DH10Bac感受态细胞制备方法

DH10Bac感受态细胞制备方法

前言：DH10Bac感受态细胞本身含有卡那霉素和四环素抗性。在制作感受态细胞的时候，需要加入这两种抗生素，以防止DH10Bac中的质粒父本杆粒bMON14272（卡那霉素抗性）和辅助质粒pMON7124（四环素抗性）在细胞扩增过程中丢失，提高质粒转化后的基因转座效率。

实验步骤：

1. 在含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的LB平板或无抗平板上，使用DH10Bac菌液划线，37o C培养箱

过夜，培养12~20小时。

2. 从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养3-6小时，至OD600值为0.4左右。

或者从平板上挑取一个单菌落，接种到一个含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的5 ml LB液体培养基中，于37℃，250rpm培养12小时，然后再将菌液按照1:100的比列接种于含有50 ug /ml Kan+和10 ug/ml Tet+抗性的100 ml LB液体培养基中，于37o C，250rpm培养3小时，至OD600值为0.4左右。

3. 将DH10Bac细菌培养烧瓶在冰上孵育10 min，使培养物冷却至0℃，转入无菌的预先用冰预冷的50 ml离心管中，然后于4℃下5000 rpm离心8 分钟收集细胞。

4. 倒出培养液，尽量使上清弃尽。每50 ml初始培养物加入30 ml预先用冰预冷的0.1 M CaCl2溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置30分钟。

5. 于4℃，5000 rpm离心8 分钟收集细胞，弃尽上清。加入4 ml预先用冰遇冷的0.1 M CaCl2。轻轻吹打悬浮细胞，加入1 ml灭菌的预先用冰遇冷的80%甘油，吹打混匀。

6.将DH10Bac感受态细胞按照毎管100 ul分装。可以直接使用新鲜制备的DH10 BAc感受态细胞进行质粒转化，也可以放在-80 ℃冰箱保存备用。

备注：

1. DH10Bac感受态细胞制备的整个过程中应当严格无菌操作。

2. 提前配制包含工作浓度为50 ug /ml的卡那霉素和10 ug/ml的四环素的LB培养基100 ml，其中添加100 mg /ml

的卡那霉素50 ul，10 mg/ml的四环素100 ul。

3. 悬浮、分装细胞时，预先将枪头预冷，EP管事先标明清楚并置于4℃或-20℃冰箱预冷。

4. DH10Bac感受态细胞喜冷不喜热，严格执行冰上操作步骤，保证整个过程中感受态细胞的低温状态时获得高

效感受态细胞的关键。

5. 用于转座的pFastBac1等载体自身含有庆大霉素的抗性，并且转座是否成功可以通过蓝白斑进行筛选，因此在使用pFastbac1载体质粒进行DH10Bac感受态细胞转化时平板应该使用含有卡那霉素，四环素抗性和庆大霉素的三抗平板。同时，在平板中加入IPTG和X-gal以进行蓝白斑筛选，鉴定转座是否成功。

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