SNP突变点检测方法进展( 完整版)
SNP检测方法汇总
TaqMan SNP基因分型技术方法：此技术是由美国Life technologies公司研发的SNP分型技术，其技术原理如下简介。
PCR 反应时，加入一对两端有不同荧光标记的特异探针来识别不同的等位基因（allele1和allele2），5’端为报告荧光基团（reporter），3’端为淬灭荧光基团(quencher)。
PCR过程中，两个探针能与正向引物和反向引物之间的互补序列特异退火结合。
当探针以完整形式存在时，由于能量共振转移，荧光基团只发出微弱荧光。
特异的探针与相应的等位基因杂合后，DNA聚合酶发挥5’到3’外切酶活性，把报告荧光基团切割下来，脱离了3’端淬灭荧光基团的淬灭作用(quench)，从而发出荧光。
两个探针的5’端标有不同的荧光(FAM或VIC)，3’端标有MGB 淬灭基团结合体。
根据检测到的不同荧光，可以判断相应的样本的SNP 等位基因型。
整个技术的示意图如下：应用领域：本方法适用于多个涉及到SNP分型的遗传研究领域。
尤其适合针对全基因组SNP 关联研究获得的初步阳性位点，以及全基因组测序得到的大量初筛突变位点进行进一步的大样品验证研究。
RFLP (多重荧光)SNP分型技术已知的很多SNP位点正好位于限制性内切酶的识别区域，针对这些SNP位点我们就可以使用此方法进行SNP分型。
尤其是对于大样品量的多个SNP分型来说，此方法的优势较为明显。
技术方法：RFLP技术于1980年由人类遗传学家Bostein提出。
它是第一代DNA分子标记技术。
Donis—Keller利用此技术于1987年构建成第一张人的遗传图谱。
DNA分子水平上的多态性检测技术是进行基因组研究的基础。
已被广泛用于基因组遗传图谱构建、基因定位以及生物进化和分类的研究。
RFLP是根据不同品种（个体）基因组的限制性内切酶的酶切位点碱基发生突变，或酶切位点之间发生了碱基的插入、缺失，导致酶切片段大小发生了变化，通过电泳将其区分。
SNP及检测技术
1定义：单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，SNP），主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性。
它是人类可遗传的变异中最常见的一种。
占所有已知多态性的90%以上。
SNP在人类基因组中广泛存在，平均每500～1000个碱基对中就有1个，估计其总数可达300万个甚至更多。
SNP所表现的多态性只涉及到单个碱基的变异，这种变异可由单个碱基的转换（transition）或颠换（transversion）所引起，也可由碱基的插入或缺失所致。
但通常所说的SNP并不包括后两种情况。
单核苷酸多态性（SNP）是指在基因组上单个核苷酸的变异，包括置换、颠换、缺失和插入。
所谓转换是指同型碱基之间的转换,如嘌呤与嘌呤( G2A) 、嘧啶与嘧啶( T2C) 间的替换;所谓颠换是指发生在嘌呤与嘧啶(A2T、A2C、C2G、G2T) 之间的替换。
从理论上来看每一个SNP 位点都可以有4 种不同的变异形式，但实际上发生的只有两种，即转换和颠换，二者之比为2：1。
SNP 在CG序列上出现最为频繁，而且多是C转换为T ，原因是CG中的C 常为甲基化的，自发地脱氨后即成为胸腺嘧啶。
一般而言，SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ，人类基因组上的SNP 总量大概是3 ×106个。
依据排列组合原理,SNP 一共可以有6种替换情况,即A/ G、A/ T、A/ C、C/ G、C/ T 和G/ T ,但事实上,转换的发生频率占多数,而且是C2T 转换为主,其原因是Cp G的C 是甲基化的,容易自发脱氨基形成胸腺嘧啶T , Cp G 也因此变为突变热点。
理论上讲，SNP既可能是二等位多态性，也可能是3个或4个等位多态性，但实际上，后两者非常少见，几乎可以忽略。
因此，通常所说的SNP都是二等位多态性的。
这种变异可能是转换（C T，在其互补链上则为G A），也可能是颠换（C A，G T，C G，A T）。
生物序列数据分析中的突变检测和信号分析研究
生物序列数据分析中的突变检测和信号分析研究随着生物学研究的不断深入，越来越多的生物序列数据被生成并积累下来。
这些数据包含大量的信息，对于揭示生物进化、疾病机制等方面有着重要的意义。
但是，这些数据也存在着一些问题，如噪声、测序错误等，这些问题对分析结果的准确性造成了影响。
在生物序列数据分析中，突变检测和信号分析是两个重要的研究领域。
本文将分别介绍这两个方向的研究进展和方法。
一、突变检测突变是指基因组序列发生改变，包括单核苷酸多态性（SNP）、插入/缺失（InDel）和结构变异（SV）等。
突变检测可以帮助我们了解不同物种的进化关系、研究疾病的发生机制等。
虽然现在有很多方法可以进行突变检测，但是由于生物序列数据一般比较大，算法复杂度较高，因此如何准确、高效地检测出突变点一直是研究人员的热点问题。
在目前的研究中，主要有两种突变检测的思路：比对法和非比对法。
比对法是将待检测序列与已知参考序列进行比对，找出相应的突变点。
常用的比对工具包括BWA、Bowtie、BLAST等。
非比对法则是直接对序列进行统计和分析，不需要参考序列。
常见的非比对工具有GATK、FreeBayes、VarScan等等。
虽然比对法和非比对法各有优缺点，但是随着技术的不断革新，两种方法之间的差距正在逐渐缩小。
一些研究人员建议，根据不同的应用场景，选择合适的突变检测思路和工具进行分析。
二、信号分析信号分析是指对比较小的生物序列（如RNA测序或蛋白质质谱分析等）进行分析，从中提取相关的信号特征。
这种技术可以用于研究转录组的表达、疾病的机制等方面。
相比较于DNA序列数据，RNA或蛋白质序列数据的特点是长度较短，高度变异。
对于信号数据的处理，目前常用的方法有以下几种：1.差异表达分析差异表达分析可以帮助我们比较不同样本之间的RNA或蛋白质表达水平是否有显著差异。
这种方法的基本流程是对数据进行预处理，如对序列进行去除低质量序列、去除适配体等质量控制步骤，然后利用一些统计学方法（如DESeq2、edgeR）计算不同表达水平的基因或蛋白质。
SNP检测方法
基于SNPs 研究的单倍型图谱计划
寻找标记SNPs 的国际遗传变异图谱计划，即国际 单倍型图谱计划(Haplotype Map Project)已于2002 年10 月正式启动，2003 年中国承担了“国际单倍 型图谱计划”10% 的任务。 HapMap 计划的目标在于，确定人类基因组中普通 模式的DNA 序列变异，通过测定序列变异特征、变 异频率、它们之间的关联，绘出人类基因组的单倍 型块，以及不同单倍型块的标记SNPs 。
SNP检测技术
理想的检测SNPs的方法
——发现未知的SNPs，或检测已知的SNPs
必须具备以下优点: (1) 适合自动化操作,简便、迅速; (2) 分析费用低,特殊试剂用量少; (3) 反应要严紧,即使不纯的样品也可得到可靠的结果; (4) 数据分析简单,易于自动化分析; (5) 反应的通量要大而灵活,一天可以完成几百，甚至到上百万个样品的 检测与分析。
SNP应用前景
1、人类学研究中的应用：人类进化、不同人群、 民族之间的关系、人类的起源、人类的迁移等（例 如Y染色体SNP分型）。 2、遗传病的诊断和疾病的关联分析。 3、疾病相关基因的定位和克隆。 4、法医学中的个体识别和亲权鉴定。 5、个体化疾病预防，真正进入预防医学时代。 6、药物基因组学的应用：新药设计与发明，个体 化疾病治疗与用药。
单核苷酸多态性 （SNP）
林壹明 2011/5/9
主要内容
一、SNP概念、分类与特点 二、SNP检测技术 三、SNP研究现状 四、SNP应用前景
SNP概念
SNP(single nucleotide polymophism) 即单核苷酸 多态性，是指群体中变异频率大于1 %的单个核苷酸 改变而导致的核酸序列多态性，包括转换、颠换、缺 失和插入。但是比较常见的是转换和颠换，大约占 80%。 一般来说，一个 SNP 位点只有两种等位基因，因此 又叫双等位基因。SNP在人基因组中的发生频率比较 高，大约平均每1000个碱基中就有一个多态位点。
SNP检测详细步骤
SNP检测(中文)Part I：样本基因组DNA的提取1.取50 μl血样于离心管中，加PBS缓冲液至1.5mL，轻轻地摇匀。
冷冻离心机6500 rpm离心10 min，去掉上清液，保留沉淀物。
重复洗2次。
2.向保留沉淀物的离心管中加入DNA提取液500 μl，15 μl的蛋白酶K，混匀放入55℃水浴锅中消化过夜。
3.将消化过夜的反应液冷却至室温，加入等体积冰冷的饱和酚溶液，盖紧离心管盖，缓慢地来回颠倒10 min（在冰上进行），形成均匀的乳浊液。
4.冷冻离心机12000 rpm离心10min。
5.小心地吸取上层水相至新管，用等体积饱和酚再抽提一次。
6.用等体积的氯仿再抽提一次。
7.离心后再取上清液于另一离心管中，加入1∕10体积3mol/L的NaAc使终浓度达到0.3mol/L，并加2倍体积冷无水乙醇，上下倒置混匀，置-20℃冰箱沉淀30-60min。
8.冷冻离心机12000 rpm离心10 min，弃上清液。
9.加入500 μl 70%冷乙醇小心洗涤沉淀。
冷冻离心机6500 rpm离心5 min，弃上清，用干净的吸水纸或用吸头将管壁残留的乙醇去除，干燥10～15 min，不要等沉淀完全干燥，否则难以溶解。
10.沉淀于100 μl超纯水中。
11.将提取的基因组DNA进行琼脂糖凝胶电泳及浓度的测定。
Part II：SNP分型检测1.引物的设计与合成(1)查阅文献，参考文献中的引物，直接合成；(2)根据SNP的位置找到其序列，设计引物并合成2.PCR扩增片段(1)PCR扩增体系：Components Volume (μl)DNA template1PrimeSTAR0.5dNTPs (2.5 mM)1Primer-F (10 μM)1Primer-R (10 μM)15*PS buffer(Mg2+)10ddH2O1(2)PCR扩增程序：(3)将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳检测。
(4)A. 测序法：对目的条带进行切胶回收纯化测序，根据测序结果统计分析各个样本下该SNP的基因型。
SNP开发验证的研究方法和技术路线
SNP开发/验证的研究方法和技术路线1分子标记:分子标记，我想这部分是我们分子标记组最核心的任务。
现在，我们没有任何可用的标记检测我们的定位材料。
即使想要验证已经定位的QTLs,我们也需要相对应的区间内的分子标记，尤其是SNP标记。
1.1 全基因组SNP—Affymetrix芯片：一套完整的全基因组的SNP芯片，相对于Douglas体系，其操作简单,高通量。
可以直接对定位群体进行初定位的扫描或是对育种材料的背景进行分析。
在国家玉米改良中心，有一套3k 的Illumina芯片，就是用来对玉米材料进行高通量检测，基因型检测结果通常可以用来QTLs 初定位，育种材料的群体划分与纯度鉴定以及低密度的关联分析等。
在此，我建议我们应该开发一套番茄基因型检测的芯片。
目前，只是查找到Illumina芯片有一套全基因SNP信息，包含7，720条探针.而Affymetrix 公司目前并没有相应的产品.但是通过跟Affymetrix公司了解，可以利用Illumina芯片已有的结果进行开发。
番茄目前测序结果显示其全基因组大小为~760Mb，而玉米为～2，500Mb，但是他们包括的基因数目~30，000个，整体情况相近。
另外，番茄作为自交植物，其LD的衰减值应该更大，有效的历史重组会更少，遗传多样性低.因此,综合考虑，我建议我们可以开发～3k芯片,应该可以满足大多数研究材料、育种材料的基因型检测需求。
虽然目前下一代测序技术蓬勃发展，但是对于用于基因型检测来讲，其数据分析与成本相对于芯片都要更复杂和更高。
总之，我们番茄处于刚刚发展阶段，我认为就基因型检测方面,芯片有其很高的应用价值。
即使像玉米，这样测序技术发展很多年的材料，芯片技术也在应用。
1.2全基因组SNP—Douglas:当用Affymetrix芯片检测鉴定完番茄基因型并完成基因型分析之后，1）对于优良的QTLs 或是基因,我们可以直接选择覆盖整个区间的分子标记运行Douglas系统进行分子标记辅助育种，2）对于需要进一步验证的QTLs，我们也可以利用Douglas系统只检测材料覆盖定位区间的基因型,而不需要再一次利用Affymetrix芯片或是其他方法进行全基因检测（图1.1）。
SNP对疾病检测的进展
SNP与疾病的关联研究摘要：SNP作为一门新兴技术，一般而言,SNP 是指变异频率大于1 %的单核苷酸变异。
在人类基因组中大概每1000 个碱基就有一个SNP ,人类基因组上的SNP 总量大概是300万个。
SNP成为第三代遗传标志,人体许多表型差异、对药物或疾病的易感性等等都可能与SNP有关。
大量存在的SNP位点，使人们有机会发现与各种疾病，包括肿瘤相关的基因组突变；从实验操作来看，通过SNP发现疾病相关基因突变要比通过家系来得容易；有些SNP并不直接导致疾病基因的表达，但由于它与某些疾病基因相邻，而成为重要的标记。
SNP将提供一个强有力的工具，用于高危群体的发现、疾病相关基因的鉴定、药物的设计和测试以及生物学的基础研究等。
SNP研究是人类基因组计划走向应用的重要步骤。
关键词：SNP 疾病脑出血冠心病正文：激肽释放酶基因多态性与人群脑出血的关联研究流行病学研究表明高血压患者尿液中激肽释放酶的活性与其血压水平呈负相关，提示KLK1基因可能在血压的调节中起到一定的作用；在人类疾病研究领域，有研究表明KLK1基因遗传变异与血管重构相关，同时发现了激肽释放酶基因启动子及编码区多态性与人类原发性高血压的发生有关。
KLK1基因位于染色体19q3.2-q13.4,全长包括5个外显子和4个内含子。
其编码蛋白KLK1是一种丝氨酸蛋白酶，广泛分布在心血管系统。
肾脏及中枢神经系统中，以旁分泌形式发挥其生物学作用。
在心血管系统中，组织型激肽释放酶被分泌到细胞外，并迅速转化为活性激肽释放酶，作用于其底物激肽原释放缓激肽，缓激肽与受体结合后可调节一系列具有生物活性介质的释放，如一氧化氮，前列腺素和血小板活化因子等，从而会发扩张血管，调节血流等多种生物学效应，参与平滑肌收缩，细胞增殖，血管重构等多种生理和病理生理过程。
通过手机273例散发性脑出血患者和140名正常对照着的外周血标本。
采用多重单碱基延伸SNP分型技术和DNA测序来检测KLK1基因rs5516及rs5517多态性位点在2组人群中的分布。
基因组学中的突变检测方法综述
基因组学中的突变检测方法综述引言：基因组学是研究基因组结构和功能的学科，突变是基因组中发生的任何改变，包括单个核苷酸改变、插入、缺失、倒位等。
随着高通量测序技术的发展，突变检测变得更加容易和准确。
本文将综述基因组学中常用的突变检测方法，包括SNP检测、结构变异检测、CNV检测以及突变的功能预测。
一、SNP检测方法：单核苷酸多态性（SNP）是基因组常见的变异形式，其在人类遗传疾病和个体间遗传差异中起着重要作用。
常用的SNP检测方法包括PCR-RFLP、TaqMan探针、KASP和SNP芯片等。
PCR-RFLP方法通过PCR扩增目标基因片段并使用限制性内切酶识别酶切位点是否发生改变来检测SNP。
TaqMan探针方法利用荧光探针结合靶标序列进行SNP检测。
KASP（Kompetitive Allele Specific PCR）是一种高通量的SNP分析方法，结合了多重PCR和高解析度熔解曲线分析。
SNP芯片则是一种高通量的平行检测技术，可以同时检测大规模的SNP。
二、结构变异检测方法：结构变异（SV）是指不同于单个核苷酸变异的大片段DNA片段的插入、缺失、倒位等。
常用的结构变异检测方法包括比较基因组杂交（CGH）阵列、分析转录本剪接和单分子测序。
CGH阵列利用比较基因组学的方法来检测基因组中的结构变异。
分析转录本剪接则通过检测mRNA的剪接形式来检测结构变异。
单分子测序是一种新兴的测序技术，可以直接读取长的DNA分子序列信息，对结构变异具有较高的敏感性和准确性。
三、CNV检测方法：拷贝数变异（CNV）是指基因组中一段较大的DNA片段的拷贝数发生变化。
常用的CNV检测方法包括CGH阵列、定量PCR、下一代测序和单分子测序等。
CGH阵列可以同时检测大量的CNV，而定量PCR方法通过在不同拷贝数下检测目标基因的拷贝数来检测CNV。
下一代测序和单分子测序可以通过深度测序来检测基因组中的CNV。
四、突变的功能预测方法：突变的功能预测是指通过计算方法和数据库筛选，预测突变对蛋白质结构和功能的影响。
SNP数据统计详细方法
SNP操作步骤与结果记录按照陈丽学位论文第二部——步骤一、使用在线软件SHEsis检验各个危险的hw遗传平衡（因rs2607659未发生突变，故不纳入分析。
）结论：9个位点P值均大于0.05，均符合HW遗传平衡。
（有附件）步骤二、分析前将协变量进行分类，并用KS法检验连续变量正态性，结果如下：正态性连续变量非正态连续变量分类变量ALT CR eGFR-AAST BMI HBeAg年龄 eGFR 年龄-A药物浓度 ADV合用性别步骤三、用KM生存曲线画出某一位点的CK升高时间与累积危险函数之间的曲线，（KM曲线中状态选项选择服药四年CK数据组）并联合Log-rank检验，比较该位点突变与否对CK 结局的差异。
结果：9个位点P值均大于0.05即：这些位点的变异对CK升高作用无差异。
为验证统计操作的正确性，将TK2基因rs3826160位点进行统计，得到的KM曲线与Log-rank P 值与陈丽师姐论文相同。
故统计操作正确。
（SPSS输出结果见附件）步骤四、对协变量进行单因素分析，排除rs位点突变与其他临床因素对CK产生相反作用，掩盖rs位点对CK结局影响的情况。
选择二元Logistic回归（除根据P值定性外，可提供OR值观察因素的影响程度）方法。
影响CK的临床因素(P<0.05)如下：协变量 P性别 0.000药物浓度 0.007年龄 0.032BMI 0.016HBVDNA-A 0.021CR 0.01eGFR 0.03（SPSS输出结果见附件）因HBVDNA数据只有91个，数据不足，使统计结果不佳。
同时有多篇文献得出HBVDNA与CK （CHB,LDT）升高无相关性。
故不纳入多因素分析。
步骤五、将有意义的单因素用COX回归模型纳入多因素分析，结果9个位点的P值均无意义。
为验证统计方法的正确性，将TK2基因rs3826160位点进行统计，得到性别和rs3826160多态性是CK升高的独立影响因素，其中分层分析中，男性患者出现CK升高的风险高于女性。
最新SNP检测技术
SNPs高通量的检测方法
另一大类检测方法是近些年来发展起来的, 高通 量、 自动化程度较高的检测 SNPs的方法,较为常用 的有:
1 . DNA测序法; 2 . DNA芯片检测; 3 . 飞行质谱仪 (MALDI- TOFMS )检测; 4 . 变性高效液相色谱 ( DH PLC )法等等
DNA测序法
优势
（1）质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量，不涉及荧 光标记、凝胶电泳等，就能检测一个碱基的差异，准确性高，机器本 身出错的概率非常低；
（2）质谱仪的灵敏度非常高，检测窗口内，任何pmol级别的物质都 能被检测出来；
（3）通量高：几秒就能检测完一个反应孔； （4）操作简单，仪器要求简单，除质谱仪外，都是常规PCR仪器； （5）灵活：每天可以完成几个反应至上万个反应； （6）便宜：引物不带荧光标记，普通长度（3条引物总长80bp左
在非变性聚丙烯酰胺凝胶上，短的单链 DNA 和RNA 分 子依其单碱基序列的不同而形成不同的构象，这样在凝胶上 的迁移速率不同，出现不同的条带，检测SNP。
特点：由于该方法简单快速，因而被广泛运用于未知基因突 变的检测。这种方法的弊端在于不能确定突变类型和具体 位置。
变性梯度凝胶电泳（DGGE）
原理：是利用长度相同的双链 DNA片段解链温 度不同的原理,通过梯度变性胶将 DNA片段分开 的电泳技术。
电泳开始时,DNA 在胶中的迁移速率仅与分 子大小有关, 而一旦DNA 泳动到某一点时, 即到 达该DNA 变性浓度位置时, 使得DNA 双链开始 分开,从而大大降低了迁移速率。当迁移阻力与电 场力平衡时, DNA 片段在凝胶中基本停止迁移。 由于不同的DNA 片段的碱基组成有差异, 使得其 变性条件产生差异, 从而在凝胶上形成不同的条 带。
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（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
1
2 3 4 5
简 特 经 直
便 异 济
准确
观
一般DNA实验室能满足实验 要求
Tagman探针技术（分子信标、分子灯塔） 实时荧光PCR技术 SYBR Green Ⅰ法（结合熔解曲线分析） 芯片分析（微阵列杂交实验技术）
特异性高；
引物设计简单； 反应条件易于优化；
分辨能力高。
随着科技的进步，SNP突变点检测方法在继续改进演 变。我们选择经济实用的技术方法来满足自己所做课题需 求。就目前来说，SNP检测技术手段还有待进一步提高。 科研在呼唤着一种最为理想的SNP检测方法，其能具 备以下优点: 1. 适合自动化操作, 简便快速;
基于PCR
荧光标记检测
相 关 技 术
寡核苷酸连接 分析
基于物理技术
内切酶酶切技 术
其它
单链构象多态性（SSCP） 变性梯度凝胶电泳（DGGE）
变性高效液相色谱分析技术（DHPLC）
(一)PCR-SSCP
1. 基本原理:
经PCR 扩增的目的片段在变性剂或低离子浓度下经 高温处理使之解链并保证在单链状态下,然后在一定浓度 的非变性聚丙稀酰胺凝胶中电泳。相同长度的单链DNA , 可以因其顺序或单个碱基差异,所形成的空间构象就会不 同,其在凝胶中泳动速度不一样,从而显示出带型的差异, 即多态型
20bp
优势
局 限 性
序列多态性座位中大约只有1/3的
碱基涉及限制酶识别序列；
遗传标记系统的个人识别能力有限； 限制酶消化条件较高。
微测序技术（SNaPshot）
焦测序技术（Pyrosequencing）
(Minisequencing) 微测序法是近年来出现的一种基于特异等位基因的高通
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
适当降低镁离子及引物浓度有助于改善扩增特异性 TagDNA聚合酶用量根据扩增目的基因片段的大小适当 调整。 提高退火温度可明显提高扩增特异性。但不适当地提高退 火温度可能会招致假阴性。
SNP突变点检测方法
21世纪是生命科学的时代，随着
“人类基因组计划”的完成，揭开了人类 遗传信息的秘密。人类已了解自己基因组 的全部核苷酸序列，在全面寻找功能基因 的同时，“人类基因组计划”的另一个重
要目标是阐明在特定基因组区域内的序列
差异。
第1代标记：RFLP 第2代标记：VNTR 、STR
第3代标记：SNP
量SNPs 检测技术。
基本原理
首先设计一个引物,其3’端结束在突变位点前一个碱基 。然后在反应体系中加入ddNTP。只有ddNTP 与模板DNA 被检测位点处的核苷三磷酸互补时,延伸反应才发生,但仅在 连接一个碱基后就停止，通过检测延伸碱基所发出的荧光 来判断SNP类型。
基本步骤
扩增、引物延伸和分析。
9 kb的人类遗传图谱，这对开展致病基因的定位和人类起源 与进化的研究非常重要。 目前SNPs分析的基本方法已达20余种,参考相关文献，大 致分为八大类，现就重点介绍与我们课题组相关的实验方法。
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）
以构象为基础
引物延伸法
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
（一）、基本原理
根据等位基因（DNA一级结构）碱基序列的差异，设 计序列特异性引物进行的PCR扩增。 如某一等位基因是A-T或G-C突变，我们可以针对相应 的突变设计寡核苷酸引物，使其3’端的第一个碱基与等 位基因的特异碱基互补，这样特异性的引物仅扩增与其相 应的等位基因，而不扩增其他的等位基因。扩增产物经凝 胶电泳检测，由是否有或无扩增产物的来确定相应的等位 基因。 目的等位基因是否得到有效扩增，可以通过测序来 确定。
2. 分析费用低, 特殊试剂少; 3. 反应要精密, 不纯的样品也可以可靠的分析; 4. 数据分析简单, 易于自动化; 5. 反应的通量 检测 结果分 析
DNA模 板制备
设计引 物
扩增反 应
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
（三）、注意事项
1.引物设计：有时引物的3’末端与模板DNA之发生
间错配，而扩增产物并非是目的基因片段，可以通过 设计双重特异引物来克服该问题； 2.模板浓度： DNA模板用量并不是越多越好，以 适量为原则； 3.PCR实验条件的优化：
第4代标记：CNV
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）
定义：
单核苷酸多态性是指基因组DNA中某一特定核苷酸位置发生
了转换,颠换,缺失和插入等变化而引起的序列多态性，而且任 何一种位基因在群体中的频率不小于1%。 SNP在人类基因组分布广泛。某些SNP直接影响蛋白的结构 表达及遗传稳定性等。对基因组SNP的分析是研究个体, 系谱,
序列特异性引物聚合酶链式反应
（polymerase chain reaction-sequence specific primer, PCR-SSP）
是由Olerup首先将其应用到HLA-DRB1基因分型，随后该技 术在基因分型实践中得到迅速发展和推广。目前我们课题 组的成员正实践着这一方法，初步结果令人满意。
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
由C-T突变
公共引物的 扩增产物
纯合子CC
联的 一合 扩 个分 增 基析 产 因， 物 型 。决 结 定果 由 物针 结对 果C 和的 针扩 对增 T 产
杂合子CT
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
RFLP定义：
由于碱基的变异可能导致酶切点的消失或新的切点出
现，从而引起不同个体在用同一限制酶切时，DNA片段长
度出现差异，这种因内切酶切点变化所导致的DNA片段长
度的差异，称限制性片段长度多态性（restriction fragment length polymporphism, RFLP）
适用于大样本筛选
DNA模板纯度要求不高，所需量少
缺 点
1
2 3 4 不能检测变异的位置 随DNA片段长度增加，检测的敏感性降低 会出现假阴性结果 对A=T检出率无C G好，有局限性
等位基因特异PCR（AS-PCR） 序列特异PCR（PCR-SSP）
单管双向等位基因专一性扩增（SB-ASA）
……
（polymerase chain reaction-sequence specific primer）
RFLP反映了常见的个体间DNA核苷酸的可遗传性变异
，它按照孟德尔方式遗传。
限制性内切酶Ⅱ识别DNA 序列上的的回文结构。
理论依据：RFLP分析和PCR技术联合应用
• PCR扩增目的基因片段
1
• 限制性内切酶酶切目的基因片段
2
• 电泳分离
3
野 生 型 纯 合 子
突 变 型 纯 合 子
杂 合 子
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保 持 在 单 链 状 态
非 变 性 凝 胶 电 泳
构 象 不 同 呈 现 多 态 性
DNA 单链构象同双链一样,也包括一级结构、二 级结构,其空间结构中最主要的是发夹结构。
发夹结构是决定DNA 单链构象多态性的分子基 础。
优 点
1
2 3 4
操作简单，步骤少，周期短 成本低
和人种特征以及遗传疾病治疗的重要线索。
单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism,SNP）
据估计,大约有105个SNP分子标记将被用于基因功能及与 疾病的相关性的关联研究。2001年, SNP协会( The SNP
Consortium)构建了含1. 42 ×106 个SNP、密度达1个SNP /1.
5’端为报告荧光基团 （reporter）
3’端为淬灭荧光基团 (quencher)
特 点：
1）该技术操作简单快速，特别适合少量位 点大量样本（几千个）的分型项目； 2）探针订购时间长（2－3个月）； 3）不适合少量样本（几十个）多位点分型, 特别是频率偏低的位点；
限制性片段长度多态性（RFLP） 随机扩增多态性DNA（RAPD） 引物入侵分析技术（Invader assay）