酵母蔗糖酶的分离提取 (修复的)
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告一、实验目的本实验旨在学习酵母蔗糖酶的提取方法，并掌握其酶活力的测定方法。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种重要的生物催化剂，广泛应用于食品工业、医药工业等领域。
其提取方法主要包括细胞破碎法和超声波法。
细胞破碎法是将酵母细胞经过离心、洗涤后，在低温下使用高压均质机或超声波仪器进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
而超声波法则是将细胞悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
三、实验步骤1. 酵母菌体培养：将活性酵母菌体接种到含有10%蔗糖和0.5%酵母粉的液体培养基中，在30℃下静置48小时。
2. 细胞破碎：将培养好的菌体通过离心后洗涤两次，然后在低温下使用高压均质机进行破碎，使得蛋白质与其他杂质分离。
3. 超声波处理：将菌体悬液经过超声波处理，使得细胞壁裂开，释放出内部的蛋白质。
4. 酶活力测定：取一定量的提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，在37℃下反应30分钟后用硫酸铜试剂测定还原糖的含量。
四、实验结果通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，测得其酶活力分别为10.5 U/g和12.8 U/g。
五、实验分析1. 细胞破碎法和超声波法都可以用于酵母蔗糖酶的提取，但是超声波法更加快速、高效。
2. 酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意培养基成分和温度等因素。
3. 酵母蔗糖酶的测定方法可以采用硫酸铜法，但是也可以采用其他方法，如比色法和光度法等。
六、实验结论本实验通过细胞破碎和超声波法两种方法提取酵母蔗糖酶，并测定了其酶活力。
结果表明，超声波法更加高效。
同时，酵母菌体培养条件对于酵母蔗糖酶的产生有较大影响，应该注意调整培养条件。
最后，硫酸铜法可以用于测定酵母蔗糖酶的活力。
酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定的改进方法
一、背景介绍酵母蔗糖酶是一种重要的酶类，它在葡萄糖代谢途径中起着关键作用。
酵母蔗糖酶的提取纯化及酶活测定是生物化学与分子生物学研究中常见的实验操作。
在这个过程中，酵母蔗糖酶的纯化程度和酶活测定的准确性直接影响着后续的实验结果。
二、传统提取纯化及酶活测定方法存在的问题1. 低纯度：传统的提取纯化方法往往不能够完全去除其他蛋白质或杂质，导致提取的酵母蔗糖酶纯度较低。
2. 酶活测定不精准：常见的酶活测定方法对于活性较低的酶样本测定效果较差，难以得到准确的酶活性数据。
3. 操作繁琐：传统方法需要多次离心、沉淀和洗涤等步骤，耗时且操作繁琐。
三、改进方法鉴于传统方法存在的问题，我们提出了一种改进的酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定方法，主要包括以下几个关键步骤：1. 酵母蔗糖酶提取（1）酵母细胞破碎：采用超声波破碎或高压破碎技术，将酵母细胞有效破碎，释放出蔗糖酶。
（2）蛋白质沉淀：利用差速离心法或特定沉淀剂沉淀出目标蛋白质，提高酶的纯度。
2. 酶活测定（1）比色法测定：采用改良的Folin-Phenol比色法，提高对酶活性的测定准确性。
（2）酶活性计算：采用新的酶活性计算公式，更准确地反映酶的活性水平。
四、结果与讨论我们采用改进方法对酵母蔗糖酶进行提取纯化及酶活测定，得到的结果表明，与传统方法相比，改进方法在以下几个方面有了显著改善：1. 提取纯化效果显著：采用改进方法提取的酵母蔗糖酶纯度明显提高，杂质含量大幅降低。
2. 酶活测定更准确：采用改进方法测定的酶活性数据更为准确可靠，对活性较低的酶样本也能够进行精准测定。
3. 操作简便高效：改进方法简化了提取纯化的操作步骤，减少了操作时间，提高了实验效率。
五、结论我们的改进方法在酵母蔗糖酶提取纯化及酶活测定中取得了良好的效果，显著提高了酶的纯度和活性测定的准确性，为相关领域的研究提供了重要的实验技术支持。
该方法的推广应用将有助于推动相关研究领域的发展，促进酵母蔗糖酶的深入研究和应用。
酵母蔗糖酶的提取实验报告
酵母蔗糖酶的提取实验报告酵母蔗糖酶的提取实验报告1. 引言酵母蔗糖酶是一种重要的酶，在许多生物过程中起着关键作用。
通过提取酵母蔗糖酶，我们可以深入了解其结构和功能，以及其在实际应用中的潜力。
本实验旨在通过一系列步骤，从酵母细胞中提取酵母蔗糖酶，并评估其活性和效果。
2. 方法和材料2.1 材料- 新鲜酵母菌浆液- 蒸馏水- 磷酸缓冲液- 蔗糖溶液- 高速冷离心机- 低速冷离心机- 离心管- 离心管架- 塑料吸管- 双室温度计- 分光光度计- 试管2.2 实验步骤步骤1：制备酵母酶提取液a) 将10ml新鲜酵母菌浆液倒入离心管中，并以1500rpm的速度在低温下离心10分钟。
b) 将上清液转移至另一个离心管中，再次进行高速离心，以去除细胞碎片。
步骤2：沉淀酵母蔗糖酶a) 将上一步中得到的上清液倒入一个含有7ml蔗糖溶液的试管中。
b) 在室温下孵育搅拌2小时，让酵母蔗糖酶与蔗糖结合形成沉淀。
c) 用低速离心将沉淀分离。
收集上清液备用。
步骤3：测定酵母蔗糖酶活性a) 在分光光度计中设置波长为540nm。
b) 取1ml上清液和1ml磷酸缓冲液混合，作为空白对照。
c) 另取1ml上清液和1ml含20%蔗糖溶液的试管中，作为实验组。
d) 在不同时间点（例如0、1、2、3、4分钟）测定两个试管的吸光度，并记录数据。
e) 计算酵母蔗糖酶的活性。
3. 结果与讨论通过以上实验步骤，我们成功地提取了酵母蔗糖酶，并可以测定其活性。
根据测定结果，我们观察到酵母蔗糖酶在一定时间范围内对蔗糖的降解表现出线性增加的趋势。
这表明酵母蔗糖酶在一定程度上具有稳定的催化作用。
通过本实验，我们还可以根据酵母蔗糖酶的活性表征其在不同条件下的稳定性、催化效率和适应性。
我们可以改变温度和pH值，观察对酵母蔗糖酶活性的影响，从而了解其最适宜的操作条件。
通过进一步的研究，我们还可以探索酵母蔗糖酶在生物制药、食品加工和能源生产等领域的应用潜力。
总结回顾：通过酵母蔗糖酶的提取实验，我们深入了解了酵母蔗糖酶的结构、功能和应用前景。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法酵母蔗糖酶是重要的糖分解酶，它可以被用来制造蔗糖、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物。
因此，它在化工、食品、制药行业中有着重要的应用价值。
本文介绍了从发酵酵母或发酵液中提取酵母蔗糖酶的方法。
一、原料准备首先，准备发酵酵母或发酵液。
发酵酵母可以使用乳酸乳杆菌培养基发酵培养，得到的酵母菌可以悬浮在一定的温度和 pH 下曝气发酵，以获得最大的效果。
发酵液可以采用蔗糖和氨基酸等制备，并需要调节合适的 pH温度，可以提高酶的活性。
二、提取酵母蔗糖酶1.发酵酵母或发酵液放入滤器，用中压过滤来滤出悬浮体；2.过滤得到的酵母蔗糖酶悬浮液中加入NaCl，来降低活性；3.溶液中的毛细管类蛋白分离出来，加入45%的乙醇萃取分离；4.溶液冷冻至冰点，冻干抽滤以获得纯化的蔗糖酶；5. 从冻干抽滤物中继续利用膜精制器以及离子交换柱等方式，将蔗糖酶高纯度分离出来；6.高纯度蔗糖酶经过适当稀释处理，可获得最终产品。
三、性能测试为了判定提取的酵母蔗糖酶的性能，需要进行一系列的性能测试，这些测试可以用来检测酶的活性、热稳定性、抗菌性以及稳定性等。
通过这些测试，可以确定提取的酵母蔗糖酶的性能，从而确保它能够满足采用的要求。
四、应用实践酵母蔗糖酶的提取方法在实际应用中几乎是必不可少的，它可以用来生产糖浆、糖精、酒精、淀粉、葡萄糖以及蔗糖衍生物等，常用于食品加工、精细化工、制药行业等。
此外，这种提取方法还可以应用于糖类合成、氨基酸修饰等方面，发挥着重要的作用。
综上所述，酵母蔗糖酶是一种重要的糖分解酶，用于生产糖类衍生物，它的提取方法包括发酵酵母或发酵液的原料准备、提取、性能测试以及应用实践等，是一项重要的工作。
只有抓住机会，把提取的酵母蔗糖酶用好，才能实现糖分解酶的高效利用。
酵母蔗糖酶的分离纯化
低温保持酶活性
蔗糖酶提取步骤
1.破碎细胞 10g左右的干酵母+20ml甲苯，研磨5分钟，加水
10-15ml，研磨5-10分钟，重复加水研磨，共加3 次水，离心12000rpm,4℃，5-10分钟。共分3层， 上层白色为甲苯及其抽提物，中间为水层(含酶)， 下层为细胞碎片沉淀(甲苯和水体积不用准确） 2.抽提(第一组分) 取中间水层于干净离心管，12000rpm, 4℃，510分钟，上清取出量体积并记为V1，然后留2ml保 存于冰上后面做检测，其余的样品（V1-2ml）继续 进行纯化
酵母蔗糖酶的分离纯化
生化技术综合系列实验(一)
原理
生物大分子 蛋白质 酶
生物大分子提取基本步骤
材料 破细胞
提取
检测
பைடு நூலகம்
纯化
酶是生物体内具有催化功能的蛋白质， 可据酶蛋白的结构和性质选择分离提纯条件 和含量测定方法。
酶分离提纯的总目标是提高纯度（或比 活力）及收率；依据在溶液中的性质（分子 大小、溶解度、电荷、吸附等）进行分离;
将留下的一、二、三组分样标记清楚后保存于-20 ℃ 冰箱中。
注意事项
1.低温 2.一、二、三组分的准确体积V1、V2、V3 3.标记 4.离心后弃、留 5.记录现象
3.热抽提(第二组分)
调pH约5.0(加5滴1M醋酸即可)，50℃，摇动或搅 拌20分钟，冰浴冷却3分钟， 12000rpm, 4℃，5-10 分钟，量取上清体积(V2)，留2ml保存于冰上检测。 其余样（V2-2ml)继续提纯。
4.乙醇沉淀(第三组分)
酵母蔗糖酶实验报告
一、实验目的1. 学习酵母蔗糖酶的提取方法。
2. 掌握酶活力测定的原理和方法。
3. 了解酶的专一性及其影响因素。
二、实验原理酵母蔗糖酶是一种能够催化蔗糖水解成葡萄糖和果糖的酶。
本实验通过提取酵母细胞中的蔗糖酶，并在一定条件下测定其活力，以了解其催化活性。
三、实验材料与仪器材料：1. 酵母粉2. 蔗糖3. 缓冲液4. 斐林试剂5. 旋光仪仪器：1. 电子天平2. 研钵3. 移液器4. 恒温水浴锅5. 烧杯6. 试管7. 离心机四、实验步骤1. 酵母蔗糖酶的提取- 称取适量酵母粉，加入少量蒸馏水，研磨成匀浆。
- 将匀浆转移至离心管中，离心分离，收集上清液即为酵母蔗糖酶提取液。
2. 酶活力测定- 取适量提取液，加入含有蔗糖的缓冲液，置于恒温水浴锅中保温。
- 定时取样，用斐林试剂检测反应液中的还原糖含量。
- 根据还原糖含量计算酶活力。
3. 酶的专一性实验- 将提取液分别与蔗糖、淀粉等底物反应，观察酶的催化活性。
- 对比实验结果，分析酶的专一性。
4. 影响酶活力的因素实验- 分别在酸性、中性、碱性条件下进行酶活力测定，观察pH对酶活力的影响。
- 分别在不同温度下进行酶活力测定，观察温度对酶活力的影响。
五、实验结果与分析1. 酶活力测定- 酵母蔗糖酶提取液在37℃、pH 6.8条件下，酶活力最高，约为0.5单位/毫升。
2. 酶的专一性实验- 酵母蔗糖酶对蔗糖具有特异性催化作用，而对淀粉无催化活性。
3. 影响酶活力的因素实验- 酶活力受pH和温度的影响较大。
在pH 6.8、37℃条件下，酶活力最高；在酸性或碱性条件下，酶活力明显降低；在低温条件下，酶活力较低。
六、实验结论1. 成功提取了酵母蔗糖酶，并测定了其活力。
2. 酵母蔗糖酶具有特异性催化作用，对蔗糖具有高效催化活性。
3. 酶活力受pH和温度的影响较大，适宜的pH和温度有利于提高酶活力。
七、实验讨论1. 本实验中，酶活力的测定方法较为简单，但结果准确可靠。
酵母蔗糖酶的分离提取 (修复的)
酵母蔗糖酶的分离提取摘要：介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的过程和方法。
利用有机溶剂自溶法、质量分数50%乙醇分级和透析的方法纯化蔗糖酶，测得蔗糖酶的总活力和蛋白质含量均逐渐下降。
关键词：酵母、蔗糖酶、提取、纯化Abstract:This paper introduces the process and the method of invertase extraction from yeast.Then the purified invertase was obtained by adding organic dissolvant,precipitatation with 50% ethyl alcohol and dialyzing。
The results showed the whole vigour and the content of potein was all decreased by degrees.Key words:yeast;invertase;extraction;purification蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）,又称转化酶，特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济效益，蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5.1.材料与方法1.1试剂1)酵母粉（实验室提供）2)醋酸钠(0.5g)3)乙酸乙酯（8ml）4)10%醋酸5)无水乙醇6)蒸馏水7)3,5-二硝酸水杨酸试剂（DNS）8)考马斯亮蓝G-5209)5%蔗糖10)NaOH溶液11)系列标准蛋白液12)9%生理盐水13)蛋白质染色液14)磷酸缓冲液buffer（0.005mol/L PH6.0）注：整个实验应避免高温，以防止酶失活（水浴温35℃）1.2器材1)量筒25ml2)烧杯100ml、500ml3)大小试管若干4)吸耳球、玻棒、胶头滴管、PH试纸、各种滴定管5)恒温水浴锅、冰水浴锅6)秒表7)离心管、离心机8)分光光度计9)冰箱10)透析袋11)托盘天平1.3操作方法1.3.1蔗糖酶粗品制备方法1）自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次地加入15mL蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。
生化综合实验-酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究
酵母蔗糖酶的提取及其性质的研究一、蔗糖酶的制备1、提取称取14.997g干酵母粉于250ml小烧杯中，少量多次地加入50ml蒸馏水，搅拌均匀。
成糊状后加入1.499g乙酸钠、25ml乙酸乙酯，搅匀。
再于35℃恒温水浴中搅拌30min，然后补加30ml蒸馏水，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜。
之后，1000r/min离心10min，抽取酯层后再次离心，得到无细胞提取液。
用1M HCl将其PH调至5.0，即可得到级分Ⅰ。
（取出3ml于冰箱中保存）2、热处理（1）盛有粗级分Ⅰ的离心管放入50℃水浴中保温30min，在保温过程中不断轻摇离心管。
（2）取出离心管，于冰浴中迅速冷却，用4℃，1000r/min离心10min。
（3）上清液即为热级分Ⅱ。
（取出3ml于冰箱中保存）3、乙醇沉淀将热级分Ⅱ转入小烧杯中，放入冰浴，逐滴加入等体积预冷的95%乙醇，同时轻轻搅拌（此过程共需30 min）。
然后在冰浴中静置10 min，以沉淀完全。
然后4℃，1000r/min离心10min。
倾去上清，并滴干。
将沉淀保存于离心管中，冷冻保存，此即级分Ⅲ。
二、蔗糖酶的纯化将3ml级分Ⅲ加入洗脱柱中进行梯度洗脱。
及洗脱峰图如下：三、蔗糖酶各级分活性及蛋白质含量的测定（一）还原糖含量测定1、各级分稀释倍数的确定级分Ⅰ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅱ：取50μl稀释至1.5ml（30倍）级分Ⅲ：取50μl稀释至15ml（300倍）取20μl稀释至2ml（100倍）释100倍。
在上述表格中，Glu含量是由标准曲线求得的，E'=Glu含量*稀释倍数/（10 min*0.6 ml）Units=0.6 ml/Glu平均含量/2/10min/稀释倍数由洗脱峰可知，第二个和第三个峰最有可能是目标蛋白（第一个峰一般情况下是杂蛋备注：由测定数据可知，第二个峰不是目标蛋白，第三个峰为目标蛋白。
（二）蛋白质含量测定1、各级分稀释倍数的确定由以上数据可知，级分Ⅰ和级分Ⅱ不需稀释，级分Ⅲ需稀释5倍。
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测
蔗糖酶的提取、分离、纯化及活性检测摘要随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究还是其他研究，越来越需要纯度更高的酶制剂，这就要求我们熟悉酶提纯的一般操作步骤及酶的提纯及活力测定等重要的生物实验技术。
本次实验主要通过提取啤酒酵母中的蔗糖酶并经过两次纯化测定其活力与Km。
在实验过程中用乙醇分级分离法，DEAE-Cellulose柱层析，分子筛（凝胶过滤）层析提取纯化蔗糖酶。
在实验过程中，虽然我们很努力,但由于我们对实验的程序不熟悉，因此在实验的一些过程中有一些明显的操作失误，使得实验的最后测定结果与理论值有一定出入。
关键词啤酒酵母蔗糖酶乙醇分级分离 DEAE-Cellulose柱层析分子筛层析Km前言生物体内所发生的一切化学反应，几乎都是在专一性酶的催化下进行的，因此酶的研究对了解生命活动的规律以及生命本质的阐述具有十分重要的意义。
随着分子生物学的发展，不论对酶分子本身作用机制的研究以及分子生物学其他重要课题的研究都越来越多地需要使用作用专一，纯度高的酶制剂。
这就要求人们建立各种方法，以便从各种生物来源的材料中分离提纯酶。
由于酶本身也是蛋白质，因此酶分离提存的方法大体上与蛋白质纯化方法相同，一般来说，没有一种固定的方法，而往往根据实验者所要分离提纯酶的取材以及酶本身的物理﹑化学及生物学性质来确定分离提纯方法。
各种酶的纯化通常有五个阶段：①材料的选择与预处理；②细胞破碎；③抽提；④纯化；⑤浓缩﹑干燥及保存。
酶分离纯化成功与否的重要标志：一是要有较高的收率；二是达到所要求的纯度，这两个指标通常是矛盾的，可根据需要来有所侧重，一般来说，好的方法与步骤应该是简单易行，最终的酶制剂有较高的收率和纯度。
就单独的每种分离提纯的方法而言，有盐析法、有机溶剂分级法、调PH分级沉淀法、选择变性法、吸附法、层析法（纸层析、薄板层析、柱层析等）。
其中盐析法是用于蛋白质和酶分离提纯的最早而且最广泛的一种方法，该方法是根据蛋白质和酶在一定浓度的溶液中溶解度的降低程度的不同而达到彼此分离的方法盐析法常用的中性盐有硫酸铵、硫酸镁、硫酸钠、氯化钠、磷酸钠等，其中用得最多的是硫酸铵，因为它具有温度系数小而溶解度大的优点。
浙江大学生物化学实验甲 复件 酵母蔗糖酶的提取原理
酵母蔗糖酶的制备原理
一、蔗糖酶(invertase or sucrase)简介
蔗糖酶（EC.3.2.1.26）为水解酶类，主要存在于酵母中，如啤酒酵母、面包酵母，也存在于曲霉、青霉和毛霉等霉菌和细菌及植物中，可专一性地催化蔗糖水解为果糖和葡萄糖的反应。
酵母蔗糖酶的分子量约270000D（因来源不同，分子量有差异），pI约5.6，最适pH4.6，耐酸和热，最适温度50℃。
耐乙醇，因此可用乙醇沉淀进行分离纯化。
二、酵母蔗糖酶的分离纯化
本试验分离纯化酵母蔗糖酶分四步：甲苯抽提，加热纯化，乙醇分级沉淀，离子交换柱层析分离纯化。
前三步分离纯化的原理如下：
甲苯石英砂离心上层（甲苯层）：脂溶性物质
酵母细胞破细胞中层（水层）：蔗糖酶，可溶性糖等
研磨下层（沉淀）：细胞碎片、变性蛋白等
取中层50℃水浴中上清：蔗糖酶、可溶性糖等
（水层）保温30分钟沉淀：变性蛋白
取上清加乙醇使蔗糖酶沉淀上清：杂蛋白及可溶性糖等
冰浴中20分钟沉淀：蔗糖酶、杂蛋白等
三、蔗糖酶活力的测定原理
蔗糖酶
蔗糖葡萄糖+ 果糖(G和F都具半缩醛羟基，该半缩醛羟基可被pH4.5~5.5 氧化为羧基，这样的糖称还原糖)
OH -
还原糖+ 3，5-二硝基水杨酸糖酸+ 3-氨基-5-硝基水杨酸
△（棕红色，540nm处具特征光吸收，OD值与
还原糖含量成正比，可据此进行比色测定）蔗糖酶活力单位定义：一定条件下（50℃，pH4.6），一分钟内能产生1mg 还原糖的酶量。
有不舒服记得找医生，千万不要小不舒服酿成大问题。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法摘要：采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶，经质量分数50%的乙醇分级沉淀、MonoQ阴离子交换柱层析纯化后，制得高纯度的酵母蔗糖酶。
比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究。
纯化的酶经等电聚焦测定，等电点为5.6，SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60kD。
以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013mol／L。
结果显示3种提取方法各有优劣，冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法。
其中SDS抽提法的效率最高，加之其操作简便，更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取。
关键词：酵母；蔗糖酶；提取；纯化蔗糖酶(Sucrase，EC 3．2．1．26)又称转化酶(Invertase)。
可作用于B一1，2糖苷键，将蔗糖水解为D-葡萄糖和D-果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1．36～1．60倍，在工业上具有较高的经济价值。
可用以转化蔗糖，增加甜味，制造人造蜂蜜，防止高浓度糖浆中的蔗糖析出，制造含果糖和巧克力的软心糖，还可为果葡糖浆的工业化生产提供新的方法。
目前关于酵母中蔗糖酶提取纯化方面的研究较多，以甲苯自溶法最为常见。
作者采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种不同的方法从酵母中提取蔗糖酶，将冻融法和SDS法提取的蔗糖酶进一步纯化，并对其基本性质进行了研究。
通过不同提取方法的比较，为酵母蔗糖酶在食品工业中的应用和蔗糖酶基因工程产品的下游技术开发，提供了实验依据。
1材料与方法1．1材料酵母，安琪酵母股份有限公司提供；MonoQ(10／10)阴离子交换层析柱、PhastGelIEF3-9胶，Amersham公司提供。
1．2主要化学试剂和仪器十二烷基硫酸钠(SDS)，Serva公司提供；等电点标准品，Amersham公司提供；其余试剂均为国产分析纯或生化试剂。
UV一2201型紫外可见光分光光度计，Shimadzu公司制造；Waters650型高级蛋白纯化系统，Waters公司制造；PhastSystem全自动快速水平电泳仪，Amersham公司制造；高速冷冻离心机，Hitachi公司制造；冷冻干燥器，Labconco公司制造；电泳仪，Bio-Rad公司制造；精密酸度计，Orion公司制造。
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化——生化实验文档资料文档
实验六 酵母蔗糖酶的提取及纯化原理蔗糖酶（invertase ）（β—D —呋喃果糖苷果糖水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase ）（EC.3.2.1.26）特异地催化非还原糖中的α—呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成葡萄糖和果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
每水解1mol 蔗糖，就生成2mol 还原糖。
还原糖的测定有多种方法，本实验采用Nelson 比色法测定还原糖量，由此可得知蔗糖水解的速度。
在研究酶的性质、作用、反应动力学等问题时都需要使用高度纯化的酶制剂以避免干扰。
酶的提纯工作往往要求多种分离方法交替应用，才能得到较为满足的效果。
常用的提纯方法有盐析、有机溶剂沉淀、选择性变性、离子交换层析、凝胶过滤、亲和层析等。
酶蛋白在分离提纯过程中易变性失活，为能获得尽可能高的产率和纯度，在提纯操作中要始终注意保持酶的活性如在低温下操作等，这样才能收到较好的分离效果。
啤酒酵母中，蔗糖酶含量丰富。
本实验用新鲜啤酒酵母为原料，通过破碎细胞，热处理，乙醇沉淀，柱层析等步骤提取蔗糖酶，并对其性质进行测定。
一、蔗糖酶的提取与部分纯化（一）实验目的学习酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理（略） （三）实验仪器、材料及试剂 仪器1. 高速冷冻离心机、恒温水浴箱、－20℃冰箱2. 电子天平、研钵（＞200ml ）、制冰机、50ml 烧杯3. 离心管（2ml ，10ml ，30ml 或50ml ）、移液器（1000ul ）或滴管、量筒 材料及试剂1. 市售鲜啤酒酵母（低温保存）2. 石英砂（海沙）、甲苯（使用前预冷到0℃以下）3. 95%乙醇（预冷－20℃）、去离子水（使用前冷至4℃左右）4. Tris-HCl （pH7.3）缓冲液 （四）操作步骤 1. 提取＋ H 2O 蔗糖酶O HH O（1）将市售鲜啤酒酵母2000 rpm，离心10 min，除去大量水分。
实验三十八 (9)酵母蔗糖酶的提取
2、超声破碎法提取蔗糖酶(3组)
称取5 g酵母粉于小烧杯中，加入30 ml pH5.8的醋酸-醋 酸钠缓冲液用玻棒搅匀，在600W下处理，每工作3s停 3s（120个循环），形成菌体匀浆。此法的缺点是在处 理过程会产生大量的热，应在冰浴中进行。
破碎液摇匀后转入离心管，加10 ml 缓冲液洗涤烧杯后 并入离心管，8000 r/min离心10 min，取上清液，称为 “粗级分I”，测量其总体积V1，并留下5 ml用于蔗糖酶 活力测定。
酵母蔗糖酶的提取
实验原理
蔗糖酶属于水解酶，催化蔗糖水解为葡萄糖和果糖 ，本实验选用蔗糖酶含量丰富的酵母为材料提取。
从酵母细胞提取纯化蔗糖酶时，首先需设计合理的 提取方法将酵母细胞破碎（机械法、物理法、化学 法、酶法 ），使蔗糖酶释放出来得到粗酶液；粗 酶含有大量杂质，通过粗分级（沉淀技术、膜分离 技术）可以有效的除去大量的杂质并使酶蛋白得到 浓缩。
（3）酶活力测定
• 取5 ml 5%蔗糖溶液于试管，共加两管，于25℃水浴保温5min， 向其中一管加入蔗糖酶溶液1.0 ml，立即混匀并计时，准确反 应5min后，加入5.0 ml 0.1mol/L NaOH溶液终止酶反应。另一 对照管先加入5.0 ml 0.1 mol/L NaOH溶液，再加入蔗糖酶溶液 1.0 ml。 • 取比色管3支，第l、2支管分别加入上述反应液各1.0 ml及水各 1.0 ml，第3管加蒸馏水2.0 ml，然后各管均加3.0 ml DNS试剂。 置于沸水浴中5 min，取出后用自来水冷却3 min，加蒸馏水至 25 ml，混匀。以第3管调零点，测A520nm。以测定管的A520nm 值减去对照管A520nm值，求得的差值代入标准曲线上得到相应 的还原糖含量，求出各个粗级分的酶活力。 • 一个蔗糖酶活力单位定义为在上述条件下，每分钟催化底物 蔗糖水解产生1 mg还原糖所需的酶量。
实验十四___酵母蔗糖酶的提取纯化及活力测定
五、实验的主要仪器
1．冷冻离心机 2．研钵 3．恒温水浴箱 4．-20℃冰箱 5．梯度混合器 6．层析柱 (1×20cm)
六、实验操作流程
干酵母粉→加缓冲液研磨→离心→热处理→酒 精沉淀→离心→上清夜→上DEAE—Sepharose FF 柱→层析→活力检测
七、实验关键步骤：（以下各步骤除热处
Hale Waihona Puke 离子交换层析是常用的层析方法之一。它是在以离子 交换剂为固定相，液体为流动相的系统中进行的。离 子交换剂与水溶液中离子或离子化合物的反应主要以 离子交换方式进行，或者借助离子交换剂上电荷基团 对溶液中离子或离子化合物的吸附作用进行。这些过 程都是可逆的。在某一pH值的溶液中，不同的蛋白质 所带的电荷存在差异，因而与离子交换剂的亲和力就 有区别。当洗脱液的pH改变或者盐的离子强度逐渐提 高时，使某一种蛋白质的电荷被中和，与离子交换剂 的亲和力降低，不同的蛋白质按所带电荷的强弱逐一 被洗脱下来，达到分离的目的。
DEAE-Sepharose F F柱预先用20mmol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 平衡(约30ml流出液即可)，以流出液pH 与 buff 一致为准。上样后，用20 m mol/L Tris-HCl, pH7.3 buff 进行NaCl梯度洗脱(NaCl 为0.5mol/L),层 析柱连上梯度混合器，混合器中分别为50ml、 20mmol/L Tris-HCl, pH7.3缓冲液和50ml 20mmol/L Tris-HCl，pH7.3缓冲液，其中含0.5mol/L NaCl。
酶活力检测：
取试管若干支编号，各加入0.5mL 5%蔗糖 （pH4.6），每隔一管取100uL收集液，按先后顺 序分别加入上述含0.5mL 5%的蔗糖的试管中混匀， 置50℃水浴10min。再加入0.5mL 3,5-二硝基水杨 酸，于沸水浴中煮沸5min，用自来水冷却，直接 目测。即可确定酶活力高峰范围。
综合性实验1酵母蔗糖酶的分离纯化
综合性实验1酵母蔗糖酶的分离纯化（一）实验目的学习酵母蔗糖酶的提取和纯化方法，掌握各步骤的实验原理，并为后续实验提供一定量的蔗糖酶。
（二）实验原理酶是生物体内具有催化活性的物质，在人类生产生活和生命过程中起着非常重要的作用。
因此，酶学相关研究始终是生物学的重大课题。
酶的分离提纯是为了提高纯度（或比活力）及收率可据酶蛋白的结构和性质来选择分离提纯方法进行分离，同时用测定酶活力的方法了解酶的去向、衡量酶提纯的程度和得率。
蔗糖酶（Sucrase,EC3.2.1.26）又称转化酶，属于水解酶类，催化蔗糖分解成D-葡萄糖和D-果糖，是一种广泛存在于自然界中的糖苷酶[1]。
目前蔗糖酶已在农产品加工业[2]、食品工业[3-4]、医药行业[5-6]中发挥重要作用。
工业上一般从酵母中提取蔗糖酶[7]。
蔗糖酶在酵母细胞中存在着两种形式：存在于细胞壁中的高度糖基化的外蔗糖酶和细胞质中的低糖基化的内蔗糖酶。
外蔗糖酶活力占蔗糖酶活力的大部分，是含有50%（质量分数）糖成分的糖蛋白，该酶是蔗糖酶的主要形式。
本实验提取纯化的主要是外蔗糖酶。
酵母细胞的破壁方法主要有研磨法、酶解法、反复冻融法、超声波破碎法等[8]。
酶解法耗时长、费用高，机械研磨法操作复杂、损耗大等[9]。
超声波破碎法具有空化效应，产生机械剪切压力使细胞破碎，耗时短、费用低，损耗小。
本实验采用超声波破碎法破碎酵母细胞。
（三）实验仪器、材料及试剂1.仪器（1）美国SONICSVCX 750型超声波细胞破碎仪、Eppendorf多功能台式离心机5804R、恒温水浴箱、-20℃冰箱、电子天平、制冰机（2）离心管（2ml、1.5ml、50ml）、移液器、滴管、50ml量筒、50ml烧杯、玻璃棒2.材料及试剂（1）活性酵母粉（市售安琪酵母粉）（2）0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液（pH5.0）（3）95%乙醇（预冷-20℃）（四）操作步骤1.超声波法破碎酵母细胞（1）称取10g干酵母粉，放入冰预冷的50ml烧杯中，再加入30ml冰预冷的0.2mol/L乙酸钠-乙酸缓冲溶液，用玻璃棒搅拌均匀成糊状液体。
酵母蔗糖酶的提取方法
酵母蔗糖酶的提取方法李楠;庄苏星;丁益【期刊名称】《食品与生物技术学报》【年(卷),期】2007(026)004【摘要】采用甲苯自溶法、冻融法、SDS抽提法3种方法从酵母中提取蔗糖酶,经质量分数50%的乙醇分级沉淀、Mono Q阴离子交换柱层析纯化后,制得高纯度的酵母蔗糖酶.比较了上述3种提取方法并对该酶的部分性质进行了研究.纯化的酶经等电聚焦测定,等电点为5.6,SDS-PAGE鉴定其相对分子质量为60 kD.以蔗糖为底物测得酵母蔗糖酶的表观米氏常数Km为0.013 mol/L.结果显示3种提取方法各有优劣,冻融法和SDS抽提法的提取效率远高于传统的甲苯自溶法.其中SDS抽提法的效率最高,加之其操作简便,更适合于酵母蔗糖酶大规模的制备提取.【总页数】5页(P83-87)【作者】李楠;庄苏星;丁益【作者单位】南京大学,生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,江苏,南京,210093;南京大学,生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,江苏,南京,210093;南京大学,生命科学学院,医药生物技术国家重点实验室,江苏,南京,210093【正文语种】中文【中图分类】Q556.2;TS201.25【相关文献】1.超声破碎酵母细胞提取蔗糖酶条件优化 [J], 李聪;朱晓吉2.从啤酒酿造酵母中提取蔗糖酶及酶的性质研究 [J], 邹东恢;郭宏文3.人蔗糖酶卵黄抗体三种不同提取方法的比较 [J], 邵敏;王新颖;杜凤霞;冯昆;田忠;周鹤峰4.自制酵母蔗糖酶进行"酶的专一性"实验探究 [J], 夏天;李晖5.蛋白变性剂对酵母蔗糖酶及其修饰酶的催化活性影响及其作用分子机制 [J], 黎春怡;王丹菊;黄卓烈因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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酵母蔗糖酶的分离提取摘要：介绍了从酵母菌中提取蔗糖酶的过程和方法。
利用有机溶剂自溶法、质量分数50%乙醇分级和透析的方法纯化蔗糖酶，测得蔗糖酶的总活力和蛋白质含量均逐渐下降。
关键词：酵母、蔗糖酶、提取、纯化Abstract:This paper introduces the process and the method of invertase extraction from yeast.Then the purified invertase was obtained by adding organic dissolvant,precipitatation with 50% ethyl alcohol and dialyzing。
The results showed the whole vigour and the content of potein was all decreased by degrees.Key words:yeast;invertase;extraction;purification蔗糖酶（invertase）（β-D-呋喃果糖苷水解酶）（fructofuranoside fructohydrolase）（EC.3.2.1.26）,又称转化酶，特异地催化非还原糖中的β-D-呋喃果糖苷键水解，具有相对专一性。
不仅能催化蔗糖水解生成D-葡萄糖和D-果糖，也能催化棉子糖水解，生成密二糖和果糖。
由于果糖甜度高，约为蔗糖的1.36-1.60倍，在工业上具有较高的经济效益，蔗糖酶的最适温度为45℃~50℃，最适ph为4.0~4.5.1.材料与方法1.1试剂1)酵母粉（实验室提供）2)醋酸钠(0.5g)3)乙酸乙酯（8ml）4)10%醋酸5)无水乙醇6)蒸馏水7)3,5-二硝酸水杨酸试剂（DNS）8)考马斯亮蓝G-5209)5%蔗糖10)NaOH溶液11)系列标准蛋白液12)9%生理盐水13)蛋白质染色液14)磷酸缓冲液buffer（0.005mol/L PH6.0）注：整个实验应避免高温，以防止酶失活（水浴温35℃）1.2器材1)量筒25ml2)烧杯100ml、500ml3)大小试管若干4)吸耳球、玻棒、胶头滴管、PH试纸、各种滴定管5)恒温水浴锅、冰水浴锅6)秒表7)离心管、离心机8)分光光度计9)冰箱10)透析袋11)托盘天平1.3操作方法1.3.1蔗糖酶粗品制备方法1）自溶法将5g酵母粉倒入500mL烧杯中、少量多次地加入15mL蒸馏水，搅拌均匀，成糊状后加入0.5g乙酸钠、8mL乙酸乙酯，搅匀，盖好，于35℃恒温水浴中搅拌30min。
2）抽提补加蒸馏水10mL，搅匀，盖好，于35℃恒温过夜，4000r/min 离心10min,弃沉淀，得E1;量体积V1=17.5mL,取出2mL置于4℃冰箱保存，待测酶活力及蛋白质浓度(留样1)。
3）乙醇分级和透析测E1 PH：用10%HAC调PH至４．５（注意少量、慢加、搅匀，防止调过），共加入0.5ml 10%HAc;第一次乙醇分级（30%乙醇饱和度）：计算出使Ｅ１得乙醇浓度达30%时所需的无水乙醇Ｘ１的体积为6.6ml，将Ｅ１和乙醇Ｘ１，放入冰浴中预冷，在不断搅拌下缓慢滴加乙醇，4000ｒ／min离心10min，弃沉淀，留上清，得E2；量体积V2=19.5ml（留样２）;第二次乙醇分级（50%乙醇饱和度）同上法加入Ｘ２（为达50%乙醇饱和度时需要补加的无水乙醇的体积），计算的加入无水乙醇Ｘ２为7.0mL。
4000ｒ／min离心10min，弃上清，沉淀立即用10ml／150mol／LPH6.0的磷酸溶解，并装入透析袋，透析６小时，之后，4000ｒ／min离心10min，得E3，量体积V3＝11.0mL（留样３）;1.3.2测蔗糖酶活性方法取5%的蔗糖、酶液5ml分别于35℃水浴中预热5min[若酶浓度过高，用0.02mol/l的醋酸缓冲液（PH=4.7）适当稀释］。
从留样的2ml中取0.1ml稀释150-200倍，即得稀释后的酶液。
表1 蔗糖酶水解蔗糖试管0 1 ５％蔗糖（ｍＬ） 2 2１mol/ml NaOH（ｍＬ）0.5酶液（ｍＬ） 2 2３５℃水浴，３ｍｉｎ１mol/ml NaOH（ｍＬ）０.５表2 还原糖的测定试管0 1 2反应液（ｍＬ）０. ５（取自表１中０管）０. ５（取自表１中1管）０. ５（取自表１中1管）DNS试剂（ｍＬ）３３３水（ｍＬ）１.５１.５１.５沸水浴５ｍｉｎ后，立即流水冷却水（ｍＬ）２０２０２０OD520在葡萄糖标准曲线上找到所测定光吸收值对应的葡萄糖含量，按下面公式计算酶活力：蔗糖酶活力单位＝葡糖糖毫克数×９×酶的稀释倍数在本实验条件下，每３ｍｉｎ释放１毫克还原糖所需的酶量，定义为一个活力单位。
1.3.3葡萄糖浓度标准曲线在一定范围内还原糖的量与反应液的颜色强度成一定比例关系，可用于比色测定。
采用DNS 比色法测定还原糖的含量，同时用DNS闭塞定糖法测定蔗糖酶的活力。
表3 葡萄糖浓度标准曲线的制作项目空白 1 2 3 4 5 6含糖总量mg 0 0.8 1.2 1.6 2.0 2.4 2.8葡萄糖液ml 0 0.4 0.6 0.8 1.0 1.2 1.4蒸馏水ml 2.0 1.6 1.4 1.2 1.0 0.8 0.6DNS试剂ml 3 3 3 3 3 3 3加热均在沸水浴中加热5min冷却立即用流动冷水冷却蒸馏水ml 20 20 20 20 20 20 20光密度OD520nm以葡萄糖（mg）含量为横坐标、A520值纵坐标，画出工作曲线。
根据得到的葡萄糖曲线，得到公式为：y=0.0746x+0.00241.3.4蛋白质浓度测定——考马斯亮蓝G250染色法1）蛋白质标准曲线的制作表4 蛋白质定量测定标准曲线制作溶液０管１管２管３管４管５管留样1 留样1’系列标准蛋白液ｍＬ_ 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 0.5 0.5实际蛋白质含量ｕｇ_ 20 40 60 80 100 _ _0.9%生理盐水ｍＬ 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 _ _ _蛋白质染色液ｍＬ 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0轻轻摇匀，5min后以0号管调空白，595nm分光光度法测光密度值，汇出标准曲线。
未知样品从标准曲线上查出相应浓度经测定，得蛋白质含量与光密度值测定结果表5 蛋白质含量与光密度值测定结果根据得到的蛋白质曲线得到公式：Y=0.0543+5.985X2）蛋白质浓度测定从留样中取0.3ml 加0.9%的Nacl 稀释至3ml,再按以下表格操作测定表6 蛋白质浓度OD 值溶液对照组 留样1 留样1’ 系列标准蛋白液/ml — 0.5 0.5 0.9%生理盐水/ml 1.0 0.5 0.5 蛋白质染色液/ml 5.05.05.02结果经测量和计算得:表7 蔗糖酶活力单位样本 稀释倍数 OD520平均 1 2 E1 150 0.861 0.911 0.886 E2 1000.586 0.538 0.562 E31000.7610.7970.779表8 蛋白质浓度试管OD595E1 E2 E31 0.842 0.554 0.1812 0.939 0.526 0.190 平均0.891 0.540 0.186 蛋白质毫克数0.140 0.0812 0.0220表9 蔗糖酶分离提取效果计算结果留样体积ml 蛋白质浓度mg/ml总蛋白mg活力U/ml总活力U 比活力U/mg纯化倍数产量（回收率）1 17.5 2.800 49 799.54 13991.95 285.55 1 1002 19.5 1.624 31.668 337.55 6582.23 207.85 0.728 47.04%3 11.0 0.442 4.862 468.45 5152.95 1059.84 3.712 36.83%3.讨论与分析3.1由表9蔗糖酶分离提取效果计算结果可知，因为随着酶分离提取步骤越来越多，其回收率逐渐下降，则每次提取后得到酶的量逐渐减少，总蛋白的量及酶的总活力逐渐下降。
但是，纯化倍数逐渐升高，即酶在分离提取过程中，酶中含有的杂质越来越少，纯度越来越高，比活力也随之升高。
3.2在整个实验过程中，采用了自溶法、抽提、乙醇分级和透析的方法。
3.2.1细胞破壁：就酶在生物体内的分布，可分为胞内酶和胞外酶，蔗糖酶系胞内酶。
提取胞内酶时，要破碎组织和细胞，然后用一定的溶液提取，得到的材料称为无细胞抽提液。
材料不同，破壁的方法也不同。
我们用的酵母菌细胞破壁方法是：自溶法，即将菌体放在适当的pH 值和温度下，利用组织细胞自身的酶系将细胞壁破坏，使细胞内的物质释放出来。
3.2.2在离心抽提过程中，对称离心管必须使用托盘天平，以防止离心机震荡明显，造成事故。
同时，离心管底端不能破裂，以防止在离心过程中，高速旋转加快离心管的破裂程度。
测量过程中，应先测酶活力，再测蛋白质浓度。
因为测酶活力时，可将酶液做适当的稀释，倘若酶液浓度过高，可加大酶液的稀释倍数。
方便后续过程中对蛋白质浓度的测定。
3.2.3乙醇分级和透析对酶做了进一步的提纯，增加酶液的浓度和纯度。
其中，因为蔗糖酶的本质是蛋白质，所以透析原理是利用蛋白质分子不能通过半透膜的性质，使蛋白质和其他小分子物质如无机盐、单糖等分开。
透析是把待纯化的酶液装在半透膜的透析袋里，放入透析液中进行。
3.2.3蔗糖酶活力的测定过程中，试剂应该按照顺序加入，蔗糖酶水解蔗糖用的试剂中有1Mol/L的NaOH，该试剂起的作用是钝化蔗糖酶，倘若还原糖测定的OD520值很大，则因酶液的浓度很大，造成了NaOH的钝化作用不明显，所以测酶活力时，适当加大酶的稀释倍数。
除此之外，应该熟练掌握722S分光光度计的使用方法，具体操作流程：按MODE打到“T”，调100% ，拉杆，调“0”，按MODE打到”A”,再拉杆测量。
3.2.4蛋白质定量测定中，对于各留样应该设置平行实验和空白实验，两次测得的值取平均，减少实验的系统误差。
4.建议和改善4.1自溶法过程中，需加少量防腐剂，以防外界细菌污染。
自溶法的缺点是时间较长。
可采用其他方法进行。
酶的分离纯化有许多种方法，离心、过滤、膜分离、演习沉淀、等电点沉淀、选择性变性沉淀、离子交换层析、凝胶层析、亲和层析、凝胶电泳、有机溶剂萃取、浓缩、结晶等，在酶的分离纯化过程中，应该充分考虑避免酶的变性失活。
一般情况下，所有分离纯化操作都应在低温条件下进行，而且要防止过酸、过碱、重金属离子、变性剂、剧烈搅拌等因素对酶活性的影响。
近年来，高效液相层析（HPLC）和电泳技术越来越发达。
4.2测量时，应将剩余的酶液保存于适合温度下的冰箱中，以防止酶液的变性或失活。