流式细胞术检测指标流式细胞术提供的信息

细胞功能 细胞表面/胞浆/核的特 异性抗原 细胞活性 细胞内细胞因子 酶活性 激素结合位点 细胞受体 细胞凋亡
在上述信号基础上的细胞分选
流式细胞仪组成

液流系统：形成层流系统，聚焦细胞 光学系统：产生和收集光学信号 电子系统：光信号转化为电信号，进行信号处理
Fluidics Diagram
流式细胞术检测样本
0.4um
40um
流式细胞术检测指标

流式细胞术提供的信息： - 相对细胞大小 - 相对细胞颗粒密度和内部复杂度 - 染色过细胞的相对荧光强度
流式细胞术的应用
细胞结构 细胞大小 细胞粒度 DNA含量与细胞周期 RNA含量 蛋白质含量 染色体分析

1.) Compensation - Too Little; Too Much
2.) Basic Principles of Compensation % Compensation is independent of fluorescence intensity
Fraction
A B C D E
数据分析
流式数据 – 直方图 – 散点图 – 等高线图 – 密度图 – 三维图 – 统计数据
直方图
直方图(Distribution Histogram) – 横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度，单位是 对数，可以是线性或对数坐标。 – 纵坐标一般是细胞数。
散点图
散点图(Dot Plot) – X坐标为该细胞一参数相对含量，Y坐标为该细胞另一 参数的含量，可以将细胞亚群分开。
等高线图和密度图
三维图
统计数据
Events 百分比 平均荧光强度 荧光中位值 CV SD ……
数据获取与分析
电压 阈值 补偿 画图 设门 统计
获得数据
Thanks!
存储于电脑上
回顾
流式细胞仪的三大组成部分？
滤光片LP600代表什么意思？BP400/40呢？
数据采集

三种数据： - 前向散射光FSC - 侧向散射光SSC - 各种荧光散射光FL1，FL2，FL3，FL4
数据采集-前向散射光

当使用激光光源时，在前向方向（和激光行进的方向相同）上可 用前向散射光接收通道接收到一定量的散射光
流式细胞仪背景知识
总览

流式细胞术基本知识 流式细胞仪的组成 数据采集与分析
流式细胞技术是什么？
Flow Cytometry Flow:Fluid Cyto:Cell

Metry:Measurement
流式细胞术 – 在流动的状态中检测细胞或颗粒的各项特性 – 特异性强，灵敏度高，速度快，并能实现多参数分析 – 可检测的样本种类多样：外周血，骨髓，细胞穿刺液，洗脱 液，实体组织，培养细胞，微生物
阈值
可以以任意参数及多个参数的组合作为阈值 大多数样本都可以设定FSC/SSC 阈值以下的信号不存储 根据阴性对照管来调节 目的是将不需要的杂质信号，噪音信号，无用的细胞 信号等扣除，使收集到的都是有用信号
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补偿
补偿方式：任意两个通道之间，可以采用手动或自动 补偿。 补偿的调节:根据单染对照管来调节
1000
% Compensation is independent of fluorescence intensity
100
FL2
10
1
0.1 0.1 1 10 100 1000
FL1 (FITC)
Fraction A B C D E
FL2 - %FL1 21.3 22.0 20.2 20.5 21.4

前向散射光的强度是和细胞或其他检测颗粒的大小、形状密切相 关的
数据采集-侧向散射光


当激光光源被使用时，侧向也有一定量的散射光产生， 可以用90o 角的侧向散射光检测通道来采集 侧向散射光的强度和细胞或其他检测颗粒的颗粒密度、内部复杂程度密 切相关
外周全血细胞散射光双参数点 图
颗粒杂质、气泡 对检测的影响
LP 500
SP 500
BP500/50
电子系统
Laser
Voltage Time Voltage
Laser
Time
Voltage Time
Laser
电子系统
电子系统
Review
液流系统
悬浮状态的细胞 单个流过流动室 细胞被激发
光学系统
产生散射光和荧光 信号
电子系统
信号被采集 转换成数字信号
液流系统
光学系统


激发光学系统包括: - 激光器 - 透镜和反射镜，将激光引导到检测区域 收集光学系统包括: - 滤光片，将产生的光信号引导到对应的光学接收器
光学系统
光学系统-滤光片
Longpass
460 500 540
Shortpass
460 500 540
Bandpass
460 500 540
数据采集-荧光信号
细胞标记上荧光物质后，这种荧光物质要求特定波长 的激发光来激发，同时发出特定波长的光 荧光物质被激发以后产生的发射光将由特定的荧光通 道来接收 特定检测是通过光学滤片和透镜来控制的

荧光强度是和细胞上标记上的荧光染料的量正相关
数据采集
电压
信号放大方式：log、lin 信号类型：A,W,H 电压的调节:根据阴性对照管来调节
3.) CompensationToo Dim, Too Bright Compensation Controls
Small errors in compensation of a dim control (A) can result in large compensation errors with bright reagents (B & C).
Sheath Flow
sheath tank
Sample Flow
test tube or plate
sheath filter
sheath interior reservoir bubble filter
sample injection tube (SIT)
flow cell
interrogation point waste interior reservoir waste tank