噬菌体抗体库技术

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噬菌体抗体库的构建流程

噬菌体抗体库的构建流程一、获取抗体基因来源。

这可是构建噬菌体抗体库的第一步呢。

咱得先找到抗体基因从哪儿来呀。

一般来说呢，可以从免疫后的动物或者人的淋巴细胞里获取。

比如说，给小老鼠打了某种抗原，然后过一段时间，从小老鼠的脾脏或者淋巴结里把淋巴细胞分离出来。

这就像是去寻宝，淋巴细胞里就藏着咱们要的抗体基因这个大宝贝呢。

二、提取mRNA。

有了淋巴细胞，下面就得把里面的mRNA弄出来啦。

这个mRNA可重要了，它就像是抗体基因的信使。

我们要用特殊的方法，就像用一把很精细的小镊子，把mRNA从淋巴细胞这个大集体里挑出来。

这个过程可得小心点儿，就像呵护小幼苗一样，因为mRNA很容易被破坏掉呢。

三、反转录合成cDNA。

把mRNA弄出来之后呀，就得把它变成cDNA啦。

这就像是一场神奇的魔法，mRNA 的信息通过反转录酶这个魔法棒，变成了cDNA。

这个cDNA就相当于抗体基因的另一种形式，但是它更稳定，方便我们后面的操作。

四、扩增抗体基因片段。

有了cDNA，还得把抗体基因片段扩增出来。

这就好比是把一个小种子变成一大片花海的过程。

我们可以用PCR技术来做这件事。

这个技术就像一个超级复印机，能把我们想要的抗体基因片段复制好多好多份，这样我们就有足够的材料来构建抗体库啦。

五、构建重组载体。

接下来呢，要把扩增好的抗体基因片段放到一个载体上。

这个载体就像是一辆小卡车，把抗体基因片段运到噬菌体这个大工厂里。

我们要把载体和抗体基因片段连接起来，这个过程就像搭积木一样，得小心翼翼地让它们完美结合。

六、将重组载体导入噬菌体。

把重组载体构建好之后，就该把它送到噬菌体里去啦。

这就像把货物装上卡车，然后让卡车开到目的地一样。

我们可以通过一些特殊的方法，让噬菌体接受这个带着抗体基因片段的重组载体，这样噬菌体就变成了一个小小的抗体生产车间啦。

七、筛选阳性噬菌体。

最后一步也很关键哦。

在众多的噬菌体里，我们要把那些成功表达了我们想要的抗体的噬菌体找出来，这些就是阳性噬菌体啦。

噬菌体展示技术和其应用ppt课件

2024/3/30
25
应用举例：
部分做过的工作
2024/3/30
26
一、半合成噬菌体抗体库的构建
构建一个半合成抗体库，不经免疫制备人源抗Tie2 Fab抗体。通过RT-PCR方法，从人脐带血淋巴细胞总 RNA 扩增轻链基因及重链VH段基因，将轻链基因插入pCOMb3载体中，得人轻链质粒库；从乙肝表面抗体（HBsAb）的Fd段基因制备含有不同长度随机化 CDR3的FR3-CDR3-J-CH1片段，然后将VH段基因与随机化的CDR3融合，得到Fd基因片段，再将其插入轻链质粒库中，得半合成人Fab质粒库。
成3节段
2024/3/30
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M13噬菌体
丝状噬菌体
λ噬菌体、T4噬菌体、T7噬菌体
蝌蚪形噬菌体
2024/3/30
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T7与M13相比优势明显
T7Select的优势解释
是在细胞质中表达的裂解性噬菌体
C-端融合
与M13不同，T7是裂解性的，其展示的蛋白无需分泌。
插入序列被克隆到T7Select载体基因10 的C-端，可以使带有终止密码子的插入子得以表达和展示。
2024/3/30
34人源噬菌体Fab抗体半合成的构建将酶切纯化的重链重叠PCR产M13的超感染下，繁殖出表算出κ＋Fd（包括CDR3-5个菌落，涂格，过夜培养后菌落PCR：其中6个克隆中有轻链也有重链。双链插入率为60％左右。
κ 链文库的容量为 5.03×106,λ 链文库的容量为 6.8×106(多次建库混合后的库容量)。
从平板上随机挑取10个菌落，涂为70％。
载体克隆容量大 T7载体比M13克隆容量大，而任何克隆到M13上大于1 kbp的片段都不稳定。

噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展

噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展王志文【期刊名称】《蚌埠医学院学报》【年(卷),期】2015(040)001【总页数】3页(P131-133)【关键词】噬菌体;噬菌体抗体库;小分子抗体;免疫抗体库;综述【作者】王志文【作者单位】蚌埠医学院临床检验诊断学实验中心,安徽蚌埠233030;蚌埠医学院生物化学与分子生物学教研室,安徽蚌埠233030【正文语种】中文【中图分类】R373.9噬菌体抗体库技术是由噬菌体展示技术发展而来的一项新型抗体制备技术。

通过噬菌体表面表达技术，将抗体分子Fab段基因或Fv基因通过与噬菌体外壳蛋白Ⅲ或蛋白Ⅷ基因连接以融合蛋白的形式表达在噬菌体表面，从而形成噬菌体抗体。

继1988年Parmley等［1］首次阐明噬菌体表面表达技术以来，抗体分子是噬菌体表面表达的第一个具有天然蛋白质功能的蛋白质分子。

Hoogenboom等［2］将轻链基因插入噬菌体载体的左臂，重链基因插入噬菌体载体的右臂，连接后包装成噬菌体，建立了第一个噬菌体抗体文库。

随着噬菌体载体系统的改进，噬菌体抗体技术得到广泛的应用，为了提高抗体库的多样性，在CDR区随机引入核苷酸序列而构成人工合成噬菌体抗体库;在已获得的阳性克隆的基础上，在特异性抗体基因CDR区进行基因突变筛选［3］，以获得高亲和力的特异性抗体。

噬菌体表面展示技术的问世和噬菌体抗体表达筛选系统的逐渐完善，使人们可以完全跨越抗原免疫而直接获得丰富多样的特异性抗体。

本文就噬菌体抗体库构建和筛选技术及应用研究进展作一综述。

1 噬菌体抗体库技术噬菌体属DNA单链病毒，长约7 000 bp。

噬菌体在细菌内滚环复制，被噬菌体感染的细菌不会裂解，但生长速度减慢，同时分泌出大量成熟的噬菌体颗粒。

噬菌体基因组共编码11种蛋白，噬菌体展示技术通常选择在信号序列和p蛋白第一结构域之间插入外源蛋白编码序列，经过噬菌体的包装加工，外源蛋白即可表达在病毒颗粒的表面［4］。

Ward等［5］采用PCR技术从溶菌酶免疫后的小鼠脾细胞DNA中扩增出VH基因，测序证实了其多样性，并随后在大肠埃希菌中表达了该VH片段。

噬菌体展示技术的原理及应用

8、 DNA结合蛋白：
锌指蛋白是一类 DNA 结合小肽结构物，这些结构含有锌，能用于构建一个大的蛋白区域，去识别和结合特殊的 DNA 序列。噬菌体展示技术也可以用于创造一个大的、具有识别不同 DNA 序列的锌指的多肽库。利用这个多肽库，可以研究有关氨基酸序列与 DNA 结合位点之间的识别规则，可以通过设计锌指多肽去控制基因的表达，比如抑制小鼠细胞系中的癌基因，也可以启动表达质粒的基因，或干扰病毒感染插入的片段是从某些组织或细胞中抽提的mRNA 的互补DNA 片段,它用来筛选与受体特异性结合的片段。一般可利用M13 噬菌体或其他表达一部分真核蛋白,而M13 噬菌体和其他E. coli噬菌体所能表达的真核蛋白更少。研究表明,没有一个展示系统能够表达所有的真核细胞蛋白。无论如何,噬菌体表面cDNA 库的表达将是研究蛋白质之间相互作用的有用工具。cDNA 库的噬菌体展示提供了一个应用免疫学方法进行酶：
例：碱性磷酸酶，蛋白水解酶类，等等
6、底物与抑制剂：
主要是蛋白酶的底物和其抑制剂。
7、信息传递研究:
利用噬菌体展示多肽库，发现了一些受体，如凝血致活酶、黑皮质素受体、CD80 和一个 Hantaviral 受体；受体的配体，如血管促生素、 αbungarotoxin，和一些大蛋白分子中的折叠区域，如 SH2、SH3 和 WW 区域。从多肽库中可分离到与天然激素相似的、与受体结合的高亲和力的多肽, 因此用完整细胞可以从多肽库中找到受体的高选择性配体。在不知道任何有关的受体和配体信息的情况下，用完整细胞和组织或动物，可筛选到特异与靶组织结合的多肽和蛋白。
一、发展简史

Dulbecco等提出了在病毒表面展示外源抗原决定簇和肽的概念。 1985年Smith — 首次利用基因工程技术将 EcoRⅠ内切酶的部分基因片段(171 bp和132 bp)与 pⅢ基因融合，获得的重组噬菌体可在体外稳定增生，表达产物能被抗EcoRⅠ内切酶抗体所识别.。 1988年Parmley — 将已知抗原决定簇与噬菌体 PⅢ N端融合呈现在其表面，并提出通过构建随机肽库可以了解抗体识别的抗原决定簇表位的设想.。 1990年McCafferty — 用噬菌体展示技术筛选溶菌酶的单链抗体成功使噬菌体展示技术进入一个广泛应用的时代。

噬菌体展示筛选抗体技术介绍

噬菌体展示筛选抗体技术介绍
探索生物医学中的创新应用
目录
01 噬菌体展示筛选抗体概述
06 噬菌体展示抗体的发展前景
02 噬菌体展示技术原理
03 噬菌体展示抗体筛选流程
0Hale Waihona Puke 噬菌体展示抗体的应用案例05 噬菌体展示抗体的优点与缺点
01 噬菌体展示筛选抗体概述
噬菌体展示筛选抗体概述
1 噬菌体展示筛选抗体技术介绍
疗效果并降低副作用。
05 噬菌体展示抗体的优点与缺点
噬菌体展示抗体的优点与缺点
噬菌体展示抗体的优势
噬菌体展示技术能够快速、高效地筛选出特异性抗体，大大缩短了实验周期，提高了研究效率。
噬菌体展示抗体的局限性
噬菌体展示技术虽然筛选速度快，但存在假阳性率高的问题，需要进一步的验证和优化。
噬菌体展示筛选抗体技术是一种利用噬菌体表面
噬菌体展示筛选抗体的优势 2 展示特定蛋白质，通过生物淘选方法寻找与目标
噬菌体展示筛选抗体技术具有高度灵活性和多样
抗原特异性结合的抗体的方法。
性，能够快速、高效地筛选到具有高亲和力和特
异性的抗体，为免疫学研究和药物开发提供了重
要工具。 3 噬菌体展示筛选抗体的应用前景
噬菌体展示抗体的优势
噬菌体展示技术具有高度灵活性和多样性，可以快速、大量地筛选出特异性强、亲和力高的抗体，为生物医学研究和药物开发提供了重要工具。
噬菌体展示抗体的应用前景
噬菌体展示抗体技术在肿瘤治疗、免疫诊断、疫苗研发等领域具有广泛应用前景，有望为人类健康事业做出重要贡献。
谢谢大家
噬菌体展示筛选抗体技术在疾病诊断、治疗和预
防等方面具有广泛的应用前景，包括癌症治疗、

噬菌体抗体库技术原理

噬菌体抗体库技术原理
嘿，朋友们！今天咱要来聊聊噬菌体抗体库技术原理，这可真的超级神奇呀！
你想想看，抗体就像是我们身体里的小战士，专门去对抗那些坏家伙。

那噬菌体呢，就像是一个个小车子。

而噬菌体抗体库技术呢，就像是给这些小车子都配上了厉害的武器！
比如说，我们可以把各种不同的抗体基因放到噬菌体里面，这就像是给小车子装上了不同功能的工具。

然后呢，让这些带着抗体基因的噬菌体们去到处闯荡！哇塞，这不就像一场盛大的冒险嘛！
当它们遇到目标的时候，就能发挥作用啦！好比有个坏细菌出现，那些有对应抗体基因的噬菌体就立刻冲上去，“嘿，你别跑！我来对付你啦！”这多酷啊！
再想想，如果我们能随心所欲地制造出各种我们想要的抗体，那能解决多少难题呀！像那些很难对付的疾病，说不定就能被这些特别的抗体给攻克掉呢！“这难道不让人兴奋吗？”
而且哦，这个技术还能不断地改进和优化，就像我们给小车子不断升级装备一样。

科学家们可以根据需要，去调整和创造出更厉害的抗体。

“这是多么有意义的事情呀！”
在这个过程中，大家都在努力探索，不断尝试。

研究者们就像一群智慧的探险家，在这个神奇的抗体世界里努力前行。

他们满怀激情地投入，只为了能让这个技术更加完美。

我觉得呀，噬菌体抗体库技术原理真的是充满了无限的可能和希望！它就像是一把神奇的钥匙，会为我们打开解决许多难题的大门！让我们一起期待它能带来更多的惊喜吧！。

基因工程抗体中噬菌体抗体库技术的应用

分子量小，具有抗原特异性，以在涉及到一些不需要并所片段效应功能的实际应用中，比完整抗体具有更多的优越性。１２２ＦｂＦｂ包括重链（的 Ⅷ 一Ｃ．．ａａＨ）Ｈ和轻链（）Ｌ的Ｖ —Ｃ，ａ有与完整抗体相同的抗原结合能力，结ＬＬＦｂ具且构稳定。但Ｆｂ是异二聚体，ａ较适于分泌表达，适于通不过包含体大量表达Ｊ。１２３二硫键稳定的Ｆ（ｉｌｄ．ａｉｚｄＦ，ＳｖＦ．．ｖｄｓｔｅｓｂｌｅｖｄＦ）ｖｕｉｔｉ是具有完全抗原结合位点的最小抗体片段，Ｈ链和Ｌ由链的可变区组成。在ＶＨ和Ｖ当部位各引入一个半Ｉ适胱氨酸，成ｄＦ，形ｓｖ由于链内二硫键远离ＣＲ，Ｄ不会干扰抗体与抗原结合Ｊ。
自从１７９５年单克隆抗体（Ａ）世以来，ＡＭｃｂ问Ｍｃｂ在临床诊断和基础研究中的应用越来越广泛。８０年代中期，着ＤＡ重组技术的进步和人们对免疫球蛋白分子随Ｎ（ｇ认识的深化，学家们将制备Ｍｃｂ的细胞工程技术Ｉ）科Ａ与生产重组分子的基因工程技术和蛋白质工程技术相结合，产生了基因工程抗体 ¨ 。９Ｊ０年代初，体库技术特抗
别是噬菌体抗体库技术问世，为抗体革命中突破性进成展，此，用噬菌体抗体库技术制备人源化、功能化、从利多高亲和力特异性基因工程抗体成为可能【。本文就基因工程抗体种类、菌体抗体库构建和应用中相关技术进噬行介绍。

噬菌体抗体库技术：靠近理想的现实

ｂｔｅｎｉｄｎｎｉｅｔａＭｃｅｎｎ．ｅｃｎｔｕｔｎｏｈｈｇｎｉｄｉｒｒｅｃｓｆ８ｉｎｅｗｅｎａｔｂｙａｄａｔｎｗｉｈｒｐｓｒｅｉｇＴｈｏｓｒｃｉｆｔｅｐａｅａｔｏｇｏｏｂｙＩａｉｓｓｉｉｔ — ｂｃ０
年代初期，Ｗｉｔｒ首次报道利用噬苗体抗体库技术在丝ｎｅ等状噬菌体表面呈示免疫小鼠脾脏Ｂ细胞的垒套抗体基因，从中筛选得劲针对ｐｏ（一ｐｅｙｏａｏ一５ｏｅ的特ｈＸ２ｈｎｌｚ￣一ｎ）ｘ异性抗体。此后，利用噬菌体呈示技术构建抗体库筛选］特异性抗体全面展开并取得巨大进展ｌｇ叫噬苗体抗体库技术包括两个内窖：先是插人到丝状噬首菌体病毒颗粒结构基因（ Ⅲ或ｇ上适当位点的外源片段，ｇ Ⅶ）即抗体可变区（区）因，一个由轻链和重链基因随机组Ｖ基是合的氓合体｝次，人的抗体可变区基因船够表达呈示于其插噬菌体表面，利用特异性抗原对呈示于噬菌体表面的蛋白进
ＡｍｔａｔＡｎｉｏｈｇｉｐａｅｈｏｏｙｉａｎｗｉｒｒｃｎｌｇｎｔｅａｅｆｇｎｎｉｅｒｎｎｉｏｉｓｉｌｒｃ：ｔｄｙｐａｅｄｓｌｙｔｃｎｌｇｓｅｌａｙｔｈｏｏｙｉｈｒａｏｅｅｅｇｎｅｉｇａｔｂｄｅｎｂｂｅｒｃｎｅｒ．ｉｔｃｎｌｇｋｓｔｅｗｏｋｔｅｐｃｆｎｉｄｒｆｉｉｎｌｙｃｍｂｎｐｃｆｉｄｎｅｅｔｙａｓＴｈｓｅｈｏｏｙｍａｅｈｒｏｇｔｓｅｉｉａｔｃｏｂｙｍｏｅｅｆｅｔｙｂｏｃｉｇｓｅｉｃｂｎｉｉｇ

免疫试题库(附答案)

免疫试题库（附答案）一、单选题（共100题，每题1分，共100分）1、制备抗血清首次与二次之间免疫接种的间隔时间通常为A、10-20dB、5-10dC、15-30dD、40-50dE、3-5d正确答案：A2、用于包被斑点金免疫层析试验载体膜质控条(线)的物质是A、人白蛋白B、胶体金颗粒C、待测抗原标准品D、胶体金标记抗体E、抗免疫金抗体正确答案：E3、噬菌体抗体库技术是利用λ噬菌体载体表达A、FcB、FabC、胸腺嘧啶核苷D、CD分子E、V-D-J正确答案：B4、免疫印迹法常用于A、补体测定B、甲胎蛋白的测定C、免疫球蛋白含量的测定D、抗HIV的确认试验E、细胞因子的测定正确答案：D5、下列细胞因子的英文缩写错误的是A、白细胞介素-ILB、肿瘤坏死因子-TNFC、干扰素-MCFD、集落刺激因子-CSFE、红细胞生成素-EPO正确答案：C6、下列成分有可能与大分子抗原结合而出现肉眼可见反应的是A、Fc段B、Fab段C、F(ab’)2段D、IgG的L链E、IgG的H链正确答案：C7、下列哪种免疫球蛋白在特应性过敏症患者血清中浓度可升高A、IgGB、IgMC、IgDD、IgAE、IgE正确答案：E8、补体不具备下列哪种作用A、溶解细胞作用B、过敏毒素作用C、中和毒素作用D、趋化作用E、调理作用正确答案：C9、慢性排斥反应的主要原因是A、CD4T细胞/巨噬细胞B、抗ABO血型抗体或HLA-Ⅰ类分子抗体C、NK细胞D、抑制细胞的活化E、对HLA抗原的耐受正确答案：A10、玻片法做ABO血型鉴定，属于A、直接凝集反应B、协同凝集反应C、间接血凝反应D、间接凝集抑制反应E、Coombs试验正确答案：A11、1分子亲和素可结合几分子生物素A、2分子B、1分子C、8分子D、3分子E、4分子正确答案：E12、能特异性刺激粒细胞集落形成单位生长的是A、EPOB、G-CSFC、M-CSFD、GM-CSFE、TPO正确答案：B13、在临床检验室内质量控制中，如果质控结果出现失控信号，下列做法正确的是A、增加质控规则，提高误差检出B、发出患者结果，不寻找原因C、增加质控的个数，提高误差检出D、寻找失控的原因，并采取一定的措施加以纠正，然后重新测定，再决定是否发出报告E、先发出患者结果，然后寻找原因正确答案：D14、获得性免疫缺陷综合征(AIDS)的病原体是A、HBVB、HCVC、HIVD、HPVE、HSV正确答案：C15、初次应答时，产生的抗体具有哪种特点A、抗体维持时间较长B、IgG与IgM几乎同时产生C、为低亲和性抗体D、抗体含量较高E、以IgG为主正确答案：A16、特异性体液免疫应答的介导细胞主要是A、T淋巴细胞B、B淋巴细胞C、巨噬细胞D、郎罕细胞E、TH1细胞正确答案：B17、ELISA双抗原夹心法检测抗体时，固相载体包被物是A、未标记的已知抗原B、未标记的已知抗体C、未标记的抗抗体D、酶标记的抗原E、酶标记的抗体正确答案：A18、类风湿性关节炎患者滑膜液中常检出的类风湿因子是A、同IgG轻链发生反应的IgMB、同IgG重链发生反应的IgMC、同细菌抗原发生反应的IgED、同胶原蛋白发生反应的IgE、同DNA发生反应的IgG正确答案：B19、不属于细胞因子生物学活性的是A、增强抗感染和细胞杀伤效应B、促进靶细胞的增殖和分化C、促进炎症过程，影响细胞代谢D、促进或抑制其他细胞因子和膜表面分子的表达E、中和及溶解病毒作用正确答案：E20、检测抗血细胞抗体主要用于检测超敏反应的类型是A、Ⅱ型B、Ⅳ型C、Ⅴ型D、Ⅰ型E、Ⅲ型正确答案：A21、关于抗核抗体下列选项中正确的是A、抗核抗体有器官特异性B、抗核抗体有种属特异性C、是以自身抗原作为靶抗原的一组自身抗体的总称D、抗核抗体泛指各种核成分的抗体E、抗核抗体只能与人的细胞核起反应正确答案：D22、人T细胞可根据下列哪个特征区别于B细胞及其它细胞A、形态B、Fc受体的存在C、胞浆颗粒的是否存在D、CD2E、Ig表面标志正确答案：D23、完全抗原的特征是A、有免疫原性，无反应原性B、无免疫原性和反应原性C、必须与载体结合才具有免疫原性D、有反应原性，无免疫原性E、有免疫原性和反应原性正确答案：E24、直接法荧光抗体技术检查抗原是将荧光素标记在A、特异性抗体B、抗补体抗体C、抗原D、抗人IgGE、补体正确答案：A25、下列免疫学测定方法中敏感性最高的是A、沉淀反应B、凝集反应C、ELISAD、放射免疫测定E、补体结合试验正确答案：D26、巨噬细胞产生的主要细胞因子是A、IL-5B、IL-1C、IL-4D、IL-10E、IL-2正确答案：B27、Percoll分离液的主要成分是A、聚蔗糖B、聚乙二醇C、聚乙烯吡咯烷酮D、经聚乙烯吡咯烷酮处理的硅胶颗粒E、泛影葡胺正确答案：D28、下列哪一项不属于粘附分子的功能A、参与体液免疫应答B、在肿瘤转移过程中发挥重要作用C、参与细胞的生长与分化D、参与细胞的信号转导E、参与细胞的伸展与移动正确答案：A29、将外毒素转变为类毒素A、可减弱毒素的毒性B、可增强毒素的免疫原性C、可增强吞噬细胞的吞噬活性D、可降低毒素的免疫原性E、可增强毒素的毒性正确答案：A30、CD4的功能是A、诱导B细胞参与免疫应答B、起正调节作用C、是HIVgp120受体D、抑制T细胞活化E、构成BCR-IgαIgβ复合体正确答案：C31、膜载体的酶免疫测定最常用的载体为A、硝酸纤维素膜B、华特曼滤纸C、分子筛D、醋酸纤维膜E、聚丙烯酰胺正确答案：A32、抗原抗体反应的特点是A、抗原抗体结合是不可逆的B、抗原抗体结合后仍可与其他抗原结合C、解离后抗体不能再与抗原结合D、解离后抗体活性和特异性不变E、解离后抗原抗体结构活性改变正确答案：D33、属于肿瘤主动生物治疗方法的是A、LAK细胞治疗B、化疗C、TIL治疗法D、接种肿瘤疫苗E、放射性核素标记mAb正确答案：D34、用针对哪一种抗原的单克隆抗体可鉴定人的Tc细胞A、CD8B、CD4C、CD3D、gh-2E、Lyt-1正确答案：A35、较长时间(4-5年)保存抗体，最好采用A、-30℃保存B、-10℃保存C、-20℃保存D、4℃保存E、真空干燥保存正确答案：E36、抗原抗体反应特点不包括A、电离性B、特异性C、比例性D、阶段性E、可逆性正确答案：A37、能帮助T细胞将TCR与抗原肽结合的信息传入细胞内的分子是A、CD2B、CD3C、CD4D、CD21E、CD19正确答案：B38、终点法散射比浊分析应保证A、抗体过量B、抗原过量C、抗原：抗体为2:1D、抗原:抗体为1：2E、抗体抗原处于最适比正确答案：A39、初次免疫应答时产生抗体的特点是A、为高亲和性抗体B、抗体效价高C、IgG为主D、以IgM为主E、持续时间长正确答案：D40、载体至少连接多少数目以上的半抗原才能有效地产生抗体A、30B、10C、50D、40E、20正确答案：E41、甲、乙两种抗原都能与某一抗体发生特异性结合反应，这两种抗原相互称为A、半抗原B、完全抗原C、TD-AgD、TI-AgE、共同抗原正确答案：E42、荧光素发射荧光属于A、电化学发光B、偏振光C、化学发光D、生物发光E、光照发光正确答案：E43、辅助性T细胞表达的CD抗原是A、CD4B、CD8C、CD19D、CD35E、CD40正确答案：A44、下列为NK细胞特有表面抗原的是A、CD2B、CD16C、CD56D、CD39E、无特异表面抗原正确答案：C45、TCR、BCR可变区基因重排的机制是A、7-12-9与7-12-9环出B、7-23-9与7-23-9环出C、7-12-9与7-23-9环出D、7-12-9与9-23-7环出E、内含子之间环出正确答案：C46、沉淀反应中如抗体过量将出现A、沉淀物增多B、后带现象C、等价带现象D、前带现象E、假阳性正确答案：D47、HLA分子中与移植免疫的关系最为重要的是A、HLA-AB、HLA-BC、HLA-CD、HLA-DRE、HLA-DP正确答案：D48、参与免疫溶血反应的成分是A、红细胞、补体B、红细胞、抗红细胞抗体、补体C、白细胞、抗白细胞抗体、补体D、红细胞、抗红细胞抗体E、抗红细胞抗体、补体正确答案：B49、肿瘤免疫学检验试图通过免疫学方法检测的物质是A、补体B、细胞因子受体C、细胞因子D、肿瘤标志物E、免疫球蛋白正确答案：D50、CD8的配体是A、MHCII类分子B、MHCI类分子C、B7D、CD28E、CD40正确答案：B51、T细胞表面不表达的分子是A、CD2B、CD3C、CD28D、CD80(B7)E、TCR正确答案：D52、HLA-I类抗原A、主要存在于B细胞、单核巨噬细胞和部分活化T细胞表面B、只能用混合淋巴细胞培养法检测，故又称LD抗原C、其重链由第6号染色体上HLA-I类基因编码D、由α和β两条糖肽链借非共价键连接组成E、为TH细胞活化的协同刺激分子正确答案：C53、常用于诊断小细胞肺癌的酶类肿瘤标志物是A、碱性磷酸酶B、乳酸脱氢酶C、神经元特异性烯醇化酶D、谷胱甘肽-S-转移酶E、酸性磷酸酶正确答案：C54、关于NK细胞错误的是A、来源于骨髓B、CP16、CD56是其特有标志C、表达TCR-CD3复合物D、大多数为CD4-CD8-E、识别CD1分子提呈的脂类或糖类抗原正确答案：B55、最先被用作免疫标记技术的标记物是A、酶B、放射性核素C、荧光素D、激素E、生物素正确答案：C56、抗原抗体反应中，何种条件形成肉眼可见的免疫复合物A、抗体显著多于抗原B、抗原略多于抗体C、抗原抗体比例适当D、抗原显著多于抗体E、抗体略多于抗原正确答案：C57、作为荧光显微镜光源不可能是A、高压汞灯B、紫外线C、氙灯D、卤素灯E、氚灯正确答案：B58、参与体液免疫应答的主要免疫细胞是A、淋巴细胞B、T细胞C、B细胞D、吞噬细胞E、粒细胞正确答案：C59、哪项不是初次应答的规律A、抗体亲和力高B、潜伏期长C、抗体水平低D、产生的抗体以IgM为主E、抗体维持时间短正确答案：A60、有关BCR和抗体描述正确的是A、1个B细胞的BCR和分泌的抗体特异性不同B、二者编码的基因相同C、不具有类别转换D、基因重排发生于免疫应答阶段E、二者可变区不同正确答案：B61、将人IgG给家兔免疫后可得到A、抗γ链抗体B、抗κ链抗体C、抗λ链抗体D、抗Fc段抗体E、以上均可正确答案：E62、艾滋病免疫学检查一般包括A、人类免疫缺陷病毒抗体和B细胞B、T细胞和B细胞C、人类免疫缺陷病毒和其他病毒抗体D、人类免疫缺陷病毒抗体和T细胞E、细菌和真菌正确答案：D63、属于被动免疫治疗的是A、TILB、应用短小棒状杆菌疫苗C、接种狂犬疫苗D、接种肿瘤疫苗E、使用卡介苗正确答案：A64、关于化学发光酶免疫分析不正确的是A、以过氧化物酶为标记酶B、加入发光剂提高敏感度和稳定性C、以邻苯二胺为底物D、化学发光剂作为酶反应底物E、是将发光系统与免疫反应相结合的技术正确答案：C65、关于特异性抗体的鉴定叙述正确的是A、抗体特异性鉴定常采用凝集反应B、抗体效价鉴定常采用单向琼脂扩散试验C、抗体效价鉴定常采用酶联免疫法D、抗体纯度鉴定常采用双向免疫扩散法E、抗体纯度鉴定常采用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法正确答案：E66、酶免疫分析技术中常用于标记的酶有A、辣根过氧化物酶和过氧化氢酶B、碱性磷酸酶和辣根过氧化物酶C、β半乳糖苷酶D、过氧化氢酶E、B和C正确答案：E67、IgE分子的哪个部位与肥大细胞膜上的相应受体结合A、Fab段B、CH2C、H链可变区D、H链恒定区E、Fc段正确答案：E68、AIDS患者的T细胞亚群检测一般会出现A、CD4↓CD4/CD8↓B、CD8↓CD4/CD8↑C、CD4↑CD4/CD8↑D、CD8↑CD4/CD8↓E、CD3↑CD4/CD8↑正确答案：A69、导致慢性移植排斥反应的主要原因是A、微生物感染B、再灌注损伤C、迟发型超敏反应D、抑制剂的应用E、局部缺血正确答案：C70、GVHR的中文全称为A、移植物抗宿主反应B、荧光偏振免疫分析C、补体依赖的细胞毒作用D、宿主抗移植物反应E、人类白细胞抗原正确答案：A71、细胞毒性T细胞的主要功能是A、辅助B细胞分化成抗体产生细胞B、放大细胞免疫应答C、促进杀伤肿瘤细胞、病毒感染细胞D、特异性溶解靶细胞E、与NK细胞协同反应正确答案：D72、检测浆膜腔积液何种肿瘤标志物有助于胰腺癌的诊断A、CEAB、AFPC、HCGD、CA199E、CA724正确答案：D73、CD8抗原存在于A、辅助性T淋巴细胞表面B、细胞毒性T淋巴细胞表面C、吞噬细胞表面D、所有成熟的T淋巴细胞表面E、B淋巴细胞表面正确答案：B74、不属于Ⅱ型变态反应的是A、新生儿溶血症B、特发性血小板减少性紫癜C、自身免疫性溶血性贫血D、输血反应E、过敏性休克正确答案：E75、关于小分子抗体的叙述，错误的是A、采用干细胞技术B、不能通过胎盘C、属基因工程抗体D、易于穿透血管和组织E、不含Fc段正确答案：A76、CD3主要分布在A、DCB、APCC、胸腺细胞D、浆细胞E、成熟T细胸正确答案：E77、属于肿瘤糖链抗原的是A、AFPB、PSAC、CEAD、CA19-9E、APT正确答案：D78、“新生儿溶血症”多发生于A、Rh+的胎儿+Rh+的母体B、Rh-的母体+Rh+的胎儿C、Rh-的胎儿+Rh+的母体D、Rh+的母体E、Rh-的母体正确答案：B79、制备单克隆抗体最常用的细胞融合剂为A、HATB、8-AGC、PEGD、PHAE、BSA正确答案：C80、补体系统被激活后形成的膜攻击复合物是A、C1-C9B、C3bBbC、C5b6789D、C4b2bE、C4b2b3b正确答案：C81、关于IRMA的说法正确的是A、反应中加入过量的标记抗原B、反应中加入定量的标记抗原C、反应中加入过量抗体D、反应中加入过量的标记抗体E、反应中加入定量的标记抗体正确答案：D82、下列哪一个HLA功能区在人类中具有相同的抗原性A、胞浆区B、HLA穿膜区C、肽结合区D、Ig样区E、以上均不是正确答案：D83、关于淋巴细胞分离的描述错误的是A、Ficoll分离液法是一种单次差速密度梯度离心的分离法B、温度可影响Ficoll分离的细胞收率C、为获得较纯的单个核细胞，需根据待分离细胞的比重调整分离液的比重D、采用贴壁黏附法分离到的淋巴细胞群中不会损失B细胞E、Percoll分离是一种连续密度梯度离心分离法，是纯化单核细胞和淋巴细胞的一种较好的方法正确答案：D84、与抗体产生有关的细胞是A、粒细胞B、NK细胞C、巨噬细胞D、Tc细胞E、红细胞正确答案：C85、不属于杂交瘤技术制备单克隆抗体的基本原理的是A、采用转基因技术B、利用代谢缺陷补救机制筛选出杂交瘤细胞C、杂交瘤保持双方秦代细胞的特性D、杂交瘤细胞可以无限增殖E、淋巴细胞产生抗体的克隆选择学说正确答案：A86、在电场作用下的加速度的单向扩散试验是A、火箭电泳B、对流免疫电泳C、免疫电泳D、免疫固定电泳E、区带电泳正确答案：A87、制作荧光抗体染色标本最关键的是A、力求保持抗原的完整性B、切片尽量薄些C、采用石蜡切片或冷冻切片法D、材料要新鲜并立即处理及时冷藏E、标本需要固定正确答案：A88、当怀疑患有性联丙种球蛋白缺乏症时应首先考虑进行A、SmIg的检测B、CD的测定C、同种血型凝集素测定D、Ig浓度测定E、特异性抗体产生能力的测定正确答案：D89、少量多次的抗毒素脱敏疗法的基本原理是A、稳定肥大细胞膜，阻止其脱颗粒B、逐步消耗肥大细胞上的IgEC、舒张平滑肌D、中和IgDE、以上都是正确答案：B90、对死疫苗叙述错误的是A、需多次接种B、注射的局部和全身反应较重C、能诱导细胞免疫形成和特异性抗体产生D、用免疫原性强的病原体灭活制成E、保存比活疫苗方便正确答案：C91、参与Ⅱ型超敏反应的细胞是A、嗜碱性粒细胞、NK细胞B、肥大细胞、巨噬细胞C、NK细胞、巨噬细胞D、嗜碱性粒细胞、巨噬细胞E、肥大细胞、NK细胞正确答案：C92、牛痘苗的发明者是A、德国BehringB、法国PasteurC、德国KochD、澳大利亚BurnetE、英国Jenner正确答案：E93、免疫对机体是A、有利也有害B、正常条件下有利，异常条件下有害C、有利的D、有利无害E、有害的正确答案：B94、乳糜泻病人与下列哪种HLA抗原呈关联A、HLA-B17B、HLA-B8C、HLA-DR2D、HLA-DR3E、HLA-B35正确答案：D95、自身抗体检测对某些自身免疫病诊断的价值正确的是A、敏感性低，特异性低B、敏感性低，特异性强C、相关性不明显D、敏感性高，特异性强E、敏感性高，特异性较低正确答案：E96、在荧光抗体技术中，常用的荧光素为A、FITCB、RB200C、TRITCD、PEE、R-RE正确答案：A97、抗原的特异性取决于A、抗原结构的复杂性B、抗原的化学组成C、抗原分子量的大小D、抗原决定簇的性质、数目及空间构型E、抗原表位的数量正确答案：D98、Ficoll 淋巴细胞分离法是一种A、连续密度梯度离心法B、差速密度梯度离心法C、离子交换层析法D、自然沉降法E、亲和层析法正确答案：B99、抗CD4单克隆抗体不可检出下列哪些细胞A、TH0B、TH1C、TcD、TDTHE、TH2正确答案：C100、ELISA操作过程中导致空白对照孔显色加深的主要原因是A、加样不准B、保温时间不准C、洗涤不彻底D、酶标抗体变性，酶脱落E、照射时间长正确答案：C。

噬菌体抗体库技术

在抗体片段如ScFv和Fab的可变区基因序列的5‘端加入细菌的信号肽
序列,抗体片段即可分泌到（ZHOU）质腔,并在那里完成折叠,成为有功能
的蛋白质分子,
3有效筛选系统的建立
传统的筛选方法使用固相化的纯化抗原,依赖噬菌体颗粒对目的抗原的
亲和力差异来获得较高亲和力的抗体,而目前,可以在体外用完整的固化哺
3.2噬菌体抗体库载体的构建
首先提取细胞的总RNA,经过RTPCR扩增可变区基因
Standard template
酶切轻链PCR产物和表达载体
二者连接,转入感受态细胞中扩增
重链的PCR产物
酶切
成为轻链库
酶切
二者按照一定比例连接
转化入感受态细胞
加入噬菌体
收集噬菌体颗粒
噬菌体总抗体库
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简单的PEG沉淀方法就足以将噬菌体与其他所有污染的细胞蛋白分开,
Apply to courseware production
2.2噬菌体展示所使用的衣壳蛋白
Standard template
次要衣壳蛋白pIII

406aa组成,5个拷贝,位于噬菌体的尾部,
由三个功能区组成：
N1穿膜区：作用于E.coli细胞膜上的TolA
有Helperphage,噬菌粒就像质粒
一样进行扩增,
包装后的噬菌体含有两种不同
来源的成分：噬菌体质粒和
Helperphage,
使用野生型辅助噬菌体会导致
噬菌体污染,使得仅有很少部分
子代噬菌体带有抗体片段,
当有噬菌质粒时,由于噬菌质粒
含有野生型M13或者f1复制起

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选

抗结核杆菌人源噬菌体单链抗体库的构建及筛选何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【摘要】目的:构建人源噬菌体展示单链抗体(ScFv)库,筛选抗结核杆菌特异性、高亲和力的ScFv.方法:从结核患者的外周血淋巴细胞中,提取RNA并通过RT-PCR扩增出VH和VL基因,并采用SOE-PCR构建ScFv基因,将其克隆入噬粒载pC ANTA B5E中,转化于大肠杆菌TG1,通过辅助噬菌体M13K07援救构建噬菌体单链抗体库.结果:初级库库容量为3.5×106,在大肠杆菌TG1中重组后得到2.6 ×106的次级抗体库.结论:成功构建噬菌体展示ScFv库并获得人源抗结核杆菌特异性ScFv,为进一步研制抗抗结核杆菌的高特异性、高亲和力的基因工程抗体奠定了基础.%Aim: To construct a human phage-displayed single-chain Fv antibody (ScFv) library and screen specific ScFv against Mycobacterium Smegmatis. Methods: The total RNA was extracted from peripheral blood lymphocytes in patients with Mycobacterium Smegmatis, first strand cDNA synthesis was performed using a cDNA synthesis kit and an oligo ( dT) -18 primer. To human immunoglobulin H chain and L chain variable region of degenerate primers, cDNA first strand as a template, were amplified H chain and L chain variable region genes. SOE-PCR method to VH and VL fragments were assembled into ScFv fragments and then cloned into pCANTAB5E ScFv vector and transformed into competent TG 1 electric bacteria by helper phage rescue M13K07 get Mycobacterium Smegmatis single chain antibody phage display library. Results: A primary library of 3.5 X 106 and a second library of 2.6 x 106 were constructed. Conclusion: The results lay a solid foundation for preparation of human engineeringantibody to Mycobacterium Smegmatis reported herein with higher affinity.【期刊名称】《湖南师范大学自然科学学报》【年(卷),期】2011(034)005【总页数】5页(P70-74)【关键词】结核杆菌;人源噬菌体单链抗体;制备及筛选【作者】何光志;田维毅;高英;王平;王文佳;王乾宇;黄高;安传伟【作者单位】贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;贵阳中医学院,中国贵阳550002;遵义医学院附属医院,中国遵义563003;贵阳中医学院,中国贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R378.91+1结核分枝杆菌(Mycobacterium Smegmatis)是引起结核病的病原菌，也称结核杆菌.可侵犯全身各器官，但以肺结核为最多见.目前全球约有20亿肺结核带菌者，现症结核患者2 000万，每年有1 000万人新发病和300万人死亡.我国结核患者人数居世界第二位，全国1/3的人口曾受到结核菌的感染［1］.噬菌体抗体库技术是抗体工程领域的最重要进展，各种小分子抗体相继产生，在疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗等多个领域有着潜在的优势.该技术具有简单易行、生产成本低、筛选容量大等优点［2］.本研究尝试利用噬菌体展示技术构建大容量天然人源性噬菌体抗体库，从中筛选出结核杆菌的人源性单链抗体(single chain Fv fragment，scFv)，为进一步研制抗结核杆菌的特异性的基因工程抗体奠定了基础.100 mL外周血来自10例康复1月的结核患者(遵义医学院附属医院检验科提供)，淋巴细胞分离液，购自上海华精生物高科技有限公司.总RNA抽提试剂盒(TRIzol.R.Total RNA Isolation.Reagent)、逆转录试剂盒(RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit)，GIBCOBRL 公司产品;DNA Purification System，Promega，公司产品;100 bp DNA Ladder，SfiⅠ和NotⅠ限制性内切酶、Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶，购自大连宝生物公司;噬菌粒载体pCANTAB-5E、辅助噬菌体M13K07、大肠杆菌E.coli TG1、HRP/抗M13单克隆抗体，Amersham公司产品;结核杆菌抗原(批号:984010)，购自上海晶莹生物制品公司. 2.1 人源抗体VH和VL基因的PCR扩增以合成的cDNA为模板，VHf和VHr引物等物质的量混合扩增VH基因，Vκf/Vκr和Vλf/Vλr不同引物等物质的量混合液扩增VL基因.VL的PCR反应条件为:95℃预变性10 min;94℃ 60 s，66℃ 30 s，72℃30 s，共30个循环;最后72℃延伸10 min.VH的退火温度为65℃，其他反应条件同VL.PCR产物经20 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定，切胶回收目的基因片段.2.2 ScFv基因的构建通过重叠延伸拼接法将VH和VL基因拼接成ScFv基因.取纯化的VH和VL基因片段经94℃ 40 s，55℃ 1 min，72℃ 1.5 min，10个循环后，加含有酶切位点的引物VHf(SfiⅠ)和VLr(NotⅠ)，94℃ 30 s，66℃45 s，72℃ 90 s，35个循环.PCR产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳鉴定并回收.2.3 噬菌体抗体库的构建将上述PCR产物ScFv纯化回收，用SfiⅠ和NotⅠ进行酶切，与经同样双酶切的表达载体pCANTAB5E用T4 DNA连接酶，电转化大肠杆菌TG1，铺SOBAG平板.用2×YTAG培养基洗脱菌落，稀释至A600=0.5，加入辅助噬菌体M13K07继续振摇1 h，离心后用2×YTAK培养基重悬后振摇过夜，次日离心收集上清，加入1/5体积的PEG/NaCl溶液，冰浴，离心，重悬沉淀即为噬菌体ScFv库，过滤后于4℃储存备用.2.4 抗体库的重组率测定、酶切鉴定和多样性分析取适量抗体库接种在20 mL 2×YT-ATK(含10 g/L Glucose，100 mg/L Amp及20 mg/L Tet)培养基中，37℃，振摇培养至A600=0.68，加入辅助噬菌体M13K07于37℃静置60 min;4℃，3 500×g离心15 min，沉淀重悬于20 mL2×YT-ATK(含100 mg/L Amp，20 mg/L Tet，70 mg/L Kan)中培养过夜;在4℃条件下，8 000×g离心15 min，上清用40 g/L PEG-8000和30 g/L NaCl沉淀，4℃，10 000×g离心30 min弃上清，离心管倒置除去PEG液;沉淀用适量的PBS 重悬，移入另一离心管，反复吹打混匀，10 000×g离心5 min，上清即为噬菌体抗体库，检测库容.用SB培养液将所制备的噬菌体抗体库进行10倍系列稀释，分别加入100 μL大肠杆菌TG1(A600=1)，室温下感染20 min，涂SOBAG平板(含100 mg/L Amp)，于37℃过夜培养，次日计数噬菌落形成个数，计算噬菌体抗体库的库容，4℃保存.从SOBAG平板上随机挑取15个单菌落，进行PCR扩增用琼脂糖凝胶电泳检测ScFv的重组情况;提取PCR鉴定为阳性单菌落的质粒，用SfiⅠ和NotⅠ进行双酶切，采用10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱;随机挑取阳性克隆，采用PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，用BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析酶切图谱.2.5 噬菌体抗体库的筛选用包被液稀释结核杆菌抗原1 μg/mL包被96孔ELISA板，100 μL/孔，含30g/L BSA的PBS封闭，PBS洗涤后，加入噬菌体抗体库100 μL，37℃温育2 h;吸去噬菌体抗体液，以PBST洗涤1次(第2轮洗涤5次，第3～5轮洗涤10次)，PBST洗涤1次，加入100 μL洗脱液［含0.1 mol/L HCl(pH2)和1 g/L BSA］，于室温静置10 min;将洗脱液稍加吹打后吸出，立即用6 μL 2 mol/L Tris中和，加入2 mL大肠杆菌E.coli TG1，37℃静置20 min，加入20 mL SB(含氨苄西林和四环素)，37℃培养2 h;加入M13K07、卡那霉素.进行5次反复淘洗，收集沉淀.特异性噬菌体抗体得到高度富集.2.6 ScFv的特异性鉴定将第5轮筛选后洗脱的噬菌体感染大肠杆菌TG1，涂于SOBAG平板，过夜培养后，随机挑选细菌菌落接种于4 mL含Amp和四环素的SOBAG培养基中，37℃振荡培养过夜;取200 μL，加至4 mL含相同抗生素的SOBAG中，37℃振荡培养2 h后加入40 μL M13K07，培养2 h;再加入Kan至70 mg/L，30℃振荡培养12～16 h离心收集上清，即为单克隆噬菌体抗体，4℃保存.将待检噬菌体抗体与等量10 g/L BSA混合，室温孵育20 min，加至经抗结核抗原包被和BSA封闭的ELISA板中，于37℃温育2 h，用PBST洗板4次，PBS洗涤2次后，以HRP标记的M13噬菌体单克隆抗体进行结合反应，TMB显色.3.1 抗体重链和轻链可变区基因的PCR扩增以提取出的RNA为模板逆转录合成cDNA第一链后，再以cDNA为模板进行PCR反应分别扩增抗体基因重链和轻链可变区.产物经10 g/L琼脂糖凝胶电泳检测，分别在300～400 bp间出现条带，结果见图1.3.2 单链抗体可变区片段(ScFv)的组装和全长扩增采用SOE-PCR的方法将抗体轻、重链可变区基因组装成ScFv片段，经10 g/L琼脂糖凝胶电泳证实，组装后的ScFv基因在700～800 bp间出现条带 (图2).3.3 抗体库的库容、重组率测定及酶切鉴定构建的初级抗体库经(库容=涂板后生长出的噬菌斑数数目/涂板菌液量/涂板菌液稀释的倍数)计算，初级库容量为3.5×106.随机挑取20个菌落，经PCR鉴定表明，重组率为80%，故次级库的库容量为2.6×106;阳性质粒做双酶切鉴定，电泳示在700～800 bp间出现条带(图3).3.4 抗体库的多样性随机挑取的10个单克隆，经PCR扩增ScFv基因片段，电泳回收后，以BstNⅠ酶切，10 g/L琼脂糖凝胶电泳分析显示，抗体库中抗体分子的多样性良好，见图4.3.5 噬菌体抗体库的筛选将抗结核杆菌抗原噬菌体抗体库进行5轮“吸附-洗脱-扩增”的筛选.可以看到随着洗涤次数的增加，噬菌体抗体的收获率增加，经过5轮筛选增加约110倍，表明噬菌体抗体库得到富集(见表1).3.6 噬菌体ScFv特异性的初步鉴定从第5轮筛选得到的菌落中随机挑选20个克隆，制备噬菌体抗体，经ELISA检测，阳性克隆孔中液体显色，阴性孔中液体不变色.显色后，阴性对照孔450 nm时A值为0.076，15株ELISA的A值较高，呈现阳性反应，其450 nm时A值分布于0.256～0.532之间，阳性克隆检出率约为75%.对其中12号阳性克隆的可变区DNA序列和氨基酸进行分析，结果该克隆重链可变区与GenBank中登录的免疫球蛋白IgG重链可变区VH3有92%同源性，κ可变区与V-J4有92%同源性.表明12号阳性克隆为抗结核杆菌抗原噬菌体抗体.噬菌体抗体库技术是采用PCR的方法将B细胞全套可变区基因克隆出来，与噬菌体包膜蛋白融合表达，从而展示于噬菌体表面，即可建成噬菌体抗体库.ScFv的基本结构为VH-Linker-VL或VL-Linker-VH，由于ScFv抗体分子量只有全抗体的1/6，抗体只有可变区片段，不含恒定区，免疫原性较低，故易于穿过血管壁和组织屏障，没有Fc段，所以减少了与组织的非特异性结合，同时保留了与抗原结合的特异性和亲和性，具有结构简单，易于大规模生产，成本低等优点，因此在临床、科研、工业和新药设计等领域均具有诱人的应用前景［4-6］.ScFv抗体在感染性疾病的诊断与防治、自身免疫性疾病与病毒性疾病的鉴别研究、肿瘤的影像分析和导向治疗或基因治疗、新型药物设计等多个领域发挥着越来越重要的作用［7-13］.目前，在多种噬菌体抗体库的构建，并从其中筛选出多株具功能活性的小分子抗体，如抗HBV、HIV、RSV、TNF、erbBZ和gpl20等单链抗体或Fab抗体［14-17］，有些已进入了临床I/II期试验.人源抗体的问世彻底解决了小分子抗体的人源化问题，极大地推动了人源抗体的研究及应用［18-20］.抗体重链可变区(VH)和轻链可变区(VL)基因由相对保守的骨架区和能够根据不同抗原做出相应变化的抗体互补决定区(CDR)组成，虽然抗体分子可变区有着数量巨大的多样性，但其骨架区的序列和前导序列相对保守，所以抗体可变区PCR引物的设计应可能考虑亲本抗体可变区序列的完整性和真实性.库容量大小影响抗体库质量的最主要因素，而基因的多样性是决定库容量大小，其直接决定了接下来筛选高亲和力的单链抗体［21］.因为淋巴细胞含目的抗体基因的mRNA是高丰度，有利于所建文库被筛选及克隆出高亲和力的抗体，所以选用淋巴细胞建库较好［3］.本研究扩增设计可变区引物时引用路艳等的工作［3］，通过提取患者康复后的外周淋巴细胞总RNA，经RT-PCR分别扩增出H链和L链可变区基因，将VH和VL片段随机拼接成ScFv片段克隆至pCANTAB5E载体，并转化至感受态TG1菌，经辅助噬菌体M13K07拯救，获得人源抗结核杆菌噬菌体展示单链抗体库，本研究为结核病的预防、诊断、治疗等研究奠定了基础.此研究为结核临床防治研究奠定了基础.【相关文献】［1］吴虢东，王玲.抗结核中药的研究进展［J］.医学综述，2007，13(6):475-476.［2］李菁，林彤，宋帅，等.基因工程重组抗体技术的研究进展［J］.生物技术通报，2009(10):40-44.［3］路艳，韩跃武，韩亚萍，等.抗白念珠菌人源性单链抗体库的构建及筛选［J］.中国生物制品学杂志，2009，22(11):1063-1067.［4］HUSTON J S，LEVINSON D，MUDGET-HUNTER M，et al.Protein engineering of antibody binding sites:recovery of specificactivity in an anti-digoxin single-chain Fv analogue produced in Escherichia coli［J］.Porc Natl Acad Sci USA，1988，85(16):5879-5883.［5］WHITLOW M，BELL B A，FENG S L，et al.An improved linker for single-chain Fv with reduced aggregation and enhanced proteolytic stability［J］.Protein Eng，1993，6(8):989-995.［6］BETTERr M，CHANG C P，ROBINSON R，et al.Escherichia coil secretion of an active chimeric antibody fragment［J］.Science，1988，240(4855):1041-1043.［7］WINTER G.Synthetic human antibodies and a strategy for protein engineering ［J］.FEBS Lett，1998，430:92-94.［8］SHAHEEN F，DUAN L，ZHU M，et al.Targeting human immunodeficiency virus type 1 reverse transcriptase by intracellular expression of single-chain variable fragments to inhibit early stages of the viral life cycle ［J］.J Virol，1996，70(6):3392-3400.［9］ANN C，COLLIER M，ROBERT W，et al.Treatment of human immunodeficiency virus infection with saquinavir，zidovudine，and zalcitabine［J］.New Engl J Med，1996，334(16):1011-1077.［10］FINNERN R，BYE J M，DOLMAN K M，et al.Molecular characteristics of anti-self antibody fragments against neutrophil cytoplasmic antigens from human V gene phage display libraries［J］.Clin Exp Immunol，1995，102(3):566-574.［11］HUDSON P J.Recombinant antibody constructs in cancer therapy［J］.Curr Opin Immunol，1999，11(5):548-557.［12］WU A M，WILLIAMS L E，ZIERAN L，et al.Targeted gene delivery to mammalian cells by filamentous bacteriophage［J］.Tumor Targeting，1999，49(1):47-54.［13］FITZGERALD K，HOLLIGER P，WINTER G.Improved tumour targeting by disulphide stabilized diabodies expressed in pichia pastoris［J］.J Mol Biol，1999，288:203-211. ［14］ZEBEDEE S L，BARBAS C F，HOM Y L，et al.Human combinatorial antibody libraries to hepatitis B surface antigen［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1992，89:3175-3179. ［15］CAI X，GAREN A.Anti-melanoma antibodies from melanoma patients immunized with genetically modified autologous tumor cells:selection of specific antibodies from single-chain Fv fusion phage libraries［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92:6537-6541. ［16］HOOGENBOOM H R，BRUÏNE A P，HUFTON S E，et al.Antibody phage displaytechnology and its applications［J］.Immunotechnology，1998，4(1):1-20.［17］季永镛.免疫学进展学术讨论——抗体工程及其应用［J］.上海免疫学杂志，1997，17(2):126-129.［18］陈竞华，王淡，刘群英，等.人源噬菌体抗体库的构建及HBsAg人单抗的筛选［J］.中华微生物和免疫学杂志，1995，15(3):155-162.［19］章美云，孔健.人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选［J］.生物化学与生物物理进展，1996，23(5):470-474.［20］TRISTAN J，VAUGHAN，JANE K，et al.Human antibodies by design［J］.Nat Bio Technol，1998(16):535.［21］田学军，寿成超，董志伟.人源噬菌体抗体库的构建及抗8YG抗体的初步筛选分析［J］.中国生物化学与分子生物学报，2000，16(2):200-205.。

ScFv噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用

・综述・ScFv 噬菌体抗体库技术研究进展及其在寄生虫学上的应用侯俊然　何蔼　詹希美摘要　随着蛋白组学时代的到来,对目的抗体的需求量的增加,噬菌体抗体库技术获得抗体的优越性得到充分发挥。

该文主要介绍噬菌体抗体库技术的重要一种ScFv (单链抗体)噬菌体抗体库技术。

从理想ScFv 噬菌体抗体库的构建、可溶性表达、液体和固体筛选的优缺点及其在寄生虫学的应用等几个方面对此技术的研究进展作一综述。

关键词　噬菌体抗体库;可溶性表达;筛选;ScFv作者单位:510080广州,中山大学基础医学院寄生虫学教研室E 2mail :houjunran2003@ 电话:020********* 单链抗体(single 2chain antibody fragment ,ScFv ),仅为完整抗体的六分之一,相对分子质量(Mr )约为27000,由轻链可变区(vl )和重链可变区(vh )之间通过14～15个氨基酸的弹性小肽连接形成,具有许多优点:体积小,免疫原性低,不易引起人体排斥反应;无Fc 段,不易与具有Fc 受体的非靶细胞结合,成像清晰;渗透性好,能有效穿透致密的组织屏障;易于基因操作和基因工程大量生产。

在诊断和治疗方面有广泛的应用前景,将成为基因工程抗体技术的重要方法之一。

1　ScFv 噬菌体抗体库的技术流程从有关的细胞(免疫脾细胞、淋巴结细胞、外周血淋巴细胞等)克隆出抗体可变区Ig G ,设计引物,利用PCR 扩增出轻链可变区(vl )和重链可变区(vh ),用一段弹性连接肽将其连接,构成单链抗体ScFv 。

重组到噬菌体表达载体中,感染宿主菌,通过与噬菌体外壳蛋白形成融合蛋白,把单链抗体ScFv 表达在噬菌体表面,利用特异性抗原进行筛选,并重复筛选过程,达到抗体的富集。

2　ScFv 噬菌体抗体库技术2.1　理想ScFv 噬菌体抗体库的构建Okamoto[1]认为理想ScFv 噬菌体抗体库是包含所有抗体可变区的功能位点,包含所有抗体组合形式,抗体多样性最大。

噬菌体抗体库技术及其应用研究进展

［Ａｂｓｔｒａｃｔ］Ｐｈａｇｅ－ｄｉｓｐｌａｙｅｄａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙｉｓａｎｅｗｔｈｃｈｎｉｑｕｅｗｈｉｃｈｈａｓｂｅｅｎｄｅｖｅｌｏｐｅｄｖｅｒｙｒａｐｉｄｌｙａｎｄｌｅａｄｓ
ｔｏｒｅｖｏｌｕｔｉｏｎｉｎｔｈｅａｒｅａｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇｉｎｒｅｃｅｎｔｙｅａｒｓ．Ｔｈｉｓｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙｅｍｐｌｏｙｅｓａｎｕｎｉｑｕｅｓｙｓｔｅｍｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｏｎａｎｄｓｃｒｅｅｎｉｎｇ，ａｎｄｃｈａｎｇｅｓｔｈｅｃｌａｓｓｉｃａｌｍｅｔｈｏｄｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｃｏｍｐｌｅｔｅｌｙ．Ｉｔｐｒｏ— ｍｏｔｅｓａｎｔｉｂｏｄｙｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，ｉｎｔｏａｎｅｗｄｅｖｅｌｏｐｉｎｇｓｔａｇｅａｎｄｉｍｐｒｏｖｅｓｍａｎｙｏｔｈｅｒｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓｉｎｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｆｉｅｌｄｓ．Ｓｏｆａｒｐｈａｇｅａｎｔｉｂｏｄｙｌｉｂｒａｒｙｉｓｔｈｅｍｏｓｔｄｅｖｅｌｏｐｅｄａｎｄｗｉｄｅｌｙａｐｐｌｉｅｄｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｎｔｈｅｆｉｅｌｄｏｆａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａ— ｔｉｏｎ．Ｉｎｔｈｉｓｒｅｖｉｅｗ，ｗｅｆｏｃｕｓｅｄｏｎｔｈｅｐｒｏｇｒｅｓｓｏｆｔｈｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．
ＰＡＮＢｏ２，ＴＯＮＧＹｉ－Ｇａｎｇｊ
１．ＳｔａｔｅＫｅｙＬａｂｏｒａｔｏｒｙｏｆＰａｔｈｏｇｅｎａｎｄＢｉｏｓｅｃｕｒｉｔｙ，ＢｅｉｊｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙａｎｄＥｐｉｄｅｍｉｏｌｏｇｙ，Ｂｅｉｊｉｎｇ

抗体库筛选技术介绍

抗体库筛选技术介绍导读自从噬菌体展示技术于1985年创立以来，细胞生物学、免疫学、蛋白质工程以及医药行业等领域深受影响。

它从根本上了改变了传统的单抗制备流程（杂交瘤技间接术），宣告在体外改良抗体的特异性以及进行亲和力成熟。

随着该技术的不断发展，继而出现了核糖体展示、mRNA展示、细菌展示和酵母展示等多种展示技术。

这篇文章主要以噬菌体展示抗体库为例，来介绍抗体库的筛选技术。

抗体库的筛选是指从抗体库中筛选出针对某一抗原的特异性抗体，是获得高亲和力抗体过程中的关键环节。

那什么是抗体库呢？通过PCR和DNA重组技术克隆人类或者动物体内全套抗体可变区基因（关于抗体的具体结构详见抗体的基本结构），并通过展示技术进行表达，得到的全套抗体基因表达文库即为抗体库。

图1、抗体库克隆的抗体基因片段（SCFV）图2、噬菌体展示抗体库构建流程由于单抗性质的千差万别，抗体库的筛选需要根据不同的单抗制定严格的筛选条件，优化筛选方法，因此抗体库的筛选技术一直处于发展和改进的状态，根据出现时间的先后，主要分为经典筛选法和新型筛选法。

1、经典筛选法经典筛选法主要包括固相筛选法和液相筛选法，适合针对性质明确并且可纯化的抗原进行抗体筛选。

固相筛选法是通过包被在酶标板或者免疫试管等固相介质上的抗原富集高亲和性的噬菌体；液相筛选法是将生物素化的抗原包被在与亲和素偶联的磁珠或琼脂糖上，通过磁珠富集能与抗原特异性结合的噬菌体抗体，再通过洗涤、洗脱、回收等步骤。

如此反复筛选数次，可得到高亲和性的噬菌体。

这两种方法可通过添加脱脂牛奶或者BSA来减少非特异性结合。

2、新型筛选法对于抗原无法提纯或者性质不明确的情况（如癌细胞表面受体），或者经典筛选过程可能造成抗原失活的情况，需要开发新的筛选方法。

目前的新型筛选法主要有细胞筛选法、组织切片或体内筛选法、选择感染筛选法和蛋白质芯片筛选法等。

细胞筛选法：细胞筛选能维持抗原和抗体的天然构象，因此在对肿瘤细胞筛选方面应用较多，该技术还适合于细胞表面受体筛选和抗原鉴定等。

噬菌体抗体库技术

２００５年第４０卷第１体抗体库技术＊
马小兵１，２＊＊畅继武２
（１华北煤炭医学院病理教研室天津２天津医科大学天津市泌尿外科研究所天津３００２１１）
摘要噬菌体抗体库技术是指从人外周血、脾或骨髓淋巴细胞提取总ＲＮＡ，利用逆转录－多聚酶链反应（ＲＴ－ＰＣＲ）方法扩增抗体的全套可变区基因，通过噬菌体表面展示技术，把抗体Ｆａｂ段或单链抗体表达在噬菌体表面，构建人源抗体库。噬菌体抗体将基因型（ｇｅｎｏｔｙｐｅ）和表型（ｐｈｅｎｏｔｙｐｅ）统一于一体，将选择能力和扩增能力偶联起来，具有强大的筛选能力，能够在体外模拟体内的抗体生成过程，使抗体工程技术进入了一个新的时代。
噬菌体抗体库技术的产生取决于３项实验技术的发展：１）ＰＣＲ技术的发展使人们可以用一组引物（免疫球蛋白可变区中骨架部分的保守序列），通过ＲＴ－ＰＣＲ直接从总ＲＮＡ克隆出全套免疫球蛋白可变区基因。２）大肠杆菌可以将有抗体活性的免疫球蛋白分子片段分泌入周质腔（ｔｈｅｐｅｒｉｐｌａｓｍｉｃｓｐａｃｅ）。３）噬菌体展示技术的建立，即将抗体基因插入到丝状噬菌体衣壳蛋白基因中，使抗体基因对应的表达产物融合在噬菌体衣壳蛋白中形成融合蛋白，呈现在噬菌体表面，形成含有全套抗体谱（ｒｅｐｅｒｔｏｉｒｅ）的噬菌体抗体库，进而经亲和富集法筛选表达有特异活性的抗体，是噬菌体抗体库技术的核心。２丝状噬菌体（ｆｉｌａｍｅｎｔｏｕｓｐｈａｇｅ）的生物学特征

噬菌体展示技术的原理及应用

二、噬菌体展示技术旳应用现状
抗体：抗狂犬病毒旳单链抗体，抗HIV-1囊膜糖蛋白旳单链抗体，此抗体可专一性杀死被HIV-1感染并体现有gp120旳淋巴细胞, 中和响尾蛇毒素旳单链抗，等等。
疫苗：展示在噬菌体表面旳HIV-1 旳gp120-V3 环可象天然抗原一样引起明显旳免疫应答, 等等。
噬菌体抗体库旳构建
Antibody IgG structure
Antibody IgG structure
C
L
V
L
V
H
C
H
1
V
L
C
L
V
H
C
H
1
C
H
2
C
H
2
C
H
3
C
H
3
Antibody IgG structure
Hinge
(Fab’)2
Fab
Fc
MembraneExtension
Antibody IgG structure
选择措施：淘选（Panning)而不是筛选（Screening)
非展示系统展示系统
Solid phase selection with immunotubes
B
B
B
B
B
B
Immunotubecoated withantigen
诊疗被动免疫抗体蛋白质构造分析药物导航蛋白质纯化
Wash to remove unbound phage particles.
Elute bound phage
Amplify eluted phageRepeat selectionAnalyze a) ELISA b) Specificity c) Sequencing d) Affinity e) Activity

噬菌体抗体库技术及其应用_吴懿娜

[9]Wo l f M ,A l b r e c h t S ,M är k i C ,e t a l .P r o t e o l y t i c p r o c e s s i n g o f c h e m o -k i n e s :i m p l i c a t i o n si np h y s i o l o g i c a l a n dp a t h o l o g i c a l c o n d i t i o n s [J ].I n t J B i o c h e m C e l l B i o l ,2008,40(6-7):1185-1198.[10]M c Q u i b b a nG A ,G o n g J H ,T a mE M ,e t a l .I n f l a m m a t i o n d a m p e n e db y g e l a t i n a s e Ac l e a v a g e o f m o n o c y t ec h e m o a t t r a c t a n t p r o t e i n -3[J ].S c i e n c e ,2000,289(5482):1202-1206.[11]We b e r M ,B l a i r E ,S i m p s o nC V ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o r D 6c o n s t i t u t i v e l yt r a f f i c s t o a n df r o m t h ec e l l s u r f a c et oi n t e r n a l i z ea nd de g r a d e c h e m o k i n e s [J ].M o l B i o l C e l l ,2004,15(5):2492-2508.[12]G r a h a m G J .D 6a n dt h ea t y p i c a l c h e m o k i n er e c e p t o r f a m i l y :n o v e lr e g u l a t o r s o f i m m u n ea n di n f l a m m a t o r y p r o c e s s e s [J ].E u r J I m m u -n o l ,2009,39(2):342-351.[13]B o n e c c h i R ,B o r r o n i E M,A n s e l m o A ,e t a l .R e g u l a t i o no f D 6c h e -m o k i n e s c a v e n g i n g [J ].B l o o d ,2008,112(3):493-503.[14]G r a h a mG J ,M c K i m m i e C S .C h e m o k i n e s c a v e n g i n g b y D 6:am o v a -b l e f e a s t ?[J ].T r e n d s I m m u n o l ,2006,27(8):381-386.[15]M a r t i n e z d e l a T o r r e Y ,L o c a t i M ,B u r a c c h i C ,e t a l .I n c r e a s e di n -f l a m m a t i o ni nm i c ed e f i c i e n t f o rt h ec h e m o k i n ed e c o yr e c e p t o r D 6[J ].E u r J I m m u n o l ,2005,35(5):1342-1346.[16]J a m i e s o nT ,C o o k D N ,N i b b s R J ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o r D 6l i m i t s t h e i n f l a m m a t o r y r e s p o n s e i nv i v o [J ].N a t I m m u n o l ,2005,6(4):403-411.[17]Wh i t e h e a d G S ,Wa n g T ,D e G r a f f L M ,e t a l .T h e c h e m o k i n e r e c e p t o rD 6h a s o p p o s i n g e f f e c t s o na l l e r g i c i n f l a m m a t i o na n d a i r w a y r e a c t i v i t y [J ].A mJ R e s p i r C r i t C a r e M e d ,2007,175(3):243-249.[18]L i uL ,G r a h a mG J ,D a m o d a r a nA ,e t a l .C u t t i n ge d g e :T h es i l e n tc h e m o k i n e r e c e p t o r D 6i s r e q u i r ed f o r ge n e r a t i n g Tc e l l r e s p o n s e s t h a t m e d i a t e e x p e r i m e n t a l a u t o i m m u n e e n c e p h a l o m y e l i t i s [J ].J I m m u n o l ,2006,177(1):17-21.[19]D 'A m i c oG ,F r a s c a r o l i G ,B i a n c h i G ,e t a l .U n c o u p l i n go f i n f l a m -m a t o r y c h e m o k i n e r e c e p t o r s b y I L -10:g e n e r a t i o n o f f u n c t i o n a l d e c o y s [J ].N a t I m m u n o l ,2000,1(5):387-391.[20]A r i e l A ,F r e d m a nG ,S u nY P ,e t a l .A p o p t o t i cn e u t r o p h i l sa n dTc e l l ss e q u e s t e r c h e m o k i n e sd u r i n g i m m u ne r e s p o n s e r e s o l u t i o n t h r o u g h m o d u l a t i o nof C C R 5e x p r e s s i o n [J ].N a t I m m u n o l ,2006,7(11):1209-1216.文章编号:1007-8738(2010)04-0404-03噬菌体抗体库技术及其应用吴懿娜,杜欣军,张伟伟,董　峰,王　硕＊(天津科技大学食品工程与生物技术学院食品营养与安全省部共建教育部重点实验室,天津300457)收稿日期:2009-11-23;　接受日期:2010-01-05基金项目:国家高技术研究发展计划(863)资助项目(2006A A 10Z 448);国家自然科学基金资助项目(20905058)作者简介:吴懿娜(1985-),女,天津人,硕士E -m a i l :y n w u 517@y a h o o .c o m .c n[关键词]噬菌体展示;抗体库;小分子物质[中图分类号]Q 789 [文献标识码]A 目前,抗体在在临床医学研究和食品环境安全检测等方面应用广泛,随着分子生物学的不断发展,利用基因工程手段获得基因工程抗体的方法成为抗体技术研究的热点,自从S m i t h 于1985年第一次成功地将E c o R Ⅰ核酸内切酶基因插入丝状噬菌体基因p Ⅲ中,并在噬菌体表面表达出了融合的蛋白,及1990年M c C a f f e r t y 等又在此基础上构建了库容为106的抗体库,并从中成功地筛选出了溶菌酶单链抗体后,噬菌体抗体库技术成为了抗体工程中的一种新兴的抗体制备的手段。

噬菌体抗体库原理

噬菌体抗体库原理：
该技术以噬菌体为载体,将抗体基因与噬菌体编码的外壳蛋白III或外壳蛋白VIII 相连,在噬菌体表面以抗体外壳蛋白融合蛋白的形式表达;经辅助病毒感染后,借助CPIII的信号肽穿膜作用,进入宿主细胞的外周基质,在正确折叠后被包装于噬菌体尾部,随后携带有表达载体的宿主菌就会释放出带有抗体片段噬菌体颗粒,可以特异识别抗原,又能感染宿主进行在扩增.因此可以采用类似于亲和色谱原理从噬菌体抗体库中筛选出特异性抗体。