应用微生物学实验指导

应用微生物学实验指导

鲁东大学生命科学学院

2012年

实验一营养缺陷型突变株的筛选

一、实验原理：

用某些物理因素或化学因素处理微生物，使基因发生突变，丧失合成某一物质（如氨基酸、维生素、核苷酸等）的能力，因而它们不能在基本培养基上生长，必须补充某些物质才能生长。这样从野生型经诱变筛选得到的菌株，称为营养缺陷型。营养缺陷型菌株不仅在生产中可直接作发酵生产核苷酸、氨基酸等中间产物的生产菌，而且在科学实验中也是研究代谢途径的好材料和研究杂交、转化、转导、原生质融合等遗传规律必不可少的遗传标记菌种。

营养缺陷型的筛选与鉴定涉及下列几种培养基：基本培养基（MM，符号为[-]）是指仅能满足某微生物的野生型菌株生长所需的最低成分的合成培养基。完全培养基(CM，符号为[+])是指可满足某种微生物的一切营养缺陷型菌株的营养需要的天然或半合成培养基。补充培养基（SM，符号为[A]或[B]等）是指在基本培养基中添加某种营养物质以满足该营养物质缺陷型菌株生长需求的合成或半合成培养基。

营养缺陷型的筛选一般要经过诱变、淘汰野生型、检出和鉴定营养缺陷型四个环节。现分述如下：

第一步，诱变剂处理：诱变剂的作用主要是提高突变频率，它分为物理和化学的二类。物理诱变剂常用的有X射线、紫外线、快中子、γ射线等诱变处理首先是选择诱变剂，微生物诱变中最常用的物理诱变剂是紫外线。

诱变剂所处理的微生物，一般要求呈单核的单细胞或单孢子的悬浮液，分布均匀，这样可以避免出现不纯的菌落。用于诱变处理的微生物一般处于对数生长期，那时的细菌对诱变剂的反应最灵敏。

诱变处理必须选择合适的剂量，剂量的表示有二种，绝对剂量和相对剂量。绝对剂量的单位以尔格/cm2表示，一般用相对剂量。相对剂量与三个因素有关，这三个因素是：诱变源和处理微生物的距离，诱变源（紫外灯）的功率，以及处理的时间。前二个因素是固定的，所以通过处理时间控制诱变剂量。各种微生物的处理最适剂量是不同的，须经预备实验确定。

第二步，淘汰野生型：在诱变后的存活个体中，营养缺陷型的比例一般较低。

通过以下的抗生素法或菌丝过滤法就可淘汰为数众多的野生型菌株即浓缩了营养缺陷型。

抗生素法：有青霉素法和制霉菌素法等数种。青霉素法适用于细菌，青霉素能抑制细菌细胞壁的生物合成，杀死正在繁殖的野生型细菌，但无法杀死正处于休止状态的营养缺陷型细菌。制霉菌素法则适合于真菌，制霉菌素可与真菌细胞膜上的甾醇作用，从而引起膜的损伤，也是只能杀死生长繁殖着的酵母菌或霉菌。在基本培养基中加入抗生素，野生型生长被杀死，营养缺陷型不能在基本培养基中生长而被保留下来。

菌丝过滤法：适用于进行丝状生长的真菌和放线菌。其原理是：在基本培养基中，野生型菌株的孢子能发芽成菌丝，而营养缺陷型的孢子则不能。通过过滤就可除去大部分野生型，保留下营养缺陷型。

第三步，检出缺陷型：具体方法很多。用一个培养皿即可检出的，有夹层培养法和限量补充培养法；在不同培养皿上分别进行对照和检出的，有逐个检出法和影印接种法。可根据实验要求和实验室具体条件加以选用。现分别介绍如下：夹层培养法：先在培养皿底部倒一薄层不含菌的基本培养基，待凝，添加一层混有经诱变剂处理菌液的基本培养基，其上再浇一薄层不含菌的基本培养基，经培养后，对首次出现的菌落用记号笔一一标在皿底。然后再加一层完全培养基，培养后新出现的小菌落多数都是营养缺陷型突变株。

限量补充培养法：把诱变处理后的细胞接种在含有微量（＜0.01%）蛋白胨的基本培养基平板上，野生型细胞就迅速长成较大的菌落，而营养缺陷型则缓慢生长成小菌落。若需获得某一特定营养缺陷型，可再在基本培养基中加入微量的相应物质。

逐个检出法：把经诱变处理的细胞群涂布在完全培养基的琼脂平板上，待长成单个菌落后，用接种针或灭过菌的牙签把这些单个菌落逐个整齐地分别接种到基本培养基平板和另一完全培养基平板上，使两个平板上的菌落位置严格对应。经培养后，如果在完全培养基平板的某一部位上长出菌落，而在基本培养基的相应位置上却不长，说明此乃营养缺陷型。

影印平板法：将诱变剂处理后的细胞群涂布在一完全培养基平板上，经培养长出许多菌落。用特殊工具——“印章”把此平板上的全部菌落转印到另一基本

培养基平板上。经培养后，比较前后两个平板上长出的菌落。如果发现在前一培养基平板上的某一部位长有菌落，而在后一平板上的相应部位却呈空白，说明这就是一个营养缺陷型突变株。

第四步，鉴定缺陷型：可借生长谱法进行。生长谱法是指在混有供试菌的平板表面点加微量营养物，视某营养物的周围有否长菌来确定该供试菌的营养要求的一种快速、直观的方法。用此法鉴定营养缺陷型的操作是：把生长在完全培养液里的营养缺陷型细胞经离心和无菌水清洗后，配成适当浓度的悬液（如107～108个／ml），取0.1ml与基本培养基均匀混合后，倾注在培养皿内，待凝固、表面干燥后，在皿背划几个区，然后在平板上按区加上微量待鉴定缺陷型所需的营养物粉末（用滤纸片法也可），例如氨基酸、维生素、嘌呤或嘧啶碱基等。经培养后，如发现某一营养物的周围有生长圈，就说明此菌就是该营养物的缺陷型突变株。用类似方法还可测定双重或多重营养缺陷型。

本实验是用紫外线来诱发突变，并用青霉素法淘汰野生型，最后经生长谱法鉴定细菌的营养缺陷型。

二、实验材料

菌种：枯草芽孢杆菌（B.subtilisi）。

三、实验器具和药品

1.用具：灭菌培养皿（9厘米），灭菌三角烧瓶（250毫升），灭菌吸管（1.0毫升），灭菌离心管。

2.培养基：

（1）细菌完全培养基（肉汤液体培养基，CM）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl 0.5克，蒸馏水100毫升，pH7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。

（2）加倍肉汤液体培养基（ZE）：牛肉膏0.5克，蛋白胨1克，NaCl 0.5克，蒸馏水50毫升，pH 7.2，高压灭菌15磅/英寸2 15分钟。

（3）基本液体培养基（MM）：K2HPO4 0.4克，KH2PO40.6克，柠檬酸钠·3H2O 0.1克，MgSO4·7H2O 0.02克，葡萄糖0.5克，（NH4）2SO4 0.2 克，蒸馏水100毫升，pH 7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。。

（4）基本固体培养基：琼脂2克，基本液体培养基100毫升，pH 7.0，高压灭菌8磅/英寸2 30分钟。