药物分离与检测科学

《药物分离与检测科学》
Ⅰ、GC-MS
仪器组成：载气系统、进样系统、色谱柱和柱温箱、检测器、数据处理器（《仪器分析》第4版P5-6）
程序升温（temperature programing）（P22）
热导池检测器（TCD）的结构与工作原理（P34-37）
氢火焰离子化检测器（FID）的结构与工作原理（P38-40）
质谱仪的组成：真空系统、进样器、离子源、质量分析器、离子检测器（P394-400）
离子源：是使中性原子或分子电离，并从中引出离子束流的装置
EI（Electron impact ion source，电子轰击离子化）原理（P395）：用离子源电子束由通电加热的灯丝(阴极)发射，由位于离子化另一侧的电气(阳极)所接收，此两极问的电位差决定了电子的能量。

大多数标准质谱图是在70ev获得的。

具有一定能量的电子与由进样系统进入离子化室的样品蒸气相碰撞，导致样品分子的电离，分子失去或得到一个电子成为有一个不成对电子自由基离子(radical ion)，称为分子离子M+，M+继续受到电子轰击而引起化学键的断裂或分子重排，瞬间产生多种离子。

特点：使用最广泛，谱库最完整；电离效率高；结构简单，操作方便；但分子离子峰强度较弱或不出现（因电离能量最高）。

CI（Chemical Ionization，化学电离源）原理(P397)：使用时，往离子源中送入反应气和气化的样品，由于反应气分子与样品分子相比是比较多的，所以反应气先被轰击电子电离成离子，然后反应气离子和样品分子发生反应，产生样品离子。

以甲烷反应气为例，部分反应为：
多用于不稳定的样品分子。

特点：准分子离子峰的强度高，碎片离子峰少，强度低。

软离子化（Soft Ionization）：给样品较小能量的电离方法为软电离方法，得到丰度高的分子离子峰或准分子离子峰，但能供结构信息的碎片离子较少；ESI、MADLI
硬离子化（Hard Ionization）：能给样品较大能量的电离方法为硬电离方法，多得到碎片离子峰，有助于分析化合物结构，EI、CI、FAB。

GC与MS的连接：喷射式分子分离器，载气带着组分气体，一起从色谱柱流出，经过一小孔加速喷射进入分离器的喷射腔中，分离器进行抽气减压，由于载气分子量小，扩散速度快，经喷咀后，很快扩散开来并被抽走。

而组分气体分子的质量大，扩散速度慢，依靠其惯性运动，继续向前运动而进入捕捉器中。

必要时使用多次喷射，经分子分离器后，50%以上的组分分子被浓缩并进入离子源中，而压力也降至约1.3×10-2Pa。

Ⅱ、LC-MS
梯度洗脱（Gradient elution）（P84）
HPLC的分离原理：液液分配、液固吸附、离子对、离子交换，空间排阻（P70-77）MALDI（Matrix-Assisted Laser Desorption，基质辅助激光解吸电离）MALDI的原理是用激光照射样品与基质形成的共结晶薄膜，基质从激光中吸收能量传递给生物分子，而电离过程中将质子转移到生物分子或从生物分子得到质子，而使生物分子电离的过程。

因此它是一种软电离技术，适用于混合物及生物大分子的测定。

ESI（Electron Spray Ionization，电喷雾离子源）：经液相色谱分离的样品溶液流入离子源。

在N2流下汽化后进入强电场区域，强电场形成的库仑力使小液滴样品离子化，借助于逆流加热N2分子离子颗粒表面液体进一步蒸发，使分子离子相互排斥形成微小分子离子颗粒。

样品溶液通过毛细管喷嘴喷出，带电液滴被静电场吸向质谱入口，同时伴随干燥或加热干燥气体吹送，使液滴表面溶剂挥发，液滴体积变小，表面电荷密度变大，当同种电荷之间的库仑斥力达到雷利极限时，突破表面张力，液滴爆裂为更小的带电液滴，这一过程不断重复，使最终的液滴非常细小，呈喷雾状，此时液滴表面电场非常强大，使分析物离子化，带单电荷或多电荷。

特点：软电离，既可以分析小分子，又可以分析大分子。

APCI（Atmospheric Pressure Chemical Ionization，大气压化学电离源）从液相色谱流出的样品溶液进入一具有雾化气套管的毛细管，被氮气流雾化，通过加热管时被气化。

在加热管端进行电晕尖端放电，溶剂分子被电离，充当反应气，与样品气态分子碰撞，经过复杂的反应过程，样品分子生成准分子离子。

APPI（大气压光致离子化）
质量分析器：
术语：灵敏度（sensitivity）：单位量的样品产生的信号强度；
分辨率（resolution）:如果质谱仪在质量M处刚刚分开M和M+△M两个质量的离子，则R=M/△M；
质量范围：所能测定的质荷比的范围；
质量稳定性：常用一定时间为质量漂移的质量单位来表示；
质量精度（准确度）：是多次测量的离子实测值（M）与理论值（M0）的相对标准偏差。

四级杆质量分析器（quadrupole-MS,Q-MS）（P403）
离子阱质谱（Ion-trap MS）（P404）
飞行时间质量分析器（Time of flight，TOF）(p404)
串联质谱：
三重四级杆（Triple Quadrupole MS，QqQ，空间串联）（P425）
四级杆-TOF（Q-TOF，空间串联）
离子阱质谱（时间串联）
CID（collision-induced dissociation，碰撞诱导解离）通过与中性分子碰撞将能量传递给离子的过程。

能量传递足以导致键的开裂和重排。

通过CID会产生碎片，碎裂过程如下：ABCD+→ABC+ + D（中性碎片）
电荷保留在质子亲和势较高的碎片上。

MRM（multiple reaction monitoring，多反应监测）MRM技术是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术。

MRM技术是在单反应监测(single reaction monitoring, SRM)技术的基础上演化而来的。

对于MRM技术而言关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导(collision-induced)，最后去除其他子离子的干扰，只对选定的特异子离子进行质谱信号的采集。

具有灵敏、准确和特异等优点
TIC（Total ion current/chromatogram，总离子流图）在GC-MS或LC-MS等方法中使用的一种色谱图。

质量分析器在可能出现的质荷比范围内以固定时间间隔重复地扫描，检测系统就可连续不断的得到变化着的质谱信号。

计算机一边收集存储，一边将每次扫描的离子流求和，获得总离子流。

总离子流随时间变化的图谱称为总离子流色谱图(TIC)。

EIC（Extracted ion current/chromatogram，萃取离子流图）从TIC中提取的某个离子的色谱图。

ICP（Inducting coupled plasma, 电感耦合高频等离子体）等离子体是一种由自由电子、离子、中性原子与分子所组成的在总体上呈中性的气体。

当在感应线圈上施加高频电场时，由于某
种原因（如电火花等）在等离子体工作气体中部分电离产生的带电粒子在高频交变电磁场的作用下做高速运动，碰撞气体原子，使之迅速、大量电离，形成雪崩式放电，电离的气体在垂直于磁场方向的截面上形成闭合环形的涡流，在感应线圈内形成相当于变压器的次级线圈并同相当于初级线圈的感应线圈耦合，这种高频感应电流产生的高温又将气体加热、电离，并在管口形成一个火炬状的稳定的等离子体焰矩。

载气带试样气溶胶通过等离子体时，被加热至6000-7000K，并被原子化和激发产生发射光源。

Ⅲ、CE/CEC-MS
CE/CEC（p105）优点：样品用量少，柱效高，分离选择性好
Interface in CE/CEC-MS：
1.Coaxial sheath flow interface(同族鞘流界面)连接口是一个同心的不锈钢毛细管套在电泳毛细管的末端，鞘内充有鞘液。

再在此不锈钢套外再套一个同心的钢套，鞘内通鞘气。

鞘液与毛细管电泳缓冲液液体在尖端混合，同时被鞘气雾化。

2.Liquid junction interface：液体连接，该接口为CE末端与一个直径10~20mL的槽垂直相连,槽内充有CE缓冲液。

与CE末端相对的槽的另一端接上ESI。

此装置优点在于可通过任意调节槽内液体流速以改善ESI效果,然而这通常是以谱带展宽和分离效能减低为代价取得的。

此外,该装置技术难度较大,现仅见于芯片CE与MS联用的仪器
3.Sheathless interface（无鞘流连接）该CE末端做成尖细状以获得稳定的电子雾化。

该末端外套一同心套管,内通鞘气。

该接口难点是不易同时保持CE和ESI的电路循环。

为此,在毛细管末端粘上金丝或镀一层金,但因为金的粘着力差,易被机械的或电子的原因除掉,因而接口性能差且寿命短。

此种接口相对于同轴液体鞘流接口,待分析物未被稀释,检测灵敏度要好一些,尤其是与微克级或纳克级电子雾化源相连时。

药物样品前处理：
Stacking（电堆集）电堆集富集是毛细管电泳中的一种在线样品浓缩技术,通过流体动力学进样来实现[15～20]。

将样品溶解于水或低浓度的背景电解质中,由于样品溶液的电阻率大于载体电解质的电阻率,当施加高压后,导致分配在样品区带中的电场强度高于充满载体电解质部分的电场强度,使得样品区带的样品离子在高电场下,电泳迁移速度大大提高。

当样品离子迁移到样品溶液和载体电解质溶液的界面时,在低电场作用下,电泳迁移速度降低,这样在样品溶液和载体电解质溶液的界面处,形成一个窄的区带,样品离子得到浓缩。

Sweeping（电扫集）采用带电荷的表面活性剂作为假固定相,而样品中没有表面活性剂,当进样后应用电压,带电荷的表面活性剂穿过样品区捕集中性分析物,就像用扫帚清扫分散的稻谷一样.
SPME（固相微萃取）SPME是在固相萃取技术上发展起来的一种微萃取分离技术，是一种集采样，萃取，浓缩和进样于一体的无溶剂样品微萃取新技术。

与固相萃取技术相比，固相微萃取操作更简单，携带更方便，操作费用也更加低廉；另外克服了固相萃取回收率低、吸附剂孔道易堵塞的缺点。

SPME有三种基本的萃取模式：直接萃取（Direct Extraction SPME）、顶空萃取(Headspace SPME)和膜保护萃取（membrane-protected SPME）。

Enzyme Micro-reactor
手性药物的分离分析
原理：三点识别模式
1.主体-客体相互作用
2.配位体交换
3.Pirkle’s Chiral recognition
4.Chiral recognition “molecular imprinting”
Chiral selector
Sheath liquid
如何理解离子阱质谱为串联质谱？举例说明LC-MS？。