的方法，通过设计引物，可以在DNA模板上扩增出目标基因的片段，然后进行纯化和检测，确保其纯度和完整性。

三、线性化载体将选择的载体进行线性化处理，通常是通过限制性内切酶将载体切割成线性片段，以便于后续的连接和转化。

线性化后的载体需要经过纯化和鉴定，确保其完整性和纯度。

四、连接目标基因和载体将目标基因和线性化载体连接起来，一般通过DNA连接酶催化反应实现。

连接时需要考虑目标基因和载体的互补性，以确保连接的正确性和稳定性。

连接后的重组载体需要经过转化操作，将其导入到宿主细胞中。

五、转化宿主细胞将构建好的重组载体导入到宿主细胞中，通常通过化学法、电击法、病毒介导等方式实现。

转化后的宿主细胞需要进行筛选、鉴定和培养，确保其稳定表达目标基因，并能够满足后续实验和研究的需要。

六、鉴定和验证对构建好的重组载体进行鉴定和验证是非常重要的一步，可以通过PCR、限制性酶切割、测序等方法进行验证。

同时也需要进行功能性和表达性的分析，确保重组载体的构建是成功的，能够稳定地表达目标基因。

七、应用和拓展构建好的重组载体可以应用于多个领域，如基因治疗、转基因作物、蛋白质表达等。

同时也可以通过改进和拓展构建方法，提高载体的稳定性和表达效率，开拓更广阔的应用领域。

载体构建方法

载体构建方法
载体构建方法是指通过合适的技术手段，创建出用于携带DNA等遗传物质的载体。

常见的载体包括质粒、噬菌体、大肠杆菌、酵母等微生物，以及病毒等。

以下是一些常用的载体构建方法：
1. 质粒构建方法：质粒是一种环状DNA分子，可用于携带外源DNA。

通常采用PCR扩增和限制性酶切等技术将外源DNA插入到质粒中，然后转化到宿主细胞中。

2. 噬菌体构建方法：噬菌体是一种寄生于细菌的病毒，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。

常用的噬菌体构建方法包括重组噬菌体技术和噬菌体展示技术等。

3. 大肠杆菌构建方法：大肠杆菌是一种常见的细菌，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。

常用的大肠杆菌构建方法包括转化、电转化、化学转化等。

4. 酵母构建方法：酵母是一种单细胞真核生物，可用于携带外源DNA并表达目的蛋白。

常用的酵母构建方法包括转化、电转化、融合等。

5. 病毒构建方法：病毒是一种寄生于细胞的微生物，可用于携带外源DNA并转化到宿主细胞中。

常用的病毒构建方法包括重组病毒技术、腺病毒技术、AAV技术等。

以上是一些常见的载体构建方法，不同的载体构建方法适用于不同的实验需求。

在选择合适的载体构建方法时，需要考虑到载体的稳定性、转化效率、表达效率等因素。

重组载体构建实验报告

一、实验目的1. 学习重组载体的构建原理和方法；2. 掌握基因克隆、酶切、连接等基本操作；3. 鉴定重组载体的构建成功与否。

二、实验原理重组载体构建是指将目的基因插入到载体中，形成具有特定功能的重组DNA分子。

实验中，通过PCR扩增目的基因，将其与载体进行酶切连接，构建重组载体。

三、实验材料1. 基因组DNA（含有目的基因）；2. 载体DNA；3. 限制性内切酶；4. DNA连接酶；5. DNA标记物；6. 转化试剂；7. 载体宿主菌（如大肠杆菌）；8. PCR试剂；9. 电泳试剂；10. 实验器材。

四、实验步骤1. 目的基因的扩增：以基因组DNA为模板，设计特异性引物，利用PCR技术扩增目的基因。

2. 载体的酶切：分别对载体DNA和目的基因进行限制性内切酶酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：将酶切后的载体DNA和目的基因进行连接，形成重组载体。

4. 转化：将连接好的重组载体转化到载体宿主菌中。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：在含有抗生素的培养基上接种转化菌，观察菌落生长情况；b. PCR鉴定：提取转化菌的DNA，进行PCR扩增，检测目的基因是否插入载体；c. 酶切鉴定：对PCR鉴定为阳性的转化菌进行酶切，观察酶切图谱与预期结果是否一致；d. 序列分析：对酶切鉴定为阳性的转化菌进行DNA测序，验证目的基因插入载体的正确性。

五、实验结果与分析1. PCR扩增：成功扩增出目的基因片段，大小与预期一致。

2. 酶切：载体DNA和目的基因分别进行酶切，获得具有相同黏性末端的DNA片段。

3. DNA连接：连接反应成功，形成重组载体。

4. 转化：转化菌在含有抗生素的培养基上生长良好。

5. 重组载体的筛选与鉴定：a. 抗生素筛选：转化菌在含有抗生素的培养基上生长，说明已成功转化；b. PCR鉴定：PCR扩增结果显示，转化菌中含有目的基因；c. 酶切鉴定：酶切图谱与预期结果一致，证明目的基因已插入载体；d. 序列分析：DNA测序结果与预期序列一致，验证目的基因插入载体的正确性。

重组载体的构建原理及目的

重组载体的构建原理及目的
重组载体是一种用于携带和传递DNA片段的分子工具。

其构建原理是将目标DNA片段插入到载体DNA分子中，形成一个新的重组载体。

重组载体的目的是用于基因工程、基因疗法以及基因表达等领域的研究。

构建重组载体需要具备以下几个步骤：
1. 选择载体：根据需要选择合适的载体，例如质粒、病毒、细胞质等。

2. 切割载体：将载体DNA分子用限制性内切酶或其他方法切割成线性或圆形片段。

3. 插入DNA片段：将目标DNA片段用限制性内切酶切割后，与载体DNA片段连接成重组载体。

4. 转化宿主细胞：将重组载体转化到宿主细胞中，让其复制并表达目标基因。

重组载体的构建可以实现外源基因的转染和表达，从而实现基因修饰、基因敲除、基因定位等目的。

同时，重组载体也可以用于基因疗法，将修饰后的基因载体导入到人体细胞，实现治疗作用。

因此，重组载体的构建是现代生命科学领域的重要研究内容之一。

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载体构建是什么？载体构建技术原理

载体构建是什么？载体构建技术原理载体构建(vectorconstruction)，为把DNA分⼦运送到受体细胞中去，必须寻找⼀种能进⼊细胞、在装载了外来的DNA⽚段后仍能照样复制的运载体。

理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因⼯程中，常⽤⼈⼯构建的质粒作为载体。

载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

载体构建是分⼦⽣物学研究常⽤的⼿段之⼀。

主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动⼦、增强⼦、筛选标记等功能元件的改造。

载体构建完成后可利⽤PCR原理进⾏测序验证。

⼈⼯构建质粒⼈⼯构建的质粒可以集多种有⽤的特征于⼀体，如含多种单⼀酶切位点、抗⽣素耐药性等。

常⽤的⼈⼯质粒运载体有pBR322、pSC101。

pBR322含有抗四环素基因(Tcr)和抗氨苄青霉素基因(Apr)，并含有5种内切酶的单⼀切点。

如果将DNA⽚段插⼊EcoRI切点，不会影响两个抗⽣素基因的表达。

但是如果将DNA⽚段插⼊到Hind Ⅲ、BamH Ⅰ或 SalⅠ切点，就会使抗四环素基因失活。

这时，含有DNA插⼊⽚段的pBR322将使宿主细菌抗氨苄青霉素，但对四环素敏感。

没有DNA插⼊⽚段的pBR322会使宿主细菌既抗氨苄青霉素⼜抗四环素，⽽没有pBR322质粒的细菌将对氨苄青霉素和四环素都敏感。

pSC101与pBR322相似，只是没有抗氨苄青霉素基因和PstI 切点。

质粒运载体的最⼤插⼊⽚段约为10 kb(kb表⽰为千碱基对)。

选择质粒载体的要素是要了解可⽤到的载体的特征和预测重组克隆所⽤于的实验。

所有的质粒载体都有三个共同的特征：⼀个复制⼦、⼀个选择性标志和⼀个克隆位点。

复制⼦是含有DNA复制起始位点的⼀段DNA（ori），也包括表达由质粒编码的复制必需的RNA和蛋⽩质的基因。

选择性标志对于质粒在细胞内持续存在时必不可少的。

克隆位点是限制性内切酶切割位点，外源性DNA可由此插⼊质粒内，⽽且并不影响质粒的复制能⼒，或为宿主提供选择性表型。

重组DNA分子的模型构建

基因功能研究的应用范围广泛，包括发育生物学、神经生物学、免疫学等。例如，通过基因功能研究可以揭示胚胎发育过程中的基因调控机制，或者阐明神经细胞之间的信号传递机制。
生物制药
生物制药是指利用重组DNA技术来生产具有特定功能的蛋白质或核酸药物。通过构建重组DNA分子模型，可以更好地了解药物的生产过程和质量控制，为相关研究和生产提供有力支持。
基因枪法可用于将目的基因导入动物和植物细胞，并实现瞬时表达和稳定表达。
ABCD
基因枪法利用高压气体将 DNA包裹在金颗粒或钨颗粒表面，然后通过高速射入受体细胞。
基因枪法是重组DNA分子模型构建的有效方法之一，具有较高的转化效率和灵活性。
微注射法
微注射法利用显微操作技术和微量注射器将 DNA注入受体细胞核内。
环境安全性
在将重组DNA分子释放到环境中之前，需要进行全面的风险评估，确保不会对环境造成不可逆的影响。
伦理问题
人类基因编辑
在构建涉及人类基因的重组DNA分子时，必须遵循严格的伦理准则，确保研究符合道德和法律规定，避免对人类基因库造成不可逆的改变。
动物实验
在利用动物进行重组DNA分子实验时，应遵循3R原则（替代、减少、优化），尽量减少动物的使用和痛苦。
随着技术的发展，重组DNA技术逐渐成为生物技术领域的重要支柱，不断推动着人类对生命科学的认识和应用。
02
重组DNA分子模型构建的基筛选出目的基因。
聚合酶链式反应（PCR）
利用特异性引物，通过PCR技术扩增目的基因片段。
化学合成
对于较小的基因片段或特定序列，可以通过化学合成获得。
案例一
要点一
总结词
CRISPR-Cas9技术是一种革命性的基因编辑工具，通过构建DNA双链断裂并诱导细胞自我修复，实现对特定基因的敲除、敲入或替换。

重组载体的构建

PCR 反应系统的组成引物、寡核苷酸、Taq DNA聚合酶、模板DNA、缓冲液。
材料与试剂

PCR仪、台式离心机、灭菌的微量离心管、凝胶电泳系统、电泳仪、电泳槽、紫外透射仪、一次性塑料手套等

TaKaRa Taq (5U/ ul)
10XPCR Buffer (Mg2+ Plus) dNTP Mixture (each 10mM) 模板 (10ng，质粒模板或DNA或cDNA模板) 引物（Primer 1 and 2,10uM) Primer 1: CGCGGGCAGTCTATCTAATCCAGTGGACTCAAG Primer 2: TGCAGCCTAGATCCATGGCATCAATGCAGAAGC pBluescript KS 质粒(3.0kb)
C.纯化步骤
1) 将取出拉杆的注射器筒（3ml）装在纯化柱上，加入上述DNA与树脂混合液，然后装上拉杆，慢慢将混合液推进纯化柱内； 2) 卸下注射器筒，拔出拉杆，再将注射器筒装上纯化柱，加2ml 80%的Isopropanol, 然后装上拉杆，慢慢推出液体以清洗柱子； 3) 再次卸下注射器筒，将纯化柱装在1.5ml离心管上， 10000g离心2 min，以干燥树脂； 4) 再将纯化柱装在一个新的1.5ml离心管上，加50μl 水或TE缓冲液，1分钟后，10000g离心20秒，溶出 DNA片段； 5) 移去纯化柱，将纯化出的DNA溶液在-20℃下保存备用。
D.说明
若向 1ml 树脂中加入 500bp PCR 产物 50ng 至
16μg，其回收率可在95％以上。同样500bp，若从
低溶点琼脂糖凝胶中回收其回收率在70～90％之间。
学生PCR实验结果(4l)

DNA重组(DNA recombination)技术：DNA重组的载体-3

DNA重组（DNA recombination）技术：DNA重组的载体-3在作为载体时，这些噬菌体有一个很大的优点，即克隆到M13mp载体的外源DNA片段（双链），在子代噬菌体便成为了单链形式。

故应用M13mp进行克隆，可方便地分离到大量含有外源DNA某一单链的DNA分子。

这种单链DNA可在下列工作中作模板：①主要用作双脱氧链终止法进行DNA序列测定的模板；②制备仅有一条链得到放射性标记的杂交用DNA探针；③利用寡核苷酸进行定点诱变。

M13mp18/M13mp19三、真核细胞的克隆载体无论是原核还是真核系统的基因克隆载体，作为载体都应具备三个相似的基本条件，即具备在宿主中进行复制的复制信号、适当的单一酶切位点和方便的选择标记。

在原核载体的基础上进行适当的改造，可构建出带有真核细胞复制信号的穿梭载体，使之能在真核系统中扩增。

若加上适当的真核启动子等元件，则成为真核表达载体，能在真核细胞中表达插入载体中的外源基因。

为了鉴定和获得阳性转染细胞株，真核系统载体还必需具备适当的筛选标记。

一种筛选标记是，使用遗传缺陷型细胞株与载体的基因产物互补（如TK基因产物）。

另一种普遍使用的是抗新霉素基因。

真核系统载体种类很多，各具特色和用途，并且正在不断被改进、完善，我们仅举例简要介绍。

㈠ SV40（猿猴病毒）载体SV40基因组为约5.2kb的双链DNA分子，碱基顺序已完全清楚，且对其生活习性和各基因的调控也有较深的了解。

同其他哺乳动物的DNA病毒一样，SV40能在细胞中形成较高的拷贝数并具有强大功能的启动子。

因此，当今许多真核表达载体中的调控元件大都取材于SV40的调控顺序和复制信号。

一般以取代方式构建SV40重组子，天然SV40中能插入2.5kb的外源DNA片段。

用SV40作为载体有两种方式：①用SV40 DNA 与外源DNA构建重组子，转染细胞后允许细胞形成含外源DNA的病毒颗粒；②重组子不包装成病毒颗粒，而象质粒一样在细胞中复制或整合到染色体组中。

载体构建简介

载体构建SOP载体构建(vectorconstruction)，为把DNA分子运送到受体细胞中去，必须寻找一种能进入细胞、在装载了外来的DNA片段后仍能照样复制的运载体。

理想的运载体是质粒(plasmid)，在基因工程中，常用人工构建的质粒作为载体。

载体构建即是构建含外源DNA的质粒。

载体构建是分子生物学研究常用的手段之一。

主要包括已有载体多克隆位点MCS的改造和已有载体启动子、增强子、筛选标记等功能元件的改造。

载体构建完成后可利用PCR原理进行测序验证。

原核重组表达常用载体构建策略有多种选择，（1）常用的酶切连接是较为广泛使用的克隆技术，主要优点是技术稳定，缺点是周期长、步骤多，任何一个环节产生的误差都会影响克隆构建的失败，如用酶切连接的策略进行载体批量构建，不同载体和不同外源基因尽可能选用相同的上下游酶切位点，需特别留意的是基因内部不能有与上述相同的酶切位点；（2）同源重组是目前流行的克隆技术。

同源重组（Homologous Recombination)是指发生在非姐妹染色单体（sister chromatid)之间或同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。

该技术可以任意载体任意基因片段快速实现多片段长片段定点定向克隆，最大的优点在于不依赖于酶切位点进行克隆，操作时间也非常短，将目的片段和线性载体按照一定比例混合后，在重组酶的作用下即可发生重组，本实验室常用37℃的温度，30min反应即可完成。

一、目的载体进行双酶切（一）实验准备1.实验材料：质检合格的目的载体。

2.试剂与耗材：buffer，ddH2O，琼脂糖（Spain，9012-36-6）、TBE缓冲液、PCR 管（国产，81245）、1.5ml离心管（国产）、枪头（国产）、Axygen AxyPrep PCR cleanup Kit(Axygen，AP-PCR-250)、限制性内切酶A、限制性内切酶B。

3.仪器与设备：PCR仪（杭州博日，TC-96/G/H（b）A）、mini离心机（其林贝尔，LX600）、电泳槽（北京君意，JY-SPCT）、凝胶成像仪（Bio-rad，GelDoc/ChemiDocuniversal hood II）、分光光度计（天根，OSE-260-01）。