DNA重组技术ppt课件

三、试剂与器材
（一）试剂 限制性内切酶；10×内切酶缓冲液 T4ＤＮＡ连接酶；10×连接酶缓冲液 电泳缓冲液 1×TAE 琼脂糖；溴酚兰； 溴化乙锭(工作浓度0.5µg/ml) 酚；氯仿；无水乙醇；70%乙醇；灭菌双蒸
水
（二）实验器材
1．电泳仪、电泳槽、紫外检测仪、摄 影设备
酶-AMP复合物再结合到具有5’-磷酸基和3’羟 基切口的ＤＮＡ分子上，使ＤＮＡ腺苷化。
产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来。
当我们已经获得目的基因片段，选择好适当 的克隆（或表达，转化）质粒载体， 并确定 重组方案后，下面要进行的就是ＤＮＡ片段 之间的体外连接，从而获得重组子。
此重组子可转入相应的宿主菌中用于对目的 基因的扩增以及目的基因表达（如现代基因 工程药物的生产），还可用于序列分析和转 基因等重要生物技术的研究中。
根据点样量制备合适厚度的琼脂糖凝胶板； 切胶时尽可能切掉不含ＤＮＡ片段的凝胶； 要尽量减少ＤＮＡ在紫外下的照射时间以
减少对ＤＮＡ的损伤； 熔胶要完全 。
ＤＮＡ的连接
在T4ＤＮＡ连接酶的作用下，平端或带有相 同粘末端的ＤＮＡ分子可以连接上。ＤＮＡ 连接酶的作分三步：
T4ＤＮＡ 连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP 复合物。
1、ＤＮＡ分子的体外连接
ＤＮＡ分子的体外连接就是在一定条件下， 由ＤＮＡ连接酶催化两个双链ＤＮＡ片段 组邻的５’端磷酸与３’端羟基之间形成 磷酸酸脂键的生物化学过程，ＤＮＡ分子 的连接是在酶切反应获得同种酶互补序列 基础上进行的。
连接反应中值得注意的几个问题：
1.ＤＮＡ连接酶 常用的ＤＮＡ连接酶有两种： (1)来自大肠杆菌的ＤＮＡ连接酶 (2)来自噬菌体的Ｔ４ＤＮＡ连接酶。 二者的作用机理类似。
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二、实验原理
1. 核酸限制性内切酶是在原核生物中发现的 一类专一识别双链ＤＮＡ中特定碱基序列的 核酸水解酶，它们的功能类似于高等动物的 免疫系统，用于抗击外来ＤＮＡ的侵袭。现 已发现几百种限制性内切酶，它们以内切方 式水解核酸链中的磷酸二酯键，产生的ＤＮ Ａ片段5’端为P，3’端为OH。由于限制性内切 酶能识别ＤＮＡ特异序列并进行切割，因而 在基因重组、ＤＮＡ序列分析、基因组甲基 化分析、基因物理图谱绘制及分子克隆等技 术中收到广泛应用。
实验方法
ＤＮＡ分子的体外连接
１．在无菌Eppendorf管中加入以下溶液：
a. 0.1μg质粒载体，２倍分子的外源ＤＮＡ。
b. 加无菌水至7.5μl，于４５℃加温５分钟使重新
退火的粘端解链， 将混合物冷却到０℃。
c. 加入：
１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer Ｔ４ＤＮＡ连接酶
1μl 0. 1μl
胶回收后用30-50 μl无菌双蒸水洗脱ＤＮＡ片段，取 1-5 μl进行电泳检测，取2-5 μl测定OD260下的光吸收 值，计算ＤＮＡ的浓度。
注：1 OD 260相当于双链ＤＮＡ浓度为50 μg /ml
胶回收注意事项
将电泳槽用ddH2O反复清洗干净, 倒入新鲜 配制的灭菌电极缓冲液；
5.连接反应的检测
连接反应成功与否，最后的检测要通过下一 步实验，转化宿主菌， 阳性克隆的筛选来确 定。
我们下面的实验从粘性末端为例操作。
实验试剂
１．纯化后的酶切质粒载体和目的基因。 ２．１０×Ｔ４ＤＮＡ连接酶buffer
200mM Tris-HCl(pH7.6) 50mM MgCl2 50mM 二硫苄糖醇 500μg/ml BSA ３．Ｔ４ＤＮＡ连接酶 ４．5mM ATP
定，折衷方法是１２℃过夜。
3. ＤＮＡ的平末端和粘性末端
由于内切酶产生的ＤＮＡ末端有平末端和粘 性末端，因而连接反应中就有平未端连接和 粘性末端连接。 二者连接效率不同。
粘性末端效率高，因而在底物浓度，酶浓度 选择上是有差异的，
4.碱性磷酸酶处理质粒载体
为了提高连接效率，一般采取提高ＤＮＡ的浓度， 增加重组子比例。这样就会出现ＤＮＡ自生连接 问题， 为此通常选择对质粒载体用碱性磷酸酶 处理，除去其５’末端的磷酸基，防止环化， 通过接反应后形成的缺口可在转化细胞后得以修 复。
加ＤＮＡse-free的BSA 可以起到稳定酶活性 的作用；
用硅化处理的器皿进行酶切可以提高酶活 性；
酶切所用器皿和ddH2O要经过高温灭菌方可 使用；
ＤＮＡ样品应不含重金属离子
ＤＮＡ片段的胶回收
电泳洗脱法 低熔点琼脂糖凝胶电泳挖块法 冻融回收法 玻璃奶回收法 柱回收法（按说明书进行）
5mM ATP
1μl
２．盖上管盖，充分混匀，台式离心扣上离心５秒。
３．１２℃下过夜连接反应。
４．反应结束后于－２０℃保存。
结果与分析
电泳检查连接结果： 如何判断连接效果的成功性？
Ｔ４ＤＮＡ连接酶作用机制
Ｔ４连接酶作用分三步： １.Ｔ４ＤＮＡ连接酶与辅助因子ＡＴＰ形成
酶－ＡＭＰ复合物。 ２.酶－ＡＭＰ复合物结合到具有５’－磷酸
基和３’－羟基切口的ＤＮＡ上，使ＤＮＡ 腺苷化。 ３.产生一个新的磷酸二酯键，把缺口封起来.
2.连接反应的温度
ＤＮＡ连接酶的最适反应温度为３７℃， 但在此温度下， 粘性末端的氢键结合很不稳
2．恒温水浴槽
五.注意事项
影响限制性内切酶活性的生物因子： 酶切割位点周围核苷酸两侧的碱基的性
质； 识别序列在ＤＮＡ中的分布频率； 与ＤＮＡ的构象有关（SC,L,OC）； ＤＮＡ的纯度（蛋白、氯仿、SDS、
EDTA、甘油等）；
内切酶用量不超过总反应体积的10%；
消化时间适当延长有利于提高酶活性；
第四部分 ＤＮＡ重组技术
－－ＤＮＡ的酶切、回收和连接转化
ＤＮＡ的酶切反应
分子生物学中经常使用的是II型限制性内切酶。 它能识别双链ＤＮＡ分子中特定的靶序列 （4～8bp),并在该序列内切断ＤＮＡ，形成特 有的粘末端或平端。
一、实验目的
掌握ＤＮＡ酶切的基本原理。 学习和了解限制性内切酶的使用方法。 学习和掌握ＤＮＡ片段胶回收的方法