第二章 色谱法导论

原理: 将两相溶剂中的一相涂覆在硅胶等载体上作为固定相，
c.离子交换色谱
原理: 以离子交换树脂或表面涂有液体离子交换树脂的固
体颗粒为固定相，装在柱中，以水或含水溶剂为流动相， 使样品溶液流过交换柱，溶液中的中性分子及具有与离子 交换树脂可交换基团相反电荷的离子通过柱子从柱底流出， 而具有相同电荷的离子则与树脂上的交换基团进行离子交 换并被吸附到柱上。
a.吸附色谱法
原理: 被分离物与吸附剂表面分子相互作用而被吸附，由于
不同化合物结构及性质上的差异，在吸附剂上的吸附性能是 不同的，在色谱分离过程中，用一定的溶剂系统洗脱柱子时， 由于溶剂(洗脱剂)与混合物里各组分争夺吸附剂的活性表面， 解吸出来的组分与溶剂始终存在着对吸附剂的竞争吸附，洗 脱剂对不同的物质的洗脱能力也是不同的。 特点: 因此吸附与解吸始终贯穿整个色谱过程，吸附与解吸 是吸附色谱法的理论基础。吸附过程无选择性，吸附与解吸 附过程可逆，但吸附强弱和先后顺序都基本遵循“相似相吸 附”的经验规律。吸附力最弱的组分随溶剂首先流出。
7.峰面积
由色谱峰与基线之间所围成的面积称为峰面积，用“A”表 示，是色谱定量分析的基本依据，对理想的对称峰，峰面 积与峰高，半峰宽的关系为 A=1.065h ×W1/2。
一组分的色谱流出曲线对色谱分析十分重要，从色谱 图上可以获得以下信息： （l）根据色谱峰的个数，可以判断样品中所合组 份 的最少个数。 （2）根据色谱峰的保留值(或位置），可以进行定 性分析。 (3) 根据色谱峰下的面积或峰高，可以进行定量分 析。 （4）色谱峰的保留值及其区域宽度，是评价色谱 柱分离效能的依据。 （5）色谱峰两峰间的距离，是评价固定相(和流动 相)选择是否合适的依据。
第一节 概述
1、色谱法的概念
概念 色谱法又称色层法、层析法，是用于多组分有机混 合物的一种高效分离技术。 特点 选择性好、分离效能高、灵敏度高、分析速度快等 优点。 先进性 已逐步实现仪器化、自动化、高速化，并从分离手 段发展到分析手段，应用范围不断扩大，分离的对象早已不 限于有色物质，但“色谱法”这一名称一直被沿用。 范围 色谱法与现代新检测技术和计算机技术相结合，已 广泛食品质量与安全等的有关工作，如样品中农药残留量的 测定、农副产品分析、食品质量检验、生物制品的分离制备 等。
（4）死体积 Vm
指色谱柱在填充后，柱管内固定相颗粒间所剩留的空间、色 谱 仪 中 管路 和 连 接头 间 的 空间 以 及检测 器 的空间 的 总 和．当后两项很小而可忽略不计时，死体积可由死时间与 流动相体积流速F0（mL／min）计算： Vm = tm F0
(5)保留体积VR
指从进样开始到被测组分在柱后出现浓度极大点时所通过的 流动相的体积。保留时间与保留体积的关系：
2、色谱法的起源
1906年，俄国植物学家茨维特首创了这种分离 技术，他把植物叶绿体色素的石油醚浸渍液 倒入一根装有碳酸钙吸附剂的细直玻璃柱中， 再加入纯石油醚，任其自由流下，原混合物 开始被分离成不同颜色的谱带(色素的分离)， 且以不同速度通过子，然后按谱带颜色对混 合物进行鉴定分析。茨维特把这种分离结果 称为色谱图，把这种分离方法命名为色谱法 （chromatography）。 此后，出现了种类繁多的各种色谱法。
色谱分离
淋洗液
慢 中等 快
Temporal course
4、色谱法的分类 （1）按两相状态分类
气体为流动相的色谱称为气相色谱（GC）， 气固色谱（GS C）固定相是固体吸附剂； 气液色谱（GLC）固定相是固定液（附着在惰性载体上的一 薄层有机化合物液体）。 液体为流动相的色谱称液相色谱（LC）， 液固色谱（LSC）； 液液色谱（LLC）。 超临界流体为流动相的色谱称为超临界流体色谱（SFC）。 随着色谱工作的发展，通过化学反应将固定液键合到载体 表面，这种化学键合固定相的色谱又称化学键合相色谱 （CBPC）。
L u tm
（2）保留时间tR
试样从进样开始到柱后出现峰极大点时所经历的时间，称为 保留时间，如图中的 O′B．它相应于样品到达柱末端的检 测器所需的时间．
（3）调整保留时间tR′
某组份的保留时间扣除死时间后称为该组份的调整保留 时间，即 tR′= tR-tm 由于组份在色谱柱中的保留时间 tR包含了组份随流动相通过 柱子所需的时间和组份在固定相中滞留所需的时间，所以 tR实际上是组份在固定相中停留的总时间。 保留时间是色谱法定性的基本依据，但同一组份的保留时 间常受到流动相流速的影响，因此色谱工作者有时用保留 体积等参数进行定性检定．
(1)葡聚糖凝胶 (2) 羟丙基葡聚糖凝胶(SephadexLH-20)。
分类:
至凝胶颗粒内部的程度也不尽相同，故在经历一段时间 流动并达到动态平衡，即按分子由大到小次序先后流出 并得到分离。
过程: 样品混合物中各个成分因分子大小各异，渗入
e.亲和色谱
(3)按固相的外形分类
固定相装于柱内的色谱法，称为柱色谱。 固定相呈平板状的色谱法，称为平板色谱，它又可 分为薄层色谱和纸色谱。
所用载体，如葡聚糖凝胶，是不溶于水，但可在水中膨胀 的球形颗粒，具有三维空间的网状结构。当在水中充分膨 胀后装入层析柱中。
加入样品，用同一溶剂洗脱时，由于凝胶网孔半径的限 制，大分子将不能渗入凝胶颗粒内部(即被排阻在凝胶颗 粒外部)，所以在颗粒间隙移动，并随溶剂一起从柱底先 流出，小分子因可自由渗入并扩散到凝胶颗粒内部，故通 过层析柱时阻力增大、流速变缓，较晚流出。
VR = tR· F0
（6）调整保留体积VR′
某组分的保留体积扣除死体积后，为该组分的调整保留体积 VR ′= VR-Vm
(7) 相对保留值r2.1
某组份2的调整保留值与组份1的调整保留值之比，称为相对保 留值： V t 2.1 R 2 R2 t R1 VR1 由于相对保留值只与柱温及固定相的性质有关，而与柱径、柱 长、填充情况及流动相流速无关，因此，它是色谱法中，特 别是气相色谱法中，广泛使用的定性数据。 必须注意，相对保留值绝对不是两个组份保留时间或保留体积 之比 。
根据以上所述，将色谱法的分类总结于下表中。
第二节
色谱流出曲线及有关术语
1、色谱流出曲线和色谱峰
样品各组分在色谱柱中得到分离后随流动相依次流出色谱柱， 先后到达检测器。经检测器把各组分的浓度信号转变成电 信号，然后用记录仪或工作站软件将组分的信号记录下来， 这种组分响应信号大小随时间变化所记录下来的曲线称为 色谱流出曲线，也叫做色谱图。
第三节 色谱法基本原理




色谱分析的目的是将样品中各组分彼此分离。 组分要达到完全分离，两峰间的距离必须足够远，两峰间的 距离是由组分在两相间的分配系数决定的，即与色谱过程的 热力学性质有关。两组分分配系数相差越大，两色谱峰间的 距离就越大。 但是两峰间虽有一定距离，如果每个峰都很宽，以致彼此重 叠，还是不能分开。这些峰的宽或窄是由组分在色谱柱中传 质和扩散行为决定的，即与色谱过程的动力学性质有关。 因此，要从热力学和动力学两方面来研究色谱行为。
3、色谱法的本质
色谱法共同的基本特点是具备两个相： 不动的一相，称 为固定相；另一相是携带样品流过固定相的流动体，称 为流动相。 当流动相中样品混合物经过固定相时，就会与固定 相发生作用，由于各组分在性质和结构上的差异，与固 定相相互作用的类型、强弱也有差异，因此在同一推动 力的作用下，不同组分在固定相滞留时间长短不同，从 而按先后不同的次序从固定相中流出。 色谱法是基于混合物各组分在两相(固定相和流动相)之 间的不均匀分配进行分离的一种方法。 目前色谱法已广泛应用于许多领域，成为十分重要 的分离分析手段。许多气体、液体和固体样品都能找到 合适的色谱法进行分离和分析。
27.96
29.98 1 7.22
20.33 20 Time (min) 25 30
34.09 35
37.1 8
40.33 40
色谱图中曲线突起的部分称为色谱峰，由于响应信号的 大小或强度与物质的量或物质的浓度成正比，色谱流 出曲线实际上是物质的量或浓度—时间曲线。

如果进样量很小，浓度很低，在吸附等温线的线 性范围内，色谱峰如果对称，可用Gauss正态分 布函数表示：
（2）按分离机理分类





吸附色谱法：利用组分在吸附剂（固定相）上的吸附能 力强弱不同而得以分离的方法。 分配色谱法：利用组分在固定液（固定相）中溶解度不 同而达到分离的方法。 离子交换色谱法：利用组分在离子交换剂（固定相）上 的亲和力大小不同而达到分离的方法。 凝胶色谱法或尺寸排阻色谱法：利用大小不同的分子在 多孔固定相中的选择渗透而达到分离的方法。 亲和色谱法：最近，又有一种新分离技术，利用不同组 分与固定相（固定化分子）的高专属性亲和力进行分离 的技术，常用于蛋白质的分离。
RT: 0.00 - 42.26 1 00 90 80 70 SM : 7G 23.93 NL: 7.27E7 TIC M S 2002-475
Relative Abundance
60 50 40 30 20 1 0 0 0 5.62 5 1 0 9.63 1 2.01 1 5 4.20 25.68
规律：由于不同离子与同一树脂交换能力不同，移动速度
也不同，在柱上形成色谱带，另选一适当的洗脱剂(含有比 吸附物质更活泼的离子)进行洗脱交换，可将吸附物质按先 后顺序从柱上洗脱下来，即可实现不同组分物质的分离。
范围：主要用于分离氨基酸，生物碱，糖类化合物。
d.凝胶色谱法
原理: 也叫分子筛过滤，利用分子筛分离物质的一种方法。
C0 1 t tr 2 C exp[ ( ) ] 2 2

式中：C—不同时间t时某物质在柱出口处的浓度， C0—进样浓度，tr—保留时间，σ—标准偏差。
2、基线
在实验操作条件下，柱中仅有流动相通过时，检 测器响应讯号的记录值，即图中O-t线。它应该 是一条直线，若是斜线就称为基线漂移，如果 基线出现上下波动则称为噪声。保持基线平稳， 是进行色谱分析的最基本要求。