贝类微生物检验

一、菌落总数测定
菌落（Bacterial colony）是指细菌在固体培养基上生长繁殖而形成 的能被肉眼识别的生长物，它是由数以万计相同的细菌集合而成。
在一定培养条件下，每个能够生长繁殖的细菌细胞都可以在平板上形 成一个可见的菌落(cfu)。
菌落总数（Aerobic bacteria count）是指在需氧情况下，37℃培养 48h，能在普通营养琼脂平板上生长的细菌菌落总数。
菌落总数 检验操作及要求
接种
根据样品被污染情况的估计，选择2-3个适宜稀释度，取1ml稀释液于灭 菌平皿中，每个稀释度做两个平皿，同时将营养琼脂培养基倾入加有1ml 稀释液（不含样品）的灭菌平皿内作空白对照。
倾注用培养基应在46℃水浴内保温，温度过高会影响细菌生长，过低琼 脂易凝固，而不能与菌液充分混匀。如无水浴，应以皮肤感受较热而不 烫为宜。
贝类中微生物的检验
食品安全—世界性的公共卫生问题
目前主要食品安全问题包括微生物引起的食源性疾病，农药 残留、重金属、有机污染物等造成的化学性污染，以及非 法使用食品添加剂等。
2000年腹泻引起的死亡报告数就达到210万。 发达国家每年1/3 的人患食源性疾病，发展中国家更加严重。 美国每年约有7600万例食源性疾病患者，30余万人入院，5000人死亡，
检样
10倍梯度连续稀释
选2-3个适宜的稀释度 各取1ml分别加入灭菌平皿内
每平皿内加入适量营养琼脂
36℃±1℃
48h±2h
菌落计数
菌落总数
检验操作及要求
采样
不应集中一点，宜多采几个部位，样品必须经过均质或研磨，以保证 取样均匀。
稀释
为减少样品稀释误差，在连续递次稀释时，每一稀释液应充分振摇，使 其均匀，同时每一稀释度应更换一支吸管。
倾注培养基量约为12-20ml，一般以15ml较为适宜，平板过厚可能影响观 察，太薄又易于干裂。
倾注时，应将有沉淀物的培基底部弃去，以免与菌落混淆而影响计数观 察结果。
为使菌落能在平板上均匀分布，检液加入平皿后，应尽快倾注培养基并 旋转混匀，可正反两个方向旋转，旋转时应加小心，不要使混合物溅到 皿边的上方。
若所有稀释度均不在计数区间。
培养温度一般为37℃（由于鲜冻水产品的生活环境水温较低， 故多采用30℃的培养温度），培养时间一般为48h，当培养于 24h时也就观察生长状况。培养箱应保持一定的湿度，琼脂平 板培养48h后，培养基失重不应超过15％。
菌落总数
Leabharlann Baidu
检验操作及要求
菌落计数
到达规定培养时间，应立即计数。如果不能立即计数，应将平板暂时放置于 0-4℃，但不得超过24h。
计数时可用肉眼观察，必要时用放大镜检查，以防遗漏。在记下各平板的菌 落总数后，求出同稀释度的各平板平均菌落数，计算原始样品中每克（或每 ml）中的菌落数，进行报告。
计数时应选取菌落数在30-300之间的平板，若有二个稀释度均在30-300之间 时，应以二者比值决定，比值小于或等于2取平均数，比值大于2则取较小数 字。
菌落总数也被称为杂菌数，需氧菌数等,并不表示实际中的所有细菌 总数,因厌氧或微需氧菌、有特殊营养要求的以及非嗜中温细菌，难 以繁殖生长。
菌落总数测定是用于判定食品被细菌污染的程度及卫生状况，它反映 食品的生产过程是否符合卫生要求，以便对被检样品做出适当的卫生 学评价。
菌落总数 检验程序(GB/T 4789.2-2003)
在进行连续稀释时，吸管插入检样稀释液内不得低于液面2.5cm，吸取 液体时应先高于吸管刻度，然后提起吸管尖端离开液面，将尖端贴于三 角瓶或试管的内壁使吸管内液体调至所要求的刻度。
当用吸管将检样稀释液加至另一空白稀释液时，应将吸管内液体沿管壁 小心流入，勿使吸管尖端伸入稀释液内。
样品稀释液主要是灭菌蒸馏水、灭菌生理盐水、磷酸盐缓冲液、0.1％蛋 白胨水，磷酸盐缓冲液、 0.1％蛋白胨水有修复食品中受损伤的细菌细 胞的作用，如对含盐量较高的食品（如虾油）可采灭菌蒸馏水稀释。
贝类微生物检验的主要指标
菌落总数 大肠菌群 沙门氏菌 副溶血性弧菌 单核细胞增生李斯特氏菌
贝类微生物检验的样品处理
采样部位为贝壳内容物。 先用流水刷洗贝壳，刷净后放在铺有灭菌毛巾的清 洁的搪瓷盘或工作台上，采样者将双手洗净并用75% 酒精棉球涂擦消毒后，用灭菌小钝刀从贝壳的张口 处隙缝中徐徐切入，翘开壳盖，再用灭菌镊子取出 整个内容物。 称取25g置灭菌乳钵内，用灭菌剪子剪碎，加灭菌海 砂或玻璃砂研磨（有条件情况下可用均质器），检 样磨碎后进行进一步的检验。
李斯特菌对胎儿危害极大，2004年导致107例死亡（欧盟，2005）。 沙门氏菌对禽类、生猪及其鲜肉制品的感染率最高，蛋类、禽类肉制品和
猪肉是人类感染沙门氏菌病的主要渠道（欧盟，2005）。 在夏秋季节的沿海地区，由于食用带有大量副溶血性弧菌的海产食品，引
起爆发性食物中毒时有发生。
食品卫生的监控重点是对微生物污染的控制，只有从源头上切断食 品污染的渠道，才能有效控制食品安全问题的发生。
检样从开始稀释到倾注最后一个平皿所用时间不宜超过20min，以防止细 菌死亡或繁殖。
菌落总数
检验操作及要求
培养
琼脂凝固后应在数分钟内翻转并移至培养箱内培养，这样可 避免菌落蔓延生长。必要时，可先将平皿打开倒置（皿底向 上）于培养箱内，经15-60min使琼脂表面干燥后，再将皿底 移至盖内倒置培养，可防止运动型强的变形杆菌属、假单胞 菌属等在琼脂表面扩展生长。
损失350亿美元（1997年）。 根据WHO的估计，发达国家食源性疾病的漏报率90%以上，发展中国家为
95%以上。 中国每年食物中毒例数至少20-40万人,细菌性食物中毒事件占食物中毒
事件总数的30%-90%，中毒人数占食物中毒总人数的60%-90%。
致病菌的危害
细菌性微生物是人类食物链中最常见的病原，主要有大肠杆菌、沙门氏菌、 结核菌、炭疽菌、肉毒梭菌、李斯特菌、葡萄球菌、猪链球菌、副溶血弧 菌等。 食品感染——通过活菌摄入引起人体（通常是肠道）感染 食物中毒——预先在食品中产生的细菌毒素导致人类中毒