动物细胞工程

动物细胞的体外生长特点：
1、动物细胞的特点
（1）动物细胞比微生物细胞大，无细胞壁，对机械搅拌或剪切力敏感。

（2）动物细胞生长缓慢，易受污染。

（3）动物细胞分化的程度和类别比植物细胞更高更复杂，脱分化非常困难。

（4）正常细胞培养的世代数有限，只有癌细胞和发生转化的细胞才能无限生长下去。

（5）动物细胞间主要以聚集体形式存在，大多需要贴附在载体表面才能生长。

体外培养的动物细胞的生长特点：
1.、贴附
2、接触性抑制
3、密度抑制
血清的生物功能
1. 提供基本营养物质
2. 提供激素和各种生长因子
3. 提供结合蛋白
4.对培养中的细胞起到某些保护作用：提供促接触和伸展因子使细胞贴壁免受机械损伤。

动物细胞培养可以分为贴壁培养、固定化培养、悬浮培养三大类
贴壁生长过程：
游离期：接种的细胞在培养液中呈悬浮态。

吸附期：不同类型的细胞的贴壁时间有所差异，多数细胞都可在24小时内贴壁。

繁殖期：悬浮细胞贴壁后经过一段停滞后开始分裂。

随着细胞数量的增多，细胞间开始接触并连接成片。

出现接触性抑制。

退化期：细胞长满培养瓶壁，随着营养物的消耗和代谢物的积累，密度抑制现象出现，细胞开始退化。

组织工程：是利用生命科学、医学、工程学原理与技术，单独或组合地利用细胞、生物材料、细胞因子实现组织修复或再生的一门技术。

组织工程三要素：
1. 种子细胞
2. 支架材料
3. 生长因子
按分化功能：干细胞可分为单能干细胞、多能干细胞与全能干细胞。

胚胎干细胞定义
胚胎干细胞简称ES，是一种全能干细胞，它是从着床前胚胎内细胞团或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞系，可以分化成任何一种组织类型的细胞。

成体干细胞定义
成体干细胞是指来自成体的具有分裂和分化潜能的细胞
单克隆抗体技术的核心是用骨髓瘤细胞与经特定抗原免疫刺激的B淋巴细胞融合得到杂交
瘤细胞，杂交瘤细胞既能象骨髓瘤细胞那样在体外无限增殖，又具有B淋巴细胞产生特异性抗体的能力。

因此，单克隆抗体技术又称为杂交瘤技术。

胚胎工程的定义
胚胎工程：以体外受精和体外早期胚胎发育为基础，在胚胎发育过程中进行的卵子切割、性别控制、嵌合体制作、细胞核移植、转基因操作等定向控制、改造和创造新遗传性状的技术统称为胚胎工程。

体外受精是指哺乳动物的精子和卵子在体外人工控制的环境中完成受精过程的技术
体外受精技术主要包括以下几个主要方面：精子的采集与获能、卵子的回收及成熟培养、体外受精、受精卵的体外发育及试管胚胎的移植等
克服阻滞现象主要采用以下两个方法：
一、是改进培养液成分，改善培养条件，尽量满足早期胚胎发育所需物质，确定并减除对其发育不利的成分；
二、是利用体细胞共同培养体系，以提供发育所需的物质条件，目前广泛采用的有输卵管上皮细胞共培养体和颗粒细胞单层共培养体系。

胚胎移植（embryo transfer ET）也称受精卵移植，是指将良种母畜配种后，从其生殖道（输卵管或子宫角）取出受精卵或早期胚胎，移植到同种生理状态相同的母畜体内，使之继续发育成为新个体技术
胚胎分割（embryo splitting）即是将一枚胚胎用显微手术的方法分割成二分、四分甚至八分胚，经体内或体外培养，然后移植入受体中，以得到同卵双生或同卵多生后代的技术，也是胚胎克隆的一种方法。

胚胎分割原理：根据卵裂球具有发育成为一个个体的全能性的特点
胚胎分割的方法：
（1）显微针分割法
（2）显微刀分割法
（3）酶软化透明带后显微分割法
（4）酶消化去透明带后分割法
（5）徒手分割法
非冷冻保存主要有三种方法，即异种动物体内保存法、卵和胚胎的37℃保存法和冷藏保存法
动物胚胎的一般保存程序：
动物胚胎的一般保存程序是将胚胎吸入含M2液的安瓿瓶中，冷却到0℃，逐渐加入冷冻保护剂，封闭安瓿。

然后，把封闭好的安瓿从0℃冰室，转移到－5-－6℃的恒冷室中，用预先在液氮凹面冷却的眼科镊子尖部，接触安瓿，玻璃上一出现霜，就立即移开镊子，完成植冰过程，之后，慢速冷至－40℃或－70℃，再直接投入液氮中保存
核移植是指将胚胎细胞或体细胞的细胞核用显微外科手术的方法移入去核的卵母细胞中，构建成重组胚,通过体内或体外培养、胚胎移植，产生与供体细胞基因型相同的后代的技术过程，又称为动物克隆技术。

根据核供体的来源不同,可将其分为：胚胎细胞克隆技术和体细胞克隆技术
动物细胞体外培养的一般过程：
1．核受体细胞的准备
卵母细胞的来源有两种方式：一是用激素对雌体进行超排处理，从输卵管冲出体内成熟的MⅡ卵母细胞。

二是从屠宰场收集卵巢，吸出滤泡中的卵丘—卵母细胞复合体(COCs)，在体外培养成熟后作为受体。

2．核供体细胞的准备
3．细胞核移植
常用的核移植方法有两种，即胞质内注射和透明带下注射
4．激活
5．重组胚的体内或体外培养
6．胚胎移植
克隆技术存在的问题
理论问题
●分化的体细胞克隆对遗传物质重编（细胞核内所有或大部分基因关闭，细胞重新恢
复全能性的过程）的机理还不清楚；受体细胞质与供体细胞核周期相容性的问题。

●克隆动物是否会记住供体细胞的年龄。

●克隆动物的连续后代是否会累积突变基因。

●在克隆过程中胞质线粒体所起的遗传作用等问题还没有解决。

实践问题
●克隆动物的成功率还很低
●生出的部分个体表现出生理或免疫缺限。

●即使是正常发育的“多莉”，也被发现有早衰迹象
转基因动物：是指用DNA重组技术，将人们所需要的目的基因导入动物的受精卵或早期胚胎内，使外源基因在体内表达，并且能稳定地遗传给后代的动物。

动物转基因的主要步骤
1.外源目的基因的制备
2.外源目的基因有效导入生殖细胞或胚胎干细胞
3.选择获得携有目的基因的细胞
4.选择合适的体外培养系统和宿主动物
5.转基因细胞胚胎发育及鉴定
6.筛选所得的转基因动物品系
导入外源基因获取转基因动物的主要途径有：
(1)原核微注射法；(2)胚胎干细胞介导法；(3)载体法，包括：①逆转录病毒载体；②脂质体
载体；③精子载体。

基因打靶（gene targeting）是指外源DNA与受体细胞染色体DNA上的同源序列之间发生重组，并整合在预定位点，改变细胞遗传特性的方法
基因打靶的原理：同源重组现象和胚胎干细胞技术
基因打靶的主要步骤：
①重组基因载体的构建
②导入受体细胞
③筛选
④检测
基因打靶载体：基因插入型载体和基因置换型载体。