紫甘薯花青素分析测定方法概述

紫甘薯花青素分析测定方法概述
李乾坤;韦璐阳;梁立娟;邓友展
【摘要】紫甘薯花青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、抑制肿瘤细胞生长等生理功能,因此,紫甘薯花青素的分析测定成了品种选育、原材料质量控制及产品评价的必要手段.文章阐述了紫甘薯花青素的性质、分析方法,重点对样品的前处理、仪器手段进行综述.
【期刊名称】《农业研究与应用》
【年(卷),期】2013(000)006
【总页数】5页(P47-51)
【关键词】紫甘薯;花青素;分析;测定
【作者】李乾坤;韦璐阳;梁立娟;邓友展
【作者单位】广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁 530001;广西壮族自治区亚热带作物研究所,南宁 530001
【正文语种】中文
花青素类物质包括花青素、花色苷、原花青素，是一类结构相似的化合物，三者在结构上存在显著的差异，但也存在一定的联系。

花青素（anthocyanidins）又称花色素，是构成自然界花草、果实颜色的一类水溶性天然色素，常见的有18种。

花色苷（anthocyanins）又称花青素苷，是一类以花青素为配基，与一个或多个
葡萄糖、半乳糖、鼠李糖、阿拉伯糖等分子通过糖苷键形成的化合物，即是以花色素为配基的糖苷类化合物。

而原花青素（proanthocyanidins）又称前花青素、原花色素，是自然界中广泛存在的聚多酚类物质，主要由儿茶素的单体、二聚体、三聚体等组合而成［1］。

是以花青素为单体的聚合体的统称。

紫甘薯富含花青素类色素，紫甘薯花青素的主要成分是矢车菊素和芍药素及少量的天竺葵素，以糖苷化后的酰基化衍生物形式存在［2-3］。

也就是说紫甘薯花青素主要为花色苷类型及少量的花青素单体。

研究表明，紫甘薯花青素具有抗氧化、抗突变、预防心脑血管疾病、抑制肿瘤细胞生长等生理功能［4-5］，具有广泛的应用前景。

测定紫甘薯及制品中的花青素成了品种选育、原材料质量控制及产品评价的必要手段。

文章对紫薯及制品中花青素的测定分析进行综述，为合理评价甘薯原料及产品提供参考。

1 紫甘薯花青素的理化性质
甘薯中的花青素属于类黄酮类化合物，具有很强的抗氧化活性，易溶于水、甲醇等，不溶于丙酮、乙酸乙酯、菜油、乙醚和石油醚等有机溶剂［6］。

紫甘薯花青素溶液颜色会随着pH值的变化而变化，酸性条件下呈稳定的红色，在可见光区530 nm处可出现特征吸收峰，随着pH值的升高，花色苷由红色的黄钅羊盐阳离子
向无色的醇型假碱变化［7］，高pH值时，花色苷向着深蓝色转变。

有研究表明
紫甘薯色素在pH3时热稳定性、光稳定性均较高，98℃条件下热降解的半衰期为4.6 h，光照条件下半衰期为6.5 d［8］。

常用食品添加剂及大多数金属离子对其
影响较小，Fe3+对色素具有破坏作用，Al3+和Zn2+对紫甘薯色素具有护色作用，NaCl可以提高紫甘薯色素溶液的吸光强度［9-11］。

总之，由于具有咖啡酸、阿魏酸或对羟基苯甲酸构成的酰基及配糖基，紫薯花色苷具有比一般花色苷较高的稳定性［5］。

2 样品处理方式
紫甘薯除了用于鲜食，还可加工成块、丁、粉等加工原料，还被开发成饮料或用于酿酒和醋，这些样品的差异，在进行花青素含量测定时，所要进行的前处理方式会有差异。

甘薯活体细胞中存在能够分解花青素的酶类物质，它们具有可溶于水、不耐酸、不耐加热、能够被高浓度乙醇钝化的特点［12］。

有研究指出这些酶类会造成花色
苷降解及脱酰作用而分解，其中多酚氧化酶和β-葡萄糖苷酶是最主要的酶［13］。

研究者在用紫薯研制开发成饮料时还发现采用pH3.0的柠檬酸酸化无法抑制β-葡萄糖苷酶的活性，导致饮料中酰化花色苷的含量减少，乳酸对于β-葡萄糖苷酶的
抑制效果要好些，不过产品风味不如加柠檬酸的效果［14］。

基于这些活性物质
的存在，在对新鲜样品进行处理时，提取过程中应先钝化这些酶（如煮沸处理、酸化或乙醇处理），还要避免花青素与鲜薯汁混合。

已发表的研究方法中，大多使
用酸化溶液（有时加一定比列的乙醇或甲醇）进行提取［15-25］。

不同的提取
方法会影响紫甘薯花青素的提取效率及稳定性，进而影响含量的测定。

刘桂玲［17］在试验中发现1%盐酸溶液作提取液比柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液更有利于
保持紫甘薯花青素的稳定性，同时发现经过高温烘烤后的甘薯干粉花青素的含量比鲜薯降低了16.30%～33.86%不等，说明紫甘薯花青素经高温处理可引起一定程
度的降解。

陈香颖等［18］的研究结果也验证了这一点。

他们将样品分别于30、40、50、60、40→60（即先在40℃下烘10 h后转60℃）、70、80℃下烘干（不同温度下的烘干时间不同，约48 h）成干粉后进行含量测定。

与鲜样比较，
试验的8个紫甘薯品种中，除万紫56和1028-18外，其余6份材料在烘干温度
为30℃时测得花青素含量最高，与鲜样相当。

而万紫56和1028-18测得最高含量为60℃、70℃烘干的干粉。

在40℃～60℃烘干温度时，干粉的花青素含量降低，且供试紫色甘薯干粉花青素含量品种间的差异变小，材料之间难以进行比较和鉴别。

而在烘干温度为60℃之后花青素含量测定值出现了回升的趋势，于60℃～
80℃烘干时含量维持在一个较高的稳定水平。

因此，鲜样测定值更适于紫色甘薯品种间进行比较鉴别，如受条件所制，可于60℃～80℃烘干后再进行比较。

紫薯干样中花青素的提取方式与鲜样类似，大多使用乙醇酸化溶剂提取。

但溶剂提取具有提取不完全且耗时长的缺点，因此相继有学者在酸醇溶剂提取的基础上，附加采用微波、超声波、冻结-溶解细胞破壁法甚至溶剂加速萃取法（ASE）等使得紫甘薯色素的提取效率提高，具有很好的应用前景［24-28］。

液体样品的处理相对简单些，直接以酸化醇溶液稀释即可。

样品在进行仪器分析之前，会根据仪器要求或实验目的进行过滤，甚至纯化分离，目前业内大多使用AB-8大孔树脂进行纯化［29］。

3 仪器分析方法
紫甘薯花青素的检测方法主要有紫外-可见光谱法、液相色谱法及液相色谱-质谱联用法，分别给予论述。

3.1 紫外-可见光谱法
紫外-可见光谱法主要基于官能团对光的吸收，依据朗伯比尔定律进行定量，同时还可借助吸收光谱对化合物进行定性鉴别，具有操作简单、仪器设备低廉等优点。

紫甘薯花青素在酸性条件下呈现稳定的红色，随着pH的变化结构在无色假碱、半缩醛及查尔酮形式之间变化，因而呈现出不同的颜色变化。

根据不同pH条件下花青素结构不同，可见光谱发生变化来测定花青素色素含量，即为pH示差法。

目前测定紫甘薯花青素的研究方式大多为该法［13,15-18］，利用花青素的光吸收特性和多羟基特性，定量分析方法主要以经验系数法测定花青素相对量或以单一化合物定量分析花青素总量。

花青素物质是多羟基的酚类物质，在弱酸条件下与亚硫酸盐反应后，亚硫酸根离子在花青素核的C-4位与花青素核生成无色化合物后［30］，花青素核在可见光区的特征吸收消失，而紫外区的吸收基本不变，利用该特性，可以用亚硫酸盐漂白法
进行花青素含量的测定。

涂宗财等［21］以苋菜红作为标准品，利用亚硫酸盐的
漂白作用，在527 nm下对花色苷进行了分析，同时考察了pH、亚硫酸盐用量对测定结果的影响。

毛建霏等［25］也根据该原理，以矢车菊素为对照品，使用柠
檬酸水溶液超声提取样品，结合亚硫酸钠漂白，采用可见分光光度法建立了一种紫薯总花青素含量的定量检测方法。

该法方便准确，且成本较低，但因紫甘薯中花青素糖苷化、酰化和辅色剂、金属离子等的影响未明。

同时亚硫酸钠漂白选择性不好，测得结果可能会比实际偏高。

3.2 液相色谱法
高效液相色谱法（HPLC）具有高分离度及高灵敏度的特点，该法在紫甘薯花青素分析方面的运用主要在于分离和成分分析，同时用于比较不同甘薯品种中花青素的含量和组成。

国内较早有陆国权［31］采用高效液相色谱法分析了玫瑰薯和徐薯
18杂交后代中筛选出的紫心品系鲜薯中花青素的组分。

鉴定出该品种甘薯含有12个花色苷组分，其中含量较大的4个组分占总花青素含量的80%以上。

刘超等［20］以矢车菊素为对照品，C18柱分离梯度洗脱，液相色谱法分析了紫甘薯中
的10种花青素并以归一化法进行了定量分析。

由于紫甘薯色素成苷方式和酰基化的多样性，目前报道的紫甘薯花色苷已超过20种，要想获得构成组分的准确含量，必须使用这二十多种化合物作为对照，在实际检测工作不太现实。

毛建霏等［24］利用盐酸超声快速提取紫甘薯中花青素并直接将多种紫甘薯花色苷直接水解为少数花青素单体，仅用矢车菊素和芍药素2种花青素对照品就可以方便准确的对花青
素含量进行定量分析，从而降低检测成本，简化了检测步骤。

3.3 液相色谱-质谱联用法
液相色谱-质谱联用法（HPLC-MS/MS）将高效液相色谱的高效分离和质谱的高
灵敏度，尤其是获取质谱信息进行定性的功能结合起来，是分析活性组分结构的重要手段。

HPLC-MS/MS在紫甘薯花青素分析上的应用主要用于品种间内含花色苷
种类的比较确定。

Truong V D［2］用酸化甲醇作提取液，经戴安ASE 200加速
溶剂萃取仪提取了3个紫薯品种原料和经蒸煮后原材料的冻干粉内的花色苷。

经
液相色谱-紫外/质谱联用法（HPLC-DAD/ESI-MS/MS）分离确定了Stokes Purple和NC 415有17个花色苷组分，并确定了含量较大的前5种花色苷为：cyanidin 3-caffeoylsophoroside-5-glucoside矢车菊素3-咖啡酰槐糖苷-5-葡
糖苷，peonidin 3-caffeoylsophoroside-5-glucoside芍药素3-咖啡酰槐糖苷-
5-葡糖苷，cyanidin 3-caffeoyl-p-hydroxybenzoylsophoroside-5-glucoside
矢车菊素3-咖啡酰-对-羟基苯甲酰槐糖苷-5-葡糖苷，peonidin 3-caffeoyl-p-hydroxybenzoyl-sophoroside-5-glucoside芍药素3-咖啡酰-对-羟基苯甲酰槐
糖苷-5葡糖苷，and peonidin-caffeoyl-feruloylsophoroside-5-glucoside芍
药素3-咖啡酰-阿魏酰槐糖苷-5-葡糖苷；Okinawa品种有12个花色苷成分，含
量较大的3个为：cyanidin 3-caffeoylsophoroside-5-glucoside矢车菊素3-咖啡酰槐糖苷-5-葡糖苷， cyanidin 3-（6''， 6'''-dicaffeoylsophoroside）-5-glucoside矢车菊素-3-（6''，6'''-双咖啡酰槐糖苷） -5-葡糖苷 and cyanidin 3-（6''-caffeoyl-6'''-feruloylsophoroside） -5-glucoside矢车菊素3-（6''-咖啡
酰-6'''-阿魏酰槐糖苷）-5-葡糖苷；同时知道蒸煮对花青素的含量及组成影响不大。

国内高玥［2］、江连洲［23］等学者也进行了类似的工作。

江连洲采用HPLC-MS法鉴定了中国5个主要紫甘薯种植品种中花色苷的含量及组成，结果从5种紫甘薯中鉴定出10种花色苷，主要为矢车菊素和芍药素的糖苷，说明国内紫甘薯花青素也主要由矢车菊素和芍药素组成。

4 结语
由以上论述可见，样品提取时，要考虑钝化或避开能分解花色苷的多酚氧化酶和
β-葡萄糖苷酶等活性酶，使用一定比例的酸化乙醇（或甲醇）溶液，更有利于紫
甘薯花青素的稳定，提取也更完全，同时辅助于超声波、微波甚至溶剂加速萃取
（ASE）等新手段，可以加速提取的完成，提高分析效率。

比较已发表的仪器分析方法可见，不同的花青素分析方法应用于不同用途。

紫外-可见光谱法一般用于花青素总量或相对含量的测试，可以使用经验常数或某一花青素单体作为对照品进行定量，仪器成本相对低廉，具有快速、简便的特点，能快速地对品种及产品的质量进行评价，同时对操作者的要求不算高，容易掌控，在基层等条件较差的地方具有无可替代的优势。

液相色谱法一般用于组分的分离，定性定量抗干扰的能力更强，具有较高的灵敏度，但一般需要一定纯度的对照品。

质谱法则常用于成分研究以及结构鉴定，尤其是活性结构的相关性研究，所耗成本相对较高。

Yoshinoto M等［32］用鼠伤寒沙门氏菌TA98对4种不同颜色甘薯根的水提物进行了抗突变的试验，发现矢车菊素-3-（6，6-咖啡酰阿魏酰槐糖苷） -5-葡萄糖苷（YGM-3）和芍药素-3-（6，6-咖啡酰阿魏酰槐糖苷） -5-葡萄糖苷（YGM-6）对由杂环胺、3-氨基-1，4-二甲基-5氢-吡哆-（4，3-b）吲哚、3-氨基-1-甲基-5氢-吡哆-（4，3-b）吲哚和 2-氨基-3-甲基咪唑（4，5-f）喹啉等引起的突变有很好的抑制作用，YGM-3抗突变作用大于YGM-6。

说明了酰基化的花色苷比脱酰基花色苷具有更强烈的抗突变作用。

HPLC-MS/MS在特定结构花色苷的筛选方面具有极大优势，目前，人们对紫薯花色苷的研究和开发还未完善，许多方面还了解不多，如：紫薯花色苷的生物合成途径及其调控机制，加工过程中的褪色机制、结构和效用关系，人体吸收紫薯花色素苷的相关机制以及花色苷的转化产物对人体所起的作用等研究都尚不明确［5］。

关于这些方面的研究都有待加强，这将需要HPLC-MS/MS等先进的分析手段。

可以预见，随着研究领域的不断深入，未来HPLC-MS/MS的应用范围将更加广泛。

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