芥子油苷测定方法

高效液相色谱对芥子油苷的提取和分离

I 准备阶段：

1. 水浴锅设置80℃

2.配制两瓶70%的甲醇，其中一瓶置于水浴锅中温浴。

3.5mM苄基芥子油苷.2.33mg/ml

4.0.5M醋酸盐（PH=5）[30mlHAC，960ml H2O，加10-20g NaOH 粉末，调至PH=5]

5.20mM的醋酸盐，PH=5：将4中的稀释25倍

6.DEAE sephadex A-25：称取3g 树脂，加90ml 0.5M 醋酸盐（PH=5）室温过夜溶解。

7.硫酸酯酶：15mg溶解于6ml 20mM 醋酸钠中，PH=5（16100uM/hour/g）

II 芥子油提取

1. 取新鲜莲座叶，鲜重5-10mg

2. 放入1.5mlEP管中，迅速放入液氮。

3. 研磨成粉末后并加入1ml 预热的70%的甲醇。

4. 加入50ul 5mM 的苄基芥子油苷

5. 盖好盖子漩涡震荡置于冰上，剩下的样品重复步骤3-4。

6. 所有的样品置于80℃10min。

7. 4000rpm，10min。

8. 将上清液转移至1.5 的离心管。

9. 用预热的甲醇重新提取两次，收集所有的上清液至4ml，-20℃

保存。

III 芥子油苷的脱硫纯化

1. 搅拌DEAE sephadex A-25 树脂成溶液，用1ml的移液器取1ml 加入BioRad 管中，让其沉淀。

2. 用5ml 的灭菌水清洗（禁止干燥）。

3. 加入所有的芥子油苷提取液。

4. 用2ml的70%的甲醇清洗两次，2ml 的灭菌水清洗5次，2ml 20mM 醋酸盐PH=5清洗一次。

5. 加入0.5ml 硫酸酯酶，直至上侧的橡胶管中剩余1-2mm的液相。IV 脱硫芥子油苷的洗脱

1. 用1ml 灭菌水洗脱3次。

2. 浓缩至EP 管中剩余0.5ml 液体

V HPLC分离脱硫芥子油苷

1. 取60ul 洗脱液于HPLC管中，吸入30ul

2. 检测：PDA 190nm-370nm （或者DV229nm和260nm）

3. 流速：1ml/min

4. 运行梯度：灭菌水（A）和甲醇（B），60min

A100%,B0% 2min

A to 60%B线性48min，60%

B to 100% B 线性3min

A 0%，B100% 3min

B to 100% A 线性4min

VI 芥子油苷的HPLC-MS

5. 取60ul 洗脱液加入HPLC管中，吸入6ul

6. 检测：质谱，[M+Na+]

7. 流速：0.25ml/min

8. 运行梯度：混有50uM的醋酸钠灭菌水（A）与甲醇（B），60min

A100%,B0% 2min

A to 60%B线性40min，60%

B to 100% B 线性5min

A 0%，B100% 5min

B to 100% A 线性8min

液相色谱质谱联用分离、鉴定芥蓝中脱硫芥子油苷

腊贵晓,方萍,李亚娟,王月

1.芥子油苷的提取和纯化

称取0. 20 g冻干样品,加入3 mL 70%甲醇(甲醇∶水= 70∶ 30),在70℃的水浴锅中提取10 min,然后4000 r min- 1离心10 min.沉淀再按照上述方法提取2次,合并上述提取液.同时做2个平行.取2 mL提取液流经DEAESephadex A-25萃取柱,待提取液全部流出小柱后,加入200 L硫酸酯酶(0. 1%)溶液.室温反应16 h后用4× 0. 5 mL 超纯水洗脱.洗脱液过0. 45μm微膜,4℃下保存,待HPLC分析.利用2-丙烯基芥子油苷(sinigrin)作为外标进行定量.

2.芥子油苷的测定与鉴定

测定芥子油苷的主要方法包括气相色谱法测定其降解产物异硫代氰酸盐化合物;高效液相色谱法测定脱硫芥子油苷和完形芥子油苷.对芥子油苷的鉴定一般采用质谱法,包括化学电离、快速原子轰击电离

及热喷雾电离等方法.

1.超高效液相色谱法测定拟南芥芥子油苷[J]东北农业大学学报，石璐，李梦莎，国静等摘要：将已有的拟南芥芥子油苷高效液相色谱（HPLC）检测方法转换为超高效液相色谱（UPLC）方法，通过条件优化改进，建立拟南芥芥子油苷UPLC检测方法。该方法采用Waters ACQUITY UPLC HSS T3色谱柱（50 mm×

2.1 mm，1.8 μm），以超纯水和甲醇为流动相进行梯度洗脱，流速为0.40 mL·min-1，检测波长229 nm，进样量5 μL，内标为苯甲基芥子油苷。

2.芥蓝芥子油苷提取条件优化研究

腊贵晓1，孔海民2，方萍3，杨铁钢1*

摘要:采用正交试验设计，研究了提取温度、提取剂甲醇浓度( V/V) 、提取时间和待测物质与提取液比例( 简称“物液比”) 对芥蓝菜薹中芥子油苷( 总芥子油苷含量、总脂肪族芥子油苷和总吲哚族芥子油苷) 提取效果的影响。结果表明，物液比和提取温度对总芥子油苷、总脂肪族芥子油苷和总吲哚族芥子油苷提取效果影响显著( P＜0．05) ，而甲醇浓度和提取时间对芥子油苷提取率无显著影响( P＞0．05) 。综合考虑提取效果和成本，芥蓝中芥子油苷最佳提取条件为75℃，物液比1∶45( g ∶mL) ，甲醇浓度70%，提取时间 5 min。在该条件下，总芥子油苷提取量为8．31 μmol/g DW，总脂肪族芥子油苷提取总量为7．58 μmol/g DW，总吲哚族脂肪族芥子油苷提取总量为0．73 μmol/g DW。

3.中国甘蓝型油菜硫苷含量及组份分析

李培武1，2，赵永国2，张文2，丁小霞2，杨湄3，汪雪芳3，谢从华1，傅廷栋1 （1）硫苷提取：准确称取0.2000 g 已制备好的样品至离心管中，于75℃水浴中保温杀活1 min，加入2 ml 70%甲醇提取液和200 µl 内标，离心、转移上清液至试管中，再加入2ml 70%甲醇提取并离心，共重复3 次，混合上清液，取2 ml 溶液上醋酸型DEAE-Sephadex A-25 阴离子交换柱，加硫酸酯酶500 µl，于36℃培养箱中酶解20 h 后取出，用1 ml 纯水冲洗，待流干后再用1 ml纯水冲洗，共冲洗3 次，混匀收集的洗脱液，用0.45 µm的微孔滤膜过滤、封口，待上液相色谱仪分析。

（2）高效液相色谱分析：使用美国Waters 公司的液相色谱仪，包括两台高压泵，自动进样器，二极管阵列检测器，色谱柱为Spherisorb C18柱（150 mm×4 mm），流动相为20%乙腈，检测波长229 nm，柱温为30℃，进样量10 µl，所有样品重复2 次，按照国际标准方法进行硫苷分量色谱峰定性。

青花菜：在青花菜芽菜中共发现了7种芥子油苷，3种脂肪类芥子