免疫组化结果判断及常见问题分析

K-ras 免疫组化结果判断及常见问题分析
VEGF
附：定量分析——图象处理系 统
1、图象处理：
利用仪器按照不同的目的进行图象的修正、变换、 特征提取和测量。 1）“狭义”指消除图象的模糊不清部分，校正 畸变。 2）“广义”包括对图象的结构分析，提取特征 进行测量。
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2、图象处理系统组成
非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分 内源性过氧化物酶
内源性生物素 电荷吸附 抗体不纯
切片制片不当 加试剂后切片干燥
对策 每步冲洗3×5min
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
非免疫动物血清封闭 采用单克隆抗体 改善取材和制片 防止切片干燥
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灶状着色：机械原因着色
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全片着色
Cyclin D1 套细胞淋巴瘤
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全片着色
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边缘着色
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“阴阳脸”着 色
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气泡
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取5个视野，测100个阳性 细胞的平均光密度即为此 4-day CM 片的阳性强度。
PCNA
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S-P×400 S-P×400
阳性细胞百分比
计数100个瘤细胞，其中 阳性细胞的比例：
＜5%
（－）
5%~30% （＋）
30%~50% （ ＋ ＋ ）
＞50%
（＋＋＋）
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P53
Barnes法
A：瘤细胞显色有无及深浅 0（不着色） 1（浅黄色） 2（棕黄色） 3（棕褐色）
B：显色细胞的比例 1（1%~10%） 2（11%~50%） 3（51%~80%） 4（＞80%）
评分=A×B 0分：阴性 1~4分：弱阳性 ＞4分：强阳性
PCNA
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阳性面积百分比
二、染色结果的判断
编号 1 2 3 4 5
阳性片 － ＋ － ＋ ＋
待检片 － ＋ ＋ － ＋
阴性对照 － ＋ － － －
结论 操作失误，抗体失效
非特异性着色 阳性片不含靶抗原 待检片不含定位抗原 待检片含定位抗原
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三、结果分析
1-day CM
阳性强度 20×10视野下，随机选
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吞噬细胞内 含铁血黄素
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坏死组织着色：AE1/AE3
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坏死组织着色
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交叉反应：乳腺ki-67组织细胞胞浆着色
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黑色素瘤，细胞内含黑色素，呈紫黑色，HE染色
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肝脏：CK8理想着色，胆管上皮细胞强阳性， 肝细胞呈不同层次阳性。
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pan CK（AE1/AE3） 在肝脏理想的染色，采用了热修复。 肝细胞膜、胆管强而清晰的着色。背景干净。
40×10视野，选取5个视野，计算阳性区域面积占整个参考 面积的百分率。
胶原染色
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Weidner法（MVD计数）
1. 孤立的棕黄色细胞族代表一条 微血管。
2. 低倍镜下找到组织内密度最高 区域。
3. 40×10视野下计数微血管数目 。
CD34
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改善取材和制片
加试剂后切片干燥
防止切片干燥
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内源性生物素—肾小管
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内源性生物素—淋巴结转移性甲状腺腺癌
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蜕膜组织部分胞核PR阳性，血管内红细胞过氧化物酶显色
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嗜酸性粒细胞中细胞色素显色
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四、免疫组化异常着色及对策
1.非特异性着色及其对策
非特异性着色原因 操作过程冲洗不充分
对策 每步冲洗3×5min
内源性过氧化物酶 内源性生物素
3％H2O2封闭 使用生物素阻断试剂盒阻断
电荷吸附
非免疫动物血清封闭
抗体不纯
采用单克隆抗体
切片制片不当
合格的免疫组化染色切片 是正确判断染色结果的基础和前提 不合格的免疫组化染色切片 容易导致误判
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C-erbB-2
优
中
良
差
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ER
4
2
3
1
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PR
子宫内膜PR染色，修复不足
子宫内膜PR染色，修复良好
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4.颗粒性显色 DAB显色在高倍镜下呈颗粒状而非均匀着色。
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免疫组化标准化照片 CK10 ER CD44v6
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无信号片
CD30
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2. 染色的假阴性及其对策
染色假阴性原因
组织处理不当（固定、浸蜡） 一抗与二抗种属连接错误 抗体失效 显色系统不相适配 操作不当，遗漏重要步骤
图象输入（显微镜、扫描仪） 图象处理运算（病理图文分析软件） 图象、数据输出
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3、图象处理系统功能
几何形态学定量分析 细胞核、浆的大小、面积、核浆比； 细胞分布密度、个数； 血管、腺 体的面积、密度；间质的面积 免疫组织化学分析 按着色灰度分类，计算阳性、阴性细胞的面积含量 DNA倍体分析 计算正常细胞及肿瘤细胞DNA 含量，给出倍体参数、DNA参数分布直 方图 AgNOR分析 颗粒分析：数目、大小、面积、比例
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一、特异性染色的判断
1.特定的定位 细胞阳性——根据靶抗原不同而呈现胞膜型、胞浆型 或胞核型 间质阳性——表现为细胞外着色，局限性或弥散性
2.染色的不均一性 阳性细胞的染色分布不均，片状或点状散在分布 染色强弱不等，颜色深浅反映抗原量的多少
3.排除人为造成的非特异性染色 切片的折叠、刀痕，色素沉着，组织细胞坏死。