小鼠原始生殖细胞在生殖嵴的定位

( PG Cs) 在生殖嵴中的碱性磷酸酶 ( A P) 染色定位观察, 比较 其数量的增殖规 律。结果表明, 111 5 ~ 121 5 dpc ( 配后天数 ) 阶段 为采集 PG C s的
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Байду номын сангаас
关键词: 小鼠; 生殖嵴; 原始生殖细胞; 定位
中图分类号: S86511
文献标识码: B
文章 编号: 0529-5130( 2007) 04- 0052-02
弃去蔗糖 液, 将胚 胎 在滤 纸上 展开, 再用 冰 冻固 定液 包
收稿日期: 2006-08-14 基金项目: 国家自然科学基金 ( 30270958 ) 和 江苏省 自然科 学基 金 ( BK 2002108) 提供资助。 作者简介: 谢冰 ( 1979-) , 女, 硕士研究生。 * 通讯作者。
尽管胚胎的性别在受精时 就已在遗传上确定, 但是小鼠性 腺分化一般要 到 1310 dpc才 可开 始出 现。正 常情 况下, 只 有 细胞表面无 H-Y 抗原的 PG Cs, 才能 出现性 腺向卵 巢方向 的分 化。进入精巢 的 PG Cs都 成为 精原 细胞; 而 进 入卵 巢的 PGC s 则发育成卵原 细胞, 进 入卵 子发 生过 程。 XY 型 PG Cs若进 入 卵巢也能最终发育 成有功 能的卵 子, 而精 巢中 XX 型 PGCs虽 能进入精子发生过 程, 但一般 会在成 熟分裂 开始前 发生退化, 表明 Y 染色体上 存在精 子发 生所必 需的 基因 [4] 。生 殖嵴来 源 于间介中胚层, 靠 近中 肾, 在 大 约 1010 dpc时, 方可 见到 明 显的小鼠生殖嵴。在本试验中 , 1115 dpc小鼠胚胎已可见 典型 的生殖嵴形态, 1215 dpc生殖嵴尚无分化迹象, 到 1315 dpc则
该期鼠胚体 长 9~ 10 mm, 宽 61 5~ 715 mm。 肉眼 可见 鼠 胚皮肤红润 , 颜面 部发 育进 一步 完善, 尾部 增长 。在显 微 镜 下, 可见生殖腺 呈卵 圆形 , 其内 含血 管横 断面 的管 径明 显 增 大, 表现出性别分化特征。雄性的原始性索在此处形成一些 界 限清楚的睾丸小管, 为实心的小管内含许多圆形 深染的 PG Cs;
该期鼠胚体长 8~ 9 mm, 宽 6~ 7 mm。肉眼观察, 后肢 分 节并有足板形成, 颈部、面部也开始形成, 胚体开始伸直 。光 镜下生殖嵴前后端萎 缩, 中部膨 大成为 明显的 椭圆形 生殖腺, 边缘增厚, 内含圆形 深染 的 PGC s, 聚 集分布。 生殖嵴 表面 由 体腔上皮, 即细胞体积小、染色深、矮立方形细胞组成, 实 质 由细胞体积大、染色深的原始性索和细胞体积小、染色浅 、细 胞排列疏松的 间充 质细 胞组 成, 此 时仍 无明 显的 性别 分化 形 态。因此, 性腺为未分化性腺。此期的生殖腺增大变厚, 明 显 凸入腹腔。 21113 131 5 dpc鼠胚的生殖嵴 形态
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A n ima lH usbandry & V e terinary M edicine 2007 V ol1 39 N o14
小鼠原始生殖细胞在生殖嵴的定位
谢 冰, 芮 荣* , 卢 晓, 剧世强, 黄国庆, 杨 倩
(南京农业大学动物医学院, 江苏 南京 210095)
摘要: 试验以昆明小鼠胚胎为材料, 采 用普通 石蜡切 片和 冰冻切 片技术, 对 不同胚 龄小 鼠生殖 嵴进行 形态学 比较研 究。通 过对原 始生 殖细 胞
于普通光镜下观察各组切片, 拍摄、记录观察结果。
2 结果
21 1 小鼠不同胚龄生殖嵴的形态学特征 111 5, 1215和 1315 dpc鼠胚 的石蜡 切片, 经 H E染 色后,
其生殖嵴的形态比较如下。 21111 111 5 dpc鼠胚的生殖嵴 形态
该期鼠胚体长 5~ 7 mm, 宽 5~ 6 mm。肉眼观察, 前肢 芽 分成两节; 光镜下生殖嵴呈椭圆形实质性器官状, 位于腹侧 中 肾内侧。深染的圆形 PGC s密集分 布于生 殖嵴内, 生 殖嵴向 体 腔内凸出, 形成纵行隆起。它是由细胞体积小、染色深的体 腔 上皮内凹增生形成的上皮性生殖索, 并迁入深面细胞, 与体 积 小、染色浅、细胞排列疏松的间充质细胞共同构成原始性索。 21112 121 5 dpc鼠胚的生殖嵴 形态
[ 4 ] D en is H. A parallel betw een d evelopm ent and evolut ion: G erm cell recru itm en t by th e gonads [ J]. B io E ssays, 1994, 16: 933-938.
[ 5 ] T am PPL, Snow MHL. Pro liferat ion and m igration of p rimord ial germ cells during com pensatory grow th in m ou se emb ryos [ J] . J Em bryol Exp M orpho,l 1981, 64: 133-147.
PGCs的增殖情况如图 1所示。
a. 111 5 dpc; b. 1215 dpc; c. 1315 dpc
图 1 不同胎龄鼠胚生殖嵴冰 冻切片的 AP 染色 ( @ 40 )
从图 1可以看出, AP 染色后 PGCs呈深色。随着胚龄的增 长, 生殖嵴的形态发生改变, 生 殖嵴内 PGCs的密 集度也 呈现 增长的趋势。 1115 dpc 生殖 嵴呈长 条状 纵行 隆起, PGCs分 布 于 其内, 但 靠近腹侧面 PG Cs密度较背 侧面密集; 到 1215 dpc, 生殖嵴前后端萎缩, 中部膨大 成为明显的椭圆形生殖腺, 其内 PGC s分布与 1115 dpc生 殖嵴 内 PGCs分 布相 同, 但细 胞密 度 增加; 1315 dpc 生殖 嵴 明显 变短, 变粗, 呈 现 明显 的 性别 分 化。与 1115 dpc和 121 5 dpc生殖嵴内 PGCs相比, 131 5 dpc胚 龄生 殖嵴内 PGCs分布 较均匀, 但靠近背 侧面 PGCs多于 腹侧 面, PGC s分布密集。
胚胎于 Bouinps固定液中固定 24 h后进 行常规 石蜡包 埋与 切片, 切片厚度为 5 Lm, 行 HE 染色后, 以树胶封片。 11 3 小鼠胚胎冰冻切片的制作 11 311 固定
将采集的胚胎在滤纸上吸 去多余的水分和血渍后, 置于现 配制的 4% 多聚 甲醛 中, 于 4 e 过夜, 再转 入 25% 蔗 糖液 中 4 e 保存。 11 312 切片
畜牧与兽 医 2007年 第 39卷 第 4期
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支持细胞分化不明显, 但可见支持细胞 的细胞核位于管腔基底 部, 呈梭形。若是雌性, 其性腺分化比雄性稍晚 , 此期仍 不易 辨出典型的卵巢特征 结构。
21 2 不同胎龄生殖嵴中 PGCs的增殖 鼠胚的冰冻切片, 经 A P 染色后, 不同日 龄胚胎 生殖嵴 内
1 材料与方法
11 1 小鼠的超数排卵与胚胎采集 昆明小鼠购自南京青农 山实验 动物中 心, 许可证 号 SCXK
( 苏 ) 2002- 0018。小鼠按 常 规方 法 进 行超 数 排卵 [ 2] ; 选择 出 现阴栓者用 于胚 胎采集, 首次发 现阴 栓时记 为 01 5 dpc ( days post co itum, 配 后 天数 ), 见 栓 雌 鼠分 笼 饲 养, 分 别 于 111 5、 1215和 1315 dpc时 采 集小 鼠胚 胎。用 颈 椎脱 臼 法致 死 小鼠, 打开腹腔, 暴 露妊 娠子 宫, 剪 断子 宫颈 与宫 管结 合部 输卵 管 段, 分 离 子 宫; 细 心 打 开 子 宫 并 分 离 胚 胎, 置 于 无 Ca2+ 、 M g2+ 磷酸盐缓冲液 ( PBS) 中备用。 11 2 石蜡切片的制作
发现性别分化特征。一 般认为, PG Cs是通 过趋 化性向 生殖 嵴 迁移的, PGCs在迁移过 程中 及到达 生殖 嵴后 2 d内, 增殖 十 分活跃; 其数目可由 81 0 dpc的不 足 100 个增加到 1310 dpc 的 25 000个 [5] 。
利用 PGC s的 A P 活性, 通 过 AP 染色 追踪定 位 PGC s的 分 布, 是识别 PGC s的常 规 方法。 M o lyneaux 等 [6] 也采 用绿 色 荧 光蛋白 ( GFP ) 标记的方 法, 追踪 小鼠 PG Cs在体内 的迁移 过 程。结果发现, 815 dpc时大部分 PG Cs位于尿囊 蒂和原条尾端 的卵黄囊脏层, 即后肠 开口的边 缘并 与之结 合处; 91 5 dpc 时 少量的 PGC s位于卵黄囊和尿囊 底部, 大部分 细胞埋 藏于后 肠 中; 至 101 5~ 1215 dpc阶段, PGCs沿背肠系膜迁移至生殖嵴。 到达生殖嵴定居的 PGCs, 在性腺 分化 前与体 细胞 一样, 行 有 丝分裂增殖。这些研究结果与本试验结果基本一致。综合考 虑 小鼠 PGC s迁移至生殖嵴的数量 和性别分 化的时 间, 我们认 为 111 5~ 1215 dpc阶段为采集小鼠 PGC s的最佳时间。
原始生殖细 胞 ( PGC s) 的 发育与 迁移, 是 哺乳 动物 配子 发生和发育生物学 的基本 问题 之一。 PGC s的分离 培养, 是进 行胚胎生殖 ( EG ) 细 胞建系 的基础。 EG 细胞因 在形 态功能、 分子标志和 体内 外 发育 潜能 诸 方面 与 ES 细 胞具 有 相 似的 特 征, 并被证实具有种系传递能 力, 已被 看成是获得多能干细胞 的一条替代来源 [ 1] 。本 试验 以 小鼠 胚胎 为 材料, 对不 同胚 龄 的小鼠生殖嵴进行形 态学比较研究, 通 过对 PG Cs在生殖 嵴中 的碱性磷酸酶 ( A P) 染色定位观察, 比较其数量 的增殖规律, 以期为小鼠 EG 细胞的分离培养提供实验 参考。
参考文献:
[ 1 ] R u i R, Sh im H, M oyer AL, et a.l A ttem pts to enhance produ ct ion of porcine ch im eras from em bryon ic germ cells and preim p lan tat ion emb ryos [ J]. Theriogenology, 2004, 61: 1225-1235.
埋, 放入 - 20 e 冰 冻切 片机内; 待组织 完全 冰冻后, 用冰 冻 切片 机 切 片, 切 片 厚 度 为 20 Lm; 切 片 后 即 迅 速 贴 片, - 20 e 保存, 待染色。 11313 AP 染色
染色时, 将现配制的 A P 染色液细心 滴于切 片上, 以完 全 覆盖组织切片为准, 避光染色 20~ 30 m in。 11 4 试验观察
[ 2 ] 戴建军, 梁阳秋, 吴悦婷, 等. O PS 法与 细管法冷 冻小鼠胚 胎 的研究, 畜牧与兽医, 2006, 38: 29-30.
[ 3 ] Buehr M. Th e prim ordial germ cells of m amm als: som e cu rren t perspect ives [ J] . E xp C ell R es, 1997, 232: 194-207.
3 讨论
PGC s是各级生殖细胞 与雌 雄配子 共同 的祖细 胞, 其 体积 大、胞质中含有丰富的糖元颗粒、 PA S染色呈深粉红 色、且具 有 A P 活性, 易与 组织 中的 其他 细胞 相区 别。 PGCs在 生殖 嵴 的分布与定位, 关系 到 EG 细胞 分离 建系 的成 效。小 鼠 PGC s 的迁移过程可分 为两个 阶段: 第 1 阶段 (约 从 71 5 dpc至 910 dpc), PGC s从原条的后 端, 即 形成后 肠的 区域, 随 着后 肠的 内卷被带入胚胎内部 , 并到达 后肠内胚层, 此种迁移属被动卷 入; 第 2阶段 (约从 91 5 dpc至 1215 dpc), PG Cs离开后 肠内 胚层, 沿背肠系膜迁移, 最终 进入生 殖嵴。此期 的 PGC s有伪 足等特征结构, 以阿米巴运动 方式主动向生殖嵴迁移 [ 3] 。