高效转化及感受态细胞的制备

关于感受态细胞及转化

克隆/建库/表达专用超级高效感受态细胞

国外的同学说一般他们克隆都是直接购买感受态细胞转化，实验效率很高的。我总是以为如果是一般的克隆实验，自己做感受态好像够用了－－如果是建库，购买现成的感受态细胞就是非常必要的首选，因为转化效率确实比实际手工制备的高2－3个数量级以上，特别是建库，能实实在在地提高实验的效率。实际上，除了建库以外，Stratagene为更好的表达蛋白、以及转化效率较低的巨无霸质粒，而特别优化了一些感受态细胞，做表达的人其实可以参考一下，有点用处的。生物通在这里借用Merck公司提供的资料供大家参考。

Stratagene的XL10-Gold®几乎算得上是高效转化的代名词了，研究者一旦要克隆大质粒、连接DNA和建库，克隆甲基化DNA，进行蓝白斑筛选等，首选的就是XL10-Gold®和其衍生菌。

XL10-Gold®用途包括：

--克隆大DNA：包括表达质粒，基因组DNA克隆

--构建质粒文库：减少DNA大小偏倚性，使全长cDNA克隆、双杂交质粒等各种大小的质粒转化效率更接近，提高文库代表性（比DH10B高25倍）。

Hte 基因型

Hte（高效转化）基因型是Stratagene开发的特异性提高大质粒、连接DNA的宿主菌基因型，并使细胞生长加快（当天获得菌落），已经成功应用于25kb超螺旋DNA和8kb连接DNA的克隆。XL10-Gold®，BL21-Gold，BL21-CodonPlus®，SoloPack® Gold 和96Pack® Gold等系列细胞都带有这个新的性状。

超级感受态细胞

Stratagene提供多种>5 x109转化子/μg 超螺旋DNA转化效率的化学法超级感受态细胞正是克隆获得大质粒、连接DNA克隆和建库时最值得推荐的。

电转化感受态细胞

Stratagene的电转化感受态细胞特别耐受电击处理，方便好用，在DNA材料极珍贵、量少时，或构建有代表性文库时，建议采用电转化感受态细胞。ElectroTen-Blue®细胞是目前商品化的电转化感受态细胞中效率最高的，达到>3 x1010转化子/μg 超螺旋DNA。此外XL1-Blue，XL1-Blue MRF’，SURE®，ABLE® 和TG1等细胞也提供电转化形式感受态细胞。

SURE®－克隆不稳定DNA

大肠杆菌DNA修复系统会针对重复序列、二级结构（如Z-DNA）等真核DNA进行重排或删除修饰。SURE感受态细胞针对uvrC,umuC,SbcC和RecJ等参与修饰的大肠杆菌基因或蛋白进行突变，提高了真核来源、不规则DNA的稳定性达20倍以上，并且适合克隆甲基化DNA。提供化学和电转化感受态细胞，效率分别达1x1010和1x109。

ABLE®－克隆毒性DNA

目的DNA的蛋白产物常常对细胞产生毒性，通常的解决办法是采用低拷贝质粒，或者采用极为严紧的表达调控。为了获得稳定的克隆，ABLE细胞减少ColE来源质粒的拷贝数（如pUC、pBluescript系列载体），以达到保持相对较高拷贝数的同时使本底表达对于细胞的毒性降至最低的效果。

MR系列®－克隆甲基化DNA

真核基因组DNA常常因高度甲基化而被大肠杆菌修饰系统切割、删除，在构建文库时，由于要对cDNA进行甲基化保护，某些cDNA克隆也较难完成。采用Stratagene的MR (Minus Restriction)突变删除了修饰系统的感受态细胞，可以构建质量非常高的cDNA和基因组文库。这些细胞包括：用于大质粒克隆的XL10-Gold®超级感受态细胞，克隆连接DNA、转化效率目前最高的ElectroTen-Blue®电转化感受态细胞，单次反应包装的SoloPack® Gold，以及XL2-Blue MRF´，XL1-Blue MRF´ Kan（四环素抗性质粒），XL1-Blue MR（没有F´附加体），克隆有二级结构的SURE 细胞等。

重点推荐

Stratagene的ElectroTen-Blue（转化效率>3×1010）和Novagen的Nova XG Zappers（转化效率>1×1010）电转化感受态细胞均具有endA－基因型，保证质粒优质高产；recA－重组缺陷基

因型适合甲基化DNA克隆，确保片段不被删除或重排；能以IPTG诱导进行蓝白斑筛选（lacZΔM15），也使这两种细胞非常好用。此外，ElectroTen-Blue还可被M13单链噬菌体感染（F’）。

感受态细胞转化操作流程及提高转化效率的建议

1、在冰上预冷2支14-ml BD Falcon聚丙烯圆底离心管。1支用来转化样品，1支做pUC18对照。同时将NZY+ broth培养基在42°C预热。

在转化实验中使用圆底14-ml BD Falcon聚丙烯试管（货号#352059）也是关键之一。一般的试管容易被b-巯基乙醇降解。而极为重要的热激步骤的操作也是根据这种型号的试管优化的。

2、冰上融化感受态细胞。融化时轻轻将细胞混匀并分装成100ul/管。

3、每管中加入随试剂盒提供的4 ml b-ME（巯基乙醇）。

4、温和转动试管，将细胞在冰上放置10分钟，每2分钟温和转动一下。

5、每管细胞加入0.1–50 ng样品DNA (或2 ml连接反应物)(参见DNA 质量与体积说明。)

用灭菌dH2O水按1:10稀释对照pUC18 DNA，并取1 ml稀释的pUC18 DNA加入转化细胞。

6、温和转动试管，并在冰上放置30分钟。

7、试管在42°C水浴热激30秒。热激时间对转化效率极度重要。

8、试管冰浴2 分钟。

9、每管加入0.9 ml 预热(42°C) 的NZY+ 肉汤，37°C、225–250 rpm 摇床培养1 小时。

10、取200 ml转化混和物铺带有相应筛选抗生素的LB琼脂糖平板（如果进行颜色筛选还需加入IPTG和X-gal）。pUC18阳性对照则取5 ml 铺氨苄青霉素LB琼脂糖平板。

注意：细胞经1000 rpm离心10分钟会聚集，应将细胞沉淀用200 *l NZY+ 肉汤重悬。如果用于铺板的细胞<100 ml，先将细胞加入200 ml培养基中，然后用灭菌涂布棒铺板。如果采用?100 ml细胞则可以直接铺板。倾斜涂布棒并轻轻拍打，尽量减少涂布棒上的细胞残留。

11、37°C培养过夜。颜色筛选请参见以下Blue-White Color Screening的操作指南。