第9章 转基因表达

Gene silencing in transgenic plant Transcriptional gene silencing (TGS)
• TGS mediated by DNA methylation
•
TGS mediated by surrounding heterochromatin
Seeding of line
•
GFP expression on root tips in different transgenic barley lines
S e g re g a tio n o f g re e n flu o re s c e n t p ro te in o n ro o t tip fo r tra n s g e n ic b a rle y in T 1 and T 2 g e n e ra tio n
• 诱导重复DNA甲基化（repeat—induced DNA methylation），转基因作为串联重复 或反向串联重复插入基因组同一位点则倾 向于失活，因重复会导致甲基化，通常， 在一个位点内拷贝数愈高，失活愈严重。
• 外源基因的构型是指多拷贝的外源基因以正向或 反向串联的形式整合在植物基因组中。 • （1） 顺式失活（cis-inactivation），指紧密连锁 的多拷贝的转基因以正向或反向相互串联而使基 因失活。这种构型在DNA直接导入中常见，多以 甲基化的方式发生。 • （2）反式失活（trans-inactivation），指转基因 以顺式方式插入并发生失活，作为一个沉默子 （silencer）而引起不同DNA分子上同源的等位或 非等位的目标基因失活
Igri
5S
7L
5S
• Physical location of GFP on chromosomes
7L
Fluorescent in situ hybridization
Line E
5S 6 7L 5S 7L
6
Fluorescent in situ hybridization in line F
转录后水平的基因沉默
Baidu Nhomakorabea
•
这类沉默是RNA-RNA的关系，基因的启 动子（promoter）是活跃的，基因能转录， 但不能积累。因转基因和内源基因有很大 程度的同源性而抑制了内源基因的表达， 这一现象在植物中称共抑制 （cosuppression）。
•
1． RNA与阈值
• • 转基因产生大量的RNA而超过一个正常的标准或 阈值（threshold），将激活RNA依赖性的RNA聚 会酶以此转录物为模板合成配对的RNA，结果促 使同源RNA（不管其来源）的去除，而造成RNA 不能积累。这一现象通过对病毒抗性得到支持， 如转基因植株高表达转基因mRNA但不能积累， 但对同源RNA病毒的抗性提高，反之具较低水平 转录，对RNA 病毒侵染却是敏感的。
2．位置效应
• 外源基因整合到染色体的物理位置就直接 决定着外源基因的表达，这种情况称为位 置效应（position effect）有两种情况，（1） 外源基因插入染色体中高度甲基化的区域 或异染色质区，外源基因的甲基化而导致 基因沉默。 • （2）外源基因的碱基组成与整合区域的不 同而被受体细胞的防御系统所识别，不进 行转录使基因沉默。
第9章 转基因沉默机制
一、植物转基因的一些问题
• 1. 转基因的沉默, 技术和科学问题，涉及到 转基因的应用。 • 2．转基因植物对生态环境的影响和转基因 食品的安全性等问题。
• 外源基因与受体基因组整合，但该基因不表达或表 达水平降低，或者植物新获得的遗传特性随着植物 自身的繁殖在后代中又消失，这种现象转基因沉默 （transgene silencing）或转基因失活（transgene inactivation）。 • 对于育种来说，这无疑是不受欢迎的实质性障碍。 • 对于基因表达来说，转基因植株为研究目的基因的 表达调控提供了优良的材料。通过深入研究可加深 理解自然植物在DNA水平上调控基因的表达，或在 细胞质中通过mRNA水平来调控基因的表达。
L o c a tio n o f in s e rt o n ch ro m o so m e s (% )
No. of c h ro m o s o m e s w ith in s e rt s ig n a ls
A C D E
7L 7S 7S 7L 5S
60.28±3.5 35.96±3.38 74.73±4.24 39.01±3.42 89.55±9.5
2．甲基化
• PTG S情况下的甲基化，启动子仍活跃和正常转 录。常见转基因编码区的上、下游都被甲基化， 转录产物通常缩短了，即甲基化的部分转录受阻。 • RNA指导的DNA甲基化（RNA-directed DNA methylation），在转基因烟草中发现有3-4个顺序 排列的viroid cDNA被甲基化，这种甲基化不是转 基因的重复所产生，而是 viroid RNA的作用。由 于viroid cDNA和viroid RNA接触后使cDNA产生 了甲基化，这种DNA-RNA的相互作用可能有利于 DNA甲基化酶的作用。
3．异位配对和异常RNA
• 当病毒和转入的外源基因内部有同源序列，或者外源基因 与内源基因之间有同源序列时，往往会导致异位配对 （ectopic pairing），其结果是转录产生异常RNA （aberrant RNA，aRNA）。 • aRNA一旦产生并进入细胞质后，就会激活依赖于RNA的 RNA聚合酶的活性，该酶以aRNA为模板合成大量的2030bp的互补RNA（complementary RNA，cRNA），这些 cRNA与同源的mRNA相遇就配对形成部分双链结构— dsRNA，而后被双链特异性的Rnase识别降解。 • 内源基因的同源转录产物也可能被cRNA结合而被降解。 外源基因的导入最终导致内源和外源基因的表达共同受阻， 即共抑制。
三、转基因沉默的消除途径
1．转基因方法的改进
• 农杆菌介导的转化法常产生低拷贝或单拷 贝的整合方式，而DNA直接转化则产生多 拷贝的整合方式。 • 但农杆菌介导要比DNA直接介导受宿主或 受体基因型的限制大。通过基因枪法将仅 含基因表达盒（启动子、开放阅读框、终 止子）的线性DNA片段导入植物基因组。
C ode of plants A C D E F + 160 41 205 211
T1 46 6 123 21 16
2 value 0.78 (3:1) 3.62 (3:1) 3.57(15:1) 0.25 (15:1) segregation 5 (3:1, 2/3) 7 (3:1, 2/3) -
• Line E and line F are same transformed plants with GFP
• Preferential integration for insert located on middle and terminal region of chromosomes
3．DNA甲基化
4．反义RNA
• 外源基因的转录可能形成反义RNA， 反义RNA与靶mRNA互补形成双链而被降 解。使细胞内完整的mRNA含量降低，导致 内外源基因的沉默。
• TGS与PTGS其实两者并非完全独立，两者 可通过RNA-DNA互作保持联系。上述的 RNA指导的DNA甲基化就是他们之间联系 的例子，RNA特异性地与靶DNA配对，形 成RNA-DNA双螺旋，引起 RNA指导的 DNA甲基化的程度提高，从而发生转基因 沉默。
Green fluorescent protein (GFP)
> GFP sources from jellyfish Aequorea victoria
> GFP as a new vital reporter in plant for detection in living cell by light at 395 or 470 nm
Physical location of gfp insert on chromosomes in different transgenic barley plants by FISH
Code of p la n ts
In s e rte d c h ro m o s o m a l a rm s
• • •
PTGS mediated by DNA/RNA viruses
转录水平的基因沉默
1．DNA的拷贝数和其结构
• 转基因沉默与转基因的拷贝数和其构型有关。 DNA-DNA相互作用。 • 多拷贝的整合方式并未使基因表达水平有所增加， 反而使DNA发生甲基化或其他原因引起基因失活。 农杆菌介导的转化方法比DNA 直接转化法所产生 的拷贝数低。外源基因的拷贝数低也并一定能导 致基因的充分表达，所以转基因拷贝数的多少对 基因表达没有定论。倾向于多拷贝导致基因沉默。
> Small molecular (26.9 KD) and fusion at both N-and C- terminal provide protein localization and intercellular protein trafficking
Transgenic Barley, 2N=14
28 37 49 54 14 96 35
F
7L 5S
39.55±2.46
te rm in a l re g io n
Discussion
• Number of insert on chromosome results in brighter GFP expression • Gene silence happened in line D
二、转基因沉默的可能机制
• 转基因沉默并不是所转化的基因发生了丢 失或突变，而是整合进植物基因组的外源 基因在转化体的当代或其后代中出现了基 因失活或表达受到抑制的现象。
• • • • 转基因的拷贝数和构型 转基因在基因组中的整合位点 转基因的转录水平和翻译水平 环境因子对转基因表达的作用
• 转基因沉默主要分为两类， • 转录水平的基因沉默（transcriptional gene silencing，TGS），发生在核内 • 转录后水平的基因沉默 （Posttranscriptional gene silencing， PTGS） 发生在细胞质中 • 都是核酸的相互作用，即DNA-DNA， RNA-DNA，RNA-RNA。
• DNA甲基化是植物发育分化过程中调控基因 表达的手段之一，DNA甲基化也是植物细胞最常 用的防御外来遗传物质入侵的现象，它可以识别 与植物基因组DNA序列组成不同的外源基因并对 其甲基化，引起基因沉默。 • DNA 甲基化主要发生在基因的5‘端的启动子 区域，阻碍转录因子与启动子的结合，从而引起 转录抑制。DNA甲基化引起的外源基因沉默可以 被逆转，利用去甲基化试剂可以恢复外源基因的 表达。 •
C E
+
nc I pc
D
pc nc I
Amplified PCR with GFP primers for transgenic barley
•
GFP expression and inheritance on pollen in T1 and T2 generation
A1
A2
A3
D
F1
F2
C
E
T2 no-segregation 0 (1/3) 6 (1/3) 2 2 8 (3/15)
2 value 1.68 (2:1) 1.02 (2:1) 4.41 (4:8:3)
chrom osom es
1 1
2 2
5 (15:1,4/15) 8 (3:1, 8/15)
• Molecular analysis of T1 generation for gfp gene + A pc nc I
• TGS mediated by copy number of insert • TGS mediated by endogenous repetitive sequences

Posttranscriptional gene silencing (PTGS)
PTGS mediated by sense transgenes PTGS mediated by antisense transgenes