噬菌体展示载体的构建

噬菌体展示载体的构建

中国药科大学

JournalofChinaPharmaceuticalUniversity2002,33(6):529,532529 噬菌体展示载体的构建

吴国球,沈子龙.

(中国药科大学生物技术中心,南京210009)

摘要目的构建适宜噬菌体展示的载体系统.方法利用pCOMB3的LacZ强启动子,Pelb引导序列,包

膜蛋白?基因,用NHeI—XbaI双酶切,切除一个克隆位点;同时设计一对引物,用PET一28(a)作模板扩增550bp片

段,插入XhoI—SpcI位点之间,扩增质粒后用限制性内切酶,PCR,DNA测序等方法作鉴定.结果切除了272bp

NHeI—XbaI片段,插入片段后酶切鉴定显示:XhoI,SpcI单酶切,XbaI,NheI无酶切;所构质粒用Xhol+SpcI双酶切

及PCR扩增均可见550bp片段;测序结果正确.结论成功构建了一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的噬菌体

展示载体.

关键词噬菌体展示;构建;载体

中图分类号:Q78文献标识码:A文章编号:1000—5048(2002)06—0529—04 噬菌体展示文库在新药开发领域,尤其在全人

源化单克隆抗体方面为扩展生物多样性提供了强

大的研究工具[】].它能容纳超过上百万个单个分子

的克隆,因此又称全套基因库,可以通过受体与配

体,抗原与抗体相结合的特性,从中筛选出目的基

因克隆,使目的基因能在很短的时间内(数周)高效

克隆,筛选和表达[2].文库的大小是决定生物多样

性的关键.因此构建一种高拷贝,稳定,多用途,易于操作的载体具有十分重要的意义.

l材料和方法

1.1材料

pCOMBs质粒,XL1一blue菌株(东南大学基础医学院张建琼博士惠赠),PET一28(a)质粒,JM109菌株(本实验室保存),限制性内切酶NheI,XbaI,

SacI,SpeI,XhoI(Mm),T4连接酶,琼脂糖,EDTA, DNA回收试剂盒等(上海生

工),LB,SOC按常规方法配制,PCR仪(AmpGene4800),电泳仪(北京六一仪器厂).

引物:

P1:5'-GGGCCAACTCTAGTATGGCCC一3' 下划线为XhoI酶切位点

P2:5'-GG垒!垒!CTAACCAGCAC'ITCAGTGGGAA一3' 下划线为SpcI酶切位点Ck 连宝生物工程公司合成) 1.2方法

收稿日期2002—04—17通讯作者Tel:025—3271389 1.2.1pCOMB3的扩增含pCOMB3的XL1一blue 接种于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,37?过夜培养,挑单个菌落,接种l0ml的LB 液体增菌培养液,37~C6h,摇至ODeoo为0.36,按常规方法抽提质粒:按每毫升菌液l00lI液(50

mmol/LGlucose,25retool/LTris—HC1,l0retool/L EDTA),200l?液

(0.24mmol/LNaOHl00l, 5SDSl001),l50l?液(3mmol/LK.Ac,2.5 mmol/LHAc)混

匀,12000r/min5min,吸取上清

液,等体积酚:氯仿抽提一次,上清液加两倍体积的无水乙醇,4?放置

10min,12000r/min离心5min,

弃上清,沉淀挥干后,加无菌水20l,一20.C保存备用.

1.2.2片段切除及剩余片段的连接pCOMBsl0l, 加l0×buffer4l,去离子水

34l,NheI,XbaI各1.0 l,37?酶切2h,回收片段,20l水溶.取5l加l0× ligationll,去离子水3.5l,T4连接酶0.5l,16?连接过夜.

1.2.3感受态细胞制备及转化XL1一blue单菌落接种于100mlLB(含氨苄青100mg/L),37?摇至 OD600为0.4,8000r/min2min收集菌液,按每毫升菌液加

0.5mol/LCaCI2lOOgd,冰上放置30min,8000r/

min20min,弃上清,沉淀用相同浓度CaC1z悬浮菌液,lOOp1分装,加l0甘油,一70?保存.取连接液 5l,加入lOOpl感受态细胞,冰上放置30min,42?

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热激90s,加入预热SOClml,37?摇45min,涂布于四环素(50mg/L),氨苄青(100mg/L)双抗平板,同时设阴,阳性对照,37?过夜,随机挑选单菌落扩大培养,抽提质粒,分别用NheI,XbaI,SacI,SpeI,酶切检查,0.8琼脂糖l00v/50mA电泳

40rain,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa.

1.2.4插入片段的制备

1.2.4.1插入片段的扩增PET一28(a)质粒抽提后,取ll加

l0×buffer3l,P13~1(50pmo1),P2

3~1(50pmo1),Taq酶0.5l,dNTPll,加D2o至 30l,加一滴矿物油,94?变性5min 后执行94? 变性lmin,45?退火lmin,72?延伸lmin循环程序,25个循环后72?延伸10min,同时设阴,阳

性对照.PCR产物用1.2琼脂糖电泳检查,切下 550bp条带.每l00mg琼脂糖加400lBinding buffer,50?放置2min,转移至离心柱,8000r/min lmin,弃废液后加Washsolution450ml,8000r/

minlrain,弃废液,重复一次,12000r/min,开盖离心lmin,在柱中央加

20lD2O,12000r/min2rain,

一

20?保存.

1.2.4.2酶切取"1.2.3"酶切鉴定阳性质粒及

550bpPCR回收片段各l01分别加l0×buffer2 l,D207l,SpeIll,37?酶切

4h,65?20min

灭活;补加10×buffer2.3l,XhoIll37?继续酶

切4h,1.5琼脂糖电泳,按"1.2.4.1"方法回收相

应片段.

1.2.4.3连接及转化取回收片段各4l加T4

liga sell,l0×T4ligationll,16C连接过夜,全量

转化XL1一Blue感受态细胞,42?热激后涂布于氨苄,四环素双抗平板,37?过夜.挑单菌落接种于双抗LB,37.C6h,抽提质粒,1.5琼脂糖电泳检查. 1.2.5PCR及酶切位点检查取质粒ll,加引物

Pl,P2各3l,Taq酶0.5l,dNTPll,l0×buffer2l, 补加DzO至20l,l滴矿物油,按"1.2.4.1"PCR程序25个循环,1.2琼脂糖电泳观察结果.取PCR 阳性质粒5l,加入l0×bufferll,D2O3l,SpeIl

l,37?酶切4h,65?20min灭活;补加l0×buffer 1.1l,XhoIll37?继续酶切

4h,1.5琼脂糖电

泳,EB染色,观察结果.阳性质粒命名为Pa. 1.2.6载体测序测序引物为5一TTACTCGCTGCCCAACCAG一3',引物距XhoI位点

尚有20个碱基,采用ABIPRISM377DNA

2结果