分子微生物学实验

2.2 分子微生物学方法

2.2.1主要试剂

用于PCR扩增的全套试剂、IPTG、Agarose和X-gal (日本TakaRa公司);

蛋白胨、酵母粉(Difico公司产品)；

柱离心式小量细菌基因组DNA抽提试剂盒(上海华舜公司)；

DNA纯化通用试剂盒(鹭隆生物有限公司)；

其它试剂为国产分析纯(上海生工)。

2.2.2 PCR引物

Eubae 34Lf[65] 5′- TACGGGAGGCAGCAG-3′

Eubae 517R[65]5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′

Eubae 34lF-GC[65]5′-CGCCCGCCGCGCGCGGCGGGCGGGGCG GGGGCACGGGGGGCCTACGGGAGGCAGCAG-3′

RV-M 5′-GAGCGGATAACAATTTCACACAGG-3′

M13-47 5′-CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3′

引物由日本TakaRa公司合成。

2.2.3主要培养基

1)LB培养基：

NaCl10 g，胰蛋白胨(Tryptone)10 g，酵母提取物(Yeast Extract)5 g，

琼脂粉10 g(固体培养基)，pH为7.0~7.2，去离子水定容到1 L。

2)LB-Amp培养基：

LB培养基灭菌后，冷却到50 ℃，加入氨苄青霉素至终浓度为100 μg·mL-1。

2.2.4菌株与质粒

感受态细胞Ecoli DH5α(日本TaKaRa公司)

测序载体pMD19-T(日本TaKaRa公司)

2.2.5分析软件

DNAMAN 6.0同源性比较，格式转化，寻找阅读框等

DNAstar DNA5.1序列分析处理，氨基酸序列的解析等

Mega 4.0 16S rRNA基因系统发育分析

Quantity One4.6.2DGGE图像处理与图谱分析

Biodap 数据统计及相关性分析

2.2.6主要仪器

实验所用的设备和仪器如表2.3所列：

表2.3实验主要仪器和设备

Tabel2.3The main equipments and machines

序号仪器型号生产公司

1 恒温振荡器SHZ-8

2 常州国华电器有限公司

2 数显恒温水浴锅HH-2 常州国华电器有限公司

3 洁净工作台SDJ-ZS 上海淀山湖净化设备厂

4 柜式恒温冷冻摇床HQL300 中国科学院武汉科学仪器厂

5 生化培养箱DYX-250S-C 科力仪器

6 生化培养箱LRH-250A 广东省医疗器械厂

7 冷冻离心机universal 32R Hettichzentrifugen，Germany

8 微型旋涡混合仪WH-1 上海泸西分析仪器厂

9 PCR仪T-Gradient Biometra，Germany

10 电泳仪EPS-100 Tanon天能科技（上海）有限公司

11 紫外分析仪UV-2000 Tanon天能科技（上海）有限公司

12 凝胶成像分析系统GIS-2008 Tanon天能科技（上海）有限公司

13 电子分析天平AL104 Mettler Toledo仪器（上海）有限公

司

14 手提式紫外分析仪ZFP 上海长明光学仪器厂

15 DGGE system DCocde TM Bio-Rad，USA

2.2.7实验方法

2.2.7.1 细菌基因组总DNA的提取与纯化

采用上海华舜公司小量细菌基因组提取试剂盒，具体步骤如下：

1)细菌的消化：

将1.0~2.0mL过夜活性污泥样离心30秒，彻底弃上清。在污泥沉淀中加入40μLDB液，160μL Lysozyme和8μLRNase A。彻底振荡悬浮。37℃温浴30分钟，期间来回颠倒离心管数次。

2)加入200μL DLT液和25 μL Proteinase K，迅速振荡混匀。置55℃温浴至少30分钟，期间来回颠倒离心管数次。移至室温冷却后，以>12,000rmp离心3分钟。

3)将上清全部移入预先加入了200 μL无水乙醇的离心管中，混匀后全部移入吸附柱中，9000rmp离心1分钟。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中。

4)加入500 μLSW液，静置1分钟后，离心1分钟。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中。

5)加入600μL WGP液，离心1分钟。倒掉收集管内液体，将吸附柱放回收集管中。

6)加入250 μLWGP液，离心2分钟。

7)将吸附柱移入一个 1.5 mL离心管中。在吸附膜中央加入200 μL的T1(2mMTris)液，55 ℃静置5分钟，离心2分钟，将DNA轻微混匀，-20℃保存。

2.2.7.2 细菌基因组总DNA的PCR

样品细菌基因组总DNA的PCR扩增，50 μL体系：

10×缓冲液(不含Mg2 +)5 μL

dNTP(10 mmol·L-1) 1 μL

引物341F、517R(10μmol·L-1)各2.5 μL

Mg2+ (25 mmol·L-1) 2.5 μL

普通Taq DNA聚合酶2.5 U

BSA(牛血清白蛋白1mg·mL-1)5 μL

DNA模板100 ng

ddH2O 补至50 μL

PCR 扩增条件为：

1.预变性94℃5min

2.变形94℃1min

3.退火55℃45 s

4.延伸72℃1min

5.重复回到2，30个循环

6.延伸72℃10min

7.保存4℃保存

2.2.7.3 DGGE的操作步骤

聚丙烯酰胺(PAGE)胶浓度为8%(w/v)，变性梯度为40%~60%(100%的变性剂包括42 g的尿素和40 mL的甲酰胺)。