报告基因检测系统

第六章报告基因检测系统
公司现已发展的有三种报告基因检测系统:NF-Kb,p53,NFAT.根据待检基因对其作用的原理,及在药物,抗体等作用下,产生的不同效果,这三种报告基因系统又具体可以分为:NF-kB 刺激系统和NF-kB 抑制系统;p53刺激系统和p53抑制系统;NFAT刺激系统和NFAT抑制系统.
1. NF-kB 报告基因检测系统
(NF-kB 刺激系统;NF-kB 抑制系统)
1.1细胞培养
1)细胞株及材料
细胞株: 293-T细胞
培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)
培养器皿:T75(75cm2)培养瓶(以下相同),24孔细胞培养板
2)细胞培养及铺板
a) 传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种293T至75 cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.
注:一般一瓶细胞总数可以达到3×107个,可以按1:8分瓶.
b) 铺板:
细胞消化:将培养好的293 T细胞,倾去培养基,加入1-2ml1×胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min,观察细胞从瓶壁上脱落下来(也可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS) 10ml左右,终止胰酶的消化作用,随后从中取少量细胞计数.
细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数,细胞密度的计算按照公式:
细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数
铺板: 24孔板按照每孔1.0105(NF-kB 刺激系统)或0.8105(NF-kB 抑制系统),接种体积为500L来铺板.
细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.
1. 2 转染
1)试剂及材料:
转染试剂:Lipofectamin 2000
质粒: a:对照质粒:pEF-BOS
TRAF6(NF-kB 刺激系统)
Dominant negative TRAF6 (NF-kB 抑制系统)
b:NF-kB-luc report plasmid
c:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上
2)转染:
铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.
在A,B两个eppendorf管中分别加入:
A:0.1g NFkB-luc reporter gene+0.4g interest gene+ serum free DMEM 至终体积50l/孔.
B:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5min
A,B二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100L,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.
NF-kB 刺激系统:negative cotrol: pEF-BOS
positive control:TRAF6,
NF-kB 抑制系统:negative cotrol: pEF-BOS
positive control:Dominant negative TRAF6(TRAF6 DN).
(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)
1.3 细胞收获及处理
刺激因子:TNF(肿瘤坏死因子),母液浓度2g/Ml,使用浓度20ng/ml
Buffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;
NaCL: 50 mM;
EDTA: 2 mM;
MaSO4: 1 mM;
DTT: 5 mM;
Triton X-100:1% )
1) NF-kB 刺激系统:
转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率,处理细胞.
2)NF-kB 抑制系统:
转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率
加药刺激:TNF用DMEM 培养基稀释后,200l/孔换液.
加药刺激12-16小时后收细胞.
3)细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,在摇床上振荡10-15分钟.置于冰上后,取出5l裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,可以马上上机,或放入-80C保存.
1.4 luciferase 分析
参见promega公司的TECHNICAL MANUAL 上机操作方法附在后面.
1.5 Western-blot检测待检基因的表达情况
见后.
2. p53报告基因检测系统(P53抑制系统)
p53刺激系统仍在优化之中,因此主要介绍p53抑制系统的操作步骤.
2.1 细胞培养及铺板
1)细胞株及材料:
细胞株: Saos(p53-/-),细胞骨肉瘤细胞(Osteosarcoma cell),缺失p53基因. 培养基: DMEM(10%FBS GBICO),DMEM(无血清)
培养器皿:75cm2培养瓶,24孔细胞培养板
2)细胞培养及铺板:
a)传代:用DMEM(10%FBS) 培养基接种Saos至75cm2培养瓶,细胞长满后铺板并传代.一瓶75cm2的细胞长满约为1107个.
b) 铺板:
细胞消化:将培养好的Saos细胞(75cm2培养瓶),倾去培养基,加入2ml胰酶轻轻摇晃以覆盖整瓶细胞,37℃培养箱放置2-3min.观察细胞从瓶壁上脱落下来(也
可以用手拍击瓶壁),显微镜下观测到细胞成单个,或是只有2-3个细胞聚团,即可以加入含有血清的DMEM(10%FBS)10 ml左右,终止胰酶的消化作用.
细胞计数:如果细胞密度较大,可按一定倍数稀释后计数.
细胞密度(单位:个/ml)=(4个大方格的细胞总数/4)×104×稀释倍数
铺板:24孔板的细胞接种量为每孔1.0105个,接种体积为500l来铺板.
细胞加入后将24孔板沿水平面桌面的方向前后左右来回晃动(勿转动),使细胞能够均匀分布,放置细胞培养箱生长.
2.2 转染
1)试剂及材料:
转染试剂:Lipofectamin 2000
质粒: a:对照质粒:pEF-BOS; P53 wild type plasmid
b:P53-luc report plasmid
c:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上
2)转染:
铺板后24小时转染,每个样品须作3个重复孔,目的是为消除实验误差,并且在24孔板上相应位置做好标记.在a,b两个eppendorf管中分别加入:
a:0.1g P53-luc reporter gene+0.4g interest gene+ 25ng P53 wild type plasmid +serum free DMEM 至终体积50l/孔.(negative cotrol不加P53 wild type plasmid)
b:1.5L lipofectamine 2000+48.5L serum free DMEM 体积为50l /孔,室温放置5min
a,b二者混合,室温放置20-30min后将混合液缓慢而均匀的加到24孔板细胞液中,每孔为100l,轻轻摇晃,使DNA分布均匀,培养24hr.
P53抑制系统:negative cotrol: pEF-BOS
positive control:pEF-BOS+P53 wild type plasmid
(进一步具体转染方法可以参照Lipofectamin2000的说明书.)
2.3 细胞收获及处理
Buffer: 5×PBL裂解液 (Tricine:pH7.8,40 mM;
NaCL: 50 mM;
EDTA: 2 mM;
MaSO4: 1 mM;
DTT: 5 mM;
Triton X-100:1% )
1) 转染后24小时先通过荧光显微镜观察GFP表达的强弱以判断转染效率.
2) 细胞处理:吸干培养液,24孔板中每孔加入1×PBL buffer,室温下摇床上振荡10-15分钟.置于冰上,取出5L裂解液,加入发光管中,可以马上上机检测,或放入-80C保存.
2.4 luciferase 分析
上机操作方法附在后面.
2.5 Western-blot检测待检基因的表达情况
操作附在后面.
3. NFAT报告基因检测系统
(NFAT刺激系统;NFAT抑制系统)
3.1 细胞培养
1)细胞株及材料:
细胞株:Jurkat-T细胞
培养基:RPMI 1640(10%FBS GBICO;1%双抗),RPMI 1640(无血清)
培养器皿:75cm2培养瓶;175cm2培养瓶;25 cm2培养瓶;96孔细胞培养板
2)Jurkat-T细胞的培养:
Jurkat-T细胞为悬浮细胞,细胞活力好时,镜检多为10-20个细胞聚团,少游离的单个细胞,细胞圆而透亮.一般培养按密度来计算,起始培养密度不要低于1105个/ ml,24hr后细胞密度即可达到2105个/ ml,以此类推在第五天上即可以达到1.6106个/ ml,根据这个来调整接种密度及传代天数.最好细胞的密度高不能超过1.6106个/ ml.
例如,起始培养密度2105个/ ml,体积30 ml,在第三天时, 细胞密度达到8105个/ ml,细胞总数达到2.4107个,因为检测一个待检基因的电击所需细胞数量为1107,所以,此培养的细胞数只能做 2.4个样品,因此,根据实验所需要检测的样品数目来调整培养细胞的体积(象175cm2的培养瓶可以培养200-250ml,细胞总数可以达到16-20107,这样就可以电击16-20个样品).
3.2 电击转化
细胞总数达到检测样品所需则可转染.
转染用品:电击仪,400mm 电击杯(Biorad #1652088)
质粒: a:对照质粒:NFAT刺激系统:negative control:pEF-BOS
posivie control: SYC plasmid
NFAT抑制系统: negative control:pEF-BOS
posivie control: SLIM plasmid
b: NFAT-luc report plasmid
c:目的基因质粒,构建在pEF-FN载体上
试剂: 台盼蓝(0.4%)用于活细胞计数.
1)将Jurkat-T细胞转到50ml离心管中,细胞计数(细胞密度最好在1106左右).
2) 1000rpm离心,用无血清的RPMI1640培养液收集细胞,调整浓度为2.5107/ml,每个电极杯中加入400l细胞液(细胞数为1107个).
3)依次加入10g NFAT-luc reporter gene和20ug interest gene(体积控制在20l以内),使质粒和细胞混匀(尽量不要有bubble).NFAT-luc reporter gene是每个电击杯都必须加的可以先在加到电击杯之前预先和细胞混好.
4)电击条件250V,950F.电击前轻轻弹击电击杯,将杯底的细胞重悬起来,注意不要产生气泡.电击时观察一下time constant(约为24ms).
5)电击完后立即弹击电击杯的侧壁数次,室温下放置30min.
6)将电极杯中的细胞加到10ml RPMI1640培养液中(含serum)24cm2培养瓶,培养40hr(即培养到第三天上午).
3.3 铺板,加药
C305:1:60稀释使用
PMA: 储存浓度为0.5mg/ml,应用浓度为50ng/ml(稀释10000倍)) Ionomycin: 储存浓度为1mM,应用浓度为1M(稀释1000倍));详见附1.
1) 将转染培养40hr后的细胞转到15ml离心管中,进行活细胞计数(台盼蓝染色),离心收细胞,调整细胞浓度为2106个/ml.
2) 在96孔板中,每孔加50l细胞(细胞数为1105个),每个样品还是要做3个复孔.NFAT刺激系统,NFAT抑制系统可以同时进行,前者无需加药刺激,后者需要做
C305抗体刺激和PMA+ Ionomycin刺激,因此,一个样品需要做9个复孔.按顺序在96孔板中加入细胞,并相应做好标记.
3) 对于NFAT刺激系统,直接在每孔中补加50l新鲜培养基,使终体积为100l;对于NFAT抑制系统分别加入50l C305(anti-TCR, 60倍稀释);或50l PMA(50ng/ml)+Ionomycin(1M),刺激8-12小时.
3.4细胞收获及处理
试剂:5×PBL裂解液(同前).
将刺激8-12小时后的细胞取出,每孔加入25L 5PBL buffer,将细胞置于-80C保存,准备第二天检测.
3.5 Luciferase检测
将细胞培养板取出,37C放置10-15min,将裂解液融化,显微镜下确认细胞已完全裂解,取出5L裂解液置于发光管中,上机检测.
3.6.Western-blot检测待检基因的表达情况
见下.
4.Western-blot
试剂:Flag-antibody(1:4000)
goat anti-mouse-HRP
Pierces显色底物.
取剩余细胞裂解液加入SDS Loading buffer.
裂解液与SDS Loading buffer比例视蛋白浓度而定.一般293 T细胞裂解液按1:1加入2SDS Loading buffer,Jurkat T和Saos细胞裂解液按6:1加入6 SDS Loading buffer.
100℃加热变性5-10分钟,上样.聚丙烯酰胺蛋白胶浓度为10%,75V/125V.一般Jurkat T和Saos细胞上样量为20l,293 T细胞为8l.
电泳:根据所要分离的蛋白质分子量大小,配制适当浓度的SDS-PAGE胶,常用浓度为10%-20%
转膜
湿转
在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和4张普通滤纸浸泡约10min(若用PVDF膜,则首先要将PVDF膜置于甲醇中浸透10min,然后和硝酸纤维素膜同样使用);
依次将2张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,2张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极装入转膜电泳槽中(胶在阴极);
接通电源,在4℃冰浴中进行转膜,恒流300毫安(或恒压100伏)转膜>1hr,或恒压30伏转膜过夜.
B,半干转
在一适当容器中加入转移缓冲液,将与凝胶相同大小的硝酸纤维素膜和2张约3mm厚滤纸浸泡约10min;
依次将1张滤纸,SDS-PAGE胶,膜,1张滤纸叠放在一起,对齐并赶出其中的气泡; 将膜靠近阳极(底部)装入转膜仪中(膜在下,胶在上);
接通电源,恒流0.8毫安/cm2膜, 转膜1.5hrs;
杂交(以下各步均置于摇床上进行)
a) 将转好的膜浸于5%脱脂奶中封闭30min;
b) 将膜浸于含有一抗(终浓度为1μg/ml)的TBST中室温1hr;
c) 用TBST将膜浸洗3次,至少10min/次;
d) 将膜浸于含有二抗的TBST中室温30min;
e) 用TBST将膜浸洗3次,>10min/次,膜即可用于显色反应.
若使用偶联酶标抗体(例如:anti-flag-HRP),则在牛奶封闭后, 将膜浸于含有抗体的TBST中1hr,然后用TBST将膜浸洗3次,10min/次,膜即可用于显色反应. 显色
目前主要使用PIERCE试剂盒显色
将膜表面的液体略微沥干,置于干净的保鲜膜上;
将等体积的底物1和底物2混合(通常用量为10μl / cm× cm膜)后,均匀覆盖于膜的表面,避光放置3-5min;
将膜表面的液体略微沥干后,用干净的保鲜膜包裹,固定于暗盒中即可压X光片,压片时间可适当调节;
显影,定影,分析结果.
膜的strip--膜经Strip后可继续用于另一次western blot实验
将膜浸于stripping buffer中,50℃放置30min;(最好放在通风柜中)
用TBST浸洗膜2次,每次置于摇床上10min;
5% 脱脂奶粉封闭30分钟.
相关试剂:
5×SDS-PAGE电泳缓冲液:Tris碱 15.1g, 甘氨酸94g, SDS 5g,加水定容至1000ml.
转膜缓冲液:Tris碱 4.55g, 甘氨酸21.625g, 甲醇 200ml,加水定容至1000ml. TBST:1×TBS,0.1% Tween-20.
Stripping buffer 100ml -巯基乙醇: 700ul
2%SDS: 2g
62.5mM Tris HCl: 0.76g, pH6.7
5. 注释
5.1几种药物的储存浓度和应用浓度
TNF 1106U/瓶 1mg=4107U, 1106U=25g 溶于12.5ml PBS中,浓度为2g/ml.
储存浓度:2g/ml,100l分装,存于-40℃
应用浓度:20ng/ml(稀释100倍)
C305 60倍稀释使用.C305原液分装存于-80℃,稀释后存于-20℃,短期(不超于一周)可放置4℃,并加入少量NaN3,无菌操作.
PMA and Ionomycin(dissolved in DMSO)
PMA:1支1mg溶于2ml DMSO 即0.5mg/ml
储存浓度:0.5mg/ml,3l 分装(储存于-80C)
应用浓度:50ng/ml(稀释10000倍)
Ionomycin: 1mg/747.1(MW)=1.3310-3mmol 溶于 1.33ml,浓度为1mM.(储存于-80C)
储存浓度:1mM,6l 分装.
应用浓度:1M(稀释1000倍)
各系统的control
NF-kB 刺激系统:TRAF6与NFkB reporter gene共转染, 作为positive control. NF-kB 抑制系统:Dominant negative TRAF6与NFkB reporter gene共转染,抑制TNF诱导的NFkB活性.
p53抑制系统:wt-P53与p53-luc共转染,作为positive control.
NFAT刺激系统:SYK与NFAT-luc共转染,作为positive control.
NFAT抑制系统:SLIM与NFAT-luc共转染,抑制C305诱导的NFAT活性,作为positive control.
5.3 Lumat LB P507仪器操作步骤
开机,和注入反应底物.
a.开机后,仪器的液晶屏出现:
b.选择 -OTHERS- 选项,进入子菜单:
c.选择 OPER.FUNCT.选项,进入菜单:
d.选择 REAGENT 选项,进入菜单:
e.选择PRIME 选项,进入菜单:
f.选择INJECT 1选项,进入菜单:
g.取一只干净的上样管插入到检测槽中,显示屏上立即显示:
h.选择START 选项,检测槽开始旋转,显示屏上显示:
i.当没有加入底物的情况下,此时是将导管内的残留水分抽出,确定导管内的水分全部抽干后,将底物瓶换上,此时屏幕显示程序返回到"e".重复e-h步骤将底物充满整个导管.
j.当界面回到"e"时,按"EXIT"键返回到界面"a".
上样检测:
a.
b.选择"MEASURE",进入界面:
c.选择"PROTOCOLS",可以打开一个事先储存的程序,进入界面:
根据提示键入数字3,并按"enter"键,进入程序3.
d.选择"PRINT LIST"选项,可以打印出程序3的各项检测参数:
e.选择:"YES"进入界面:
f.键入"enter"键,进入界面:
g.按提示将样品管插入到检测槽中并按"START"键,开始检测:
h.第一个样品的第一个复孔读值出来后,仪器屏幕会自动提示加入第一个样品的第二个复孔样品管:
与步骤"g"相同,略,屏幕出现加入第三个复孔样品管:
第三个复孔读值出来后,仪器自动计算"MEAN"值,并打印在纸上.
屏幕出现下一样品检测命令:
以后操作与f-h相同.
检测完仪器的清理
所有样品检测完毕后,按"exit"键回到仪器开始状态,并将底物瓶换成空瓶:
选择"OTHERS"选项,与"1 开机加底物"步骤中的b-d相同,进入:
选择"OTHERS"选项,进入界面:
c.选择"WASH"选项,进入界面:
选择"INJECT 1",与"1 开机加底物"步骤中的f-g相同根据提示选择"START"键,进入界面:
将残留在导管中的底物全部吸出后(可回收再用),将空瓶换成水瓶后重复上述操作洗涤1-2遍,直至收集管中无底物颜色为止,再将水瓶换成空瓶后抽干导管中的残留水分,即可按"EXIT"键退回仪器初始菜单,关机.
注:双报告基因系统的检测程序为6号程序.。