木糖还原酶基因克隆及重组表达载体的构建

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第7 ( 期 总第 2 6 8 期)
21 0 2年 7月
农产品加工 ・ 学刊
Acd m cPr dcl f am Pou tPoes g a e i ei i r rd cs rcsi o aoF n
No7 .
J1 u.
文 章 编 号 :17 — 6 6 (0 2 7 0 1— 3 6 1 9 4 2 1)0 — 0 5 0
WA G Qa-ig MI ihn ,Q i l,F N i N i l ,’ NWe- og uJ -e A G L o n a
(oeeo odSineadE 6ne n ,Ji gi l rl nvr t,Wha adC r rcs n ao a E gneig C lg f o cec n n ef g inA r ut a U i sy l F i l c u ei et n o Poes gN tn nier n i il n L brt y h ncu ,Ji 3 1 8 hn) aoa r,C agh n in10 1 ,C i o l a
再 以木 糖 为 底 物 生产 木 糖 醇 。但 是化 学 氢 化 过 程 要 的报 道 ,该 菌株 的获 得 有 助 于 提 高 木糖 醇 的产 量 方 求金 属 催 化 剂 和极 端 的反 应 条 件 ,这 个 生 产 过 程 伴 面的研究 。张金 明等人[ 3 1 出热带假丝酵母菌株 , 筛选 有精 细复 杂 的相互 分 离 的程 序来 消 除 副产 物 ,因此 该 菌 在木 糖质 量 浓度 为 10gL下 木糖 醇 转化 率 达到 5 / 导致木 糖 醇 的产 率低 到 5%一 0 0 6%。 6. 8 %。但是一般来说天生就能够发酵木糖的菌株酵 5 与 化学 法 相 比 ,微 生 物 法 生 产木 糖 醇 有 以下 优 母 很 难 获 得 高 的 木糖 醇 产 量 , 因为 生 成 的 木糖 醇 的 点 :反应 条件 温 和 、易 于分 离纯 化 、成 本 低 、环 保 。 因此 ,越 来越 多 的研 究致 力 于微 生 物法 生 产木 糖 醇 。 目前 , 生 产 木 糖 醇 的 菌 株 主 要 有 假 丝 酵 母 属 (a dd . a dd ulem n i 、博伊 丁假 丝酵 C n ias ,C n ia ii o di p g lr ) 母 ( a d ab iii add o i l ) C n i odni d ,C n iat pc i 、近 平 滑 假 r as
一 憎 一 一
Schrn yecrvs eW 03 1 acaom cseeia 3 — ,得 到 的木 糖 i A中 限制 性 内 切酶 ,Fr na 公 司 提 供 ;抗 生 素 、 emets 还原 酶活分 别 为 08 /g ( 白) 和 08 / ( . Um 蛋 9 .3Umg 蛋 P R试 剂 盒 ,上海 生 物 工 程有 限公 司提 供 ;胶 回收 C 础 4 白) ,酶活 大约 为供体 菌 的 1 倍 。陈璐菲 等人 嘲 建 试 剂 盒 ,上 海 捷 瑞 生 物工 程有 限公 司提8 ;柱 式 质 . 5 构 供 表 达 木 糖 还 原 酶 基 因 的 重 组 酿 酒 酵 母 粒 D A抽 提试 剂 盒 ,北 京天 恩泽 基 因科 技 有 限公 司 N MT //IA — i cxl,该菌 株 的木 糖醇 转化 率达 提 供 ;所用试 剂 为分析 纯 。 81 C S Hs ty1 p — 9. 87 %。李 静 等人 l 建 的含 有 木 糖 还原 酶 的重 组 菌 1 方法 7 】 构 . 2 株 在 最 适 发 酵 条件 时 ,木糖 醇 转 化 率 为 3 . 75 %。麻 1 . 季也 蒙毕 赤酵母 基 因组 DNA的提 取 .1 2 慧 明等 人1 隆 了树 干毕 赤 酵母 木糖 还 原酶 基 因 ,并 8 1 克 采用玻 璃珠 法制 备 。 使 其 在 大肠 杆 菌 中表 达 ,这 些 研 究 都 为 木 糖 还 原 酶 12 .. 引物 设计及 目的基 因 P 2 CR 扩增 基 因T 程菌 的构 建奠定 了基础 。 根 据 N B 公 布 的 2个 Pci gii m n i的 CI iha ule odi lr 在 本 研 究 中 ,通 过 克 隆本 实 验 室 筛 选 的 高 产 木 木糖 还原 酶基 因 X L Y 1的序 列 ,比对保 守 区合 成下 列 糖 醇菌 株 Pc i ulem n i 中木糖 还原 酶基 因 ,成 引 物 : i ag ii o di h lr 功构建 了含有木糖还原酶基因的真核表达载体 ,以 弓l P f ’ C G A T C A G T G A T 物 — : 一 G A T C A T C C C A — 5
中 图分 类 号 :Q 1 82 文献 标 志 码 :A d i 0 9 9 i n1 7 — 6 6 X) 0 2 7 0 o:1 . 6 /s . 19 4 ( . 1. . 5 3 js 6 2 00
T e C o i g o ls d ca e Ge e a d h ln n f Xyo e Re u ts n n C n tu t n o e Re o i a t p e so co o s cVe tr
为通讯作者:闵伟红 ( 7一 ) 1 1 9 ,女 , 教授,博士,研究方 向: 粮油科学与深加工技术及发酵工程 。
E —ma l i:mi wh 0 0@1 3.o n 20 6 c m。
农产品加工 ・ 刊 学
21 02年第 7期
表达 T em ¥temo hl h r u h r p i s的木 糖还 原 酶 基 因 ,成 功 Pcig iim n i u i a ule odi 母表 达载 体 p IZOA,由吉 h lr ,酵 PC t 构建 重组 菌 。在无 氧 限制 的条 件 下 ,这 种 重 组 菌 株 林 农业 大学 小麦 和玉米深 加工 国家 工程 实验 室保藏 。 发酵 3 %木糖 ,得 到 的 乙醇 和木 糖 醇 的 产 率 分 别 是 11 培养基 和培 养条 件 .. 2 00 ,01 /。 近 年来 大 多 数研 究 是 把 树 干 毕赤 酵 . 4 .3g g 大肠 杆 菌 EclD 5 及 转 化 子 为 L . i H o B培 养 基 , 母 中的木 糖 还原 酶 基 因 ( Y 1 或木 糖糖 醇 脱 氢 酶 3 X L) 7℃ 静 止 和 振 荡 培 养 。p IZOA 为 Y D 培 养 基 , PC t P 基 因 (Y 2 转 入 酿酒 酵母 中进 行 表达 ,提 高木 糖 Pc i ulem n i为 麦 芽 汁 培 养 基 ,3 ℃静 止 或 X L) i ag ii o di h lr 0 醇 的产率 。陈叶 福i s ] 电转化 方法 将 含有 木糖 还 原 振 荡培养 。 运用 酶 基 因的 表 达 载 体 pX X L Y — Y 1转 入 酿 酒 酵 母 1 . 酶 、抗 生素及 试剂 .3 1
whih c n p o uc g il fxyi la s s r e d y o e m.Th e e fx l e r d ts s o e td wi e s c a r d ta hih ye d o lt nd i ce ne b ur ta o e g n o yos e uca e i c nn ce t y a t h
菌株 热 带 假 丝 酵母 ,该 菌 株 在 最 优 发 酵条 件下 木 糖 醇 的得 率 为 7 .1 09 %。曲佳 乐 【 1 】 得到 一株 高产 木糖 筛选 醇 的菌 株 ,经分 子生 物 学 鉴 定 与 季 也 蒙毕 赤酵 母 的 亲缘 关 系 达 9 %,确 定 该 菌 株 为 季也 蒙 毕 赤 酵 母 , 9 目前 国 内几 乎 没 有关 于季 也 蒙 毕 赤 酵母 生 产木 糖 醇
木糖还原酶基 因克隆及 重组表 达载体 的构建
Y s玲 , 闵伟 红 ,曲佳 乐,方 丽 _5
( 吉林农业 大学 食 品科学与工程学 院 ;小麦和玉米深加工 国家工程实验室 ,吉林 长春 10 ) 3 18 1
摘要 :木糖还原酶是木糖醇生物合成 的关键酶 ,催化 木糖合成木糖 醇。以实验室筛选并经分 子生物学鉴定为季也蒙
部分会被合成 细胞量 ,维持 内源新陈代谢 和还原 力。尽管木糖在酿酒酵母里能够在天然依靠 N D ( ) A P H 的醛 糖 还 原 酶 的作 用 下 被 转 化 成 木 糖 醇 ,但 是 木 糖 醇 生 成 的非 常慢 而且 仅 生 成 一 小 部 分 的木 糖 醇 。为 了提 高 木 糖 醇 的产 率 ,科 研 人 员 通 过基 因 重组 的方 丝 酵 母 ( add aasl i 和 汉 逊 德 巴利 酵 母 法 构 建 重 组 基 因 工程 菌 ,这 样 做 可 以有 效 地把 木 糖 Cn iap r is ) p os (eaym cshnei 『 D bro ye asni l ) _ 种 等 人 圆 选 出 一 株 转 化 成木 糖 醇 。War so 人 够 在酿 酒 酵母 中 。廖 筛 li sn等 fd 能
毕 赤 酵母 的木 糖还 原 酶 基 因 为基 础 ,以酵 母 表 达 载体 p IZ r PC OA成 功构 建 了含有 木 糖 还原 酶 的重 组 表 达 载体 .
p IZOA xl PC — y,为进一步研 究真核表达木糖还原酶和木糖醇的生产奠定基础 。 t 关键词 :木糖还原酶 ;克隆 ;表达 ;季也 蒙毕赤酵母
Ab ta t T e x ls e u ts e e o i h a g i ir n i i mp i e y t e P sr c : h yo e r d ca e g n fP c i u l e mo d i s a l d b h CR, T e P c i u l r n i i a s a n l i f h i ha g i e mo d i s t i l r
e p e so e trp I Z O A, w o s u tt e r c mb n n x r s in v co P C 【 x l t i c n i c e s h h n e o x r s in v co P C t e c n t c e o i a te p e so e tr p I Z 0 A— y , h s a n r a e t e c a c f r h h yo er d ca eo e — x r s in i t eh s t i ih a g i ir n i i uu e s y t ex ls e u ts v r e p e so h o e s an P c i u l e mo d i n t ef t r t d . n r l h u Ke I S yo er d ca e ln n ;e p e s n P c i u l e mo d i y WO ̄ :x ls e u ts ;c o i g x r si ; ih ag i ir n i o l
木 糖 醇 是 一 种 天 然存 在 的 五碳 糖 醇 ,它 以高 甜 度 、防龋 齿 的特性 和适 合 糖 尿病 人食 用 等 诸 多 优 势 而广 泛成 为食 品和饮 料等 领 域备 受 欢迎 的糖代 替 品 。 木糖 醇 的生 产 方 法有 化 学 法 和微 生 物法 ,一 般 工 业 上 普 遍 采 用 化 学 加 氢 法 还 原 半 纤 维 素 形 成 的木 糖 ,

收稿 日期 :2 1— 2 1 020 —7 基金项 目:长春市科技局应用技术研究计划项 目 (9 J2 。 o Y 3 ) 作者简介 :王巧玲 (9 5 18 一 ) ,女 ,黑龙江人 ,在读硕士 ,研究方 向:发酵工程。E m i ag i l g 10 6 .o - al nqa i 一 0 @13cm。 :w on
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