细菌内毒素检查法
细菌内毒素测定技术—细菌内毒素检查方法
知识点：光度测定法
四、结果判断 若供试品溶液所有平行管的平均内毒素浓度乘以稀释
倍数后小于规定的内毒素限值，判定供试品符合规定；若 大于或等于规定的内毒素限值，判定供试品不符合规定。
注：本检查法中，“管”的意思包括其他任何反应容 器，如微孔板中的孔。
技能点：凝胶限度试验操作规程
检验供试品中的内毒素含量是否小于限值的定性方法，按下表制 备溶液A、B、C和D。使用稀释倍数为MVD并且已经排除干扰的供 试品溶液来制备溶液A 和B。按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。
3、如果供试品溶液的所有平行管均为阳性，应记为内 毒素的浓度大于或等于最大的稀释倍数乘以λ。
4、若内毒素浓度小于规定的限值，判定供试品符合规 定。若内毒素浓度大于或等于规定的限值，判定供试品不 符合规定。
知识点：光度测定法
一、方法
光度测定法分为浊度法和显色基质法。 浊度法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中的浊度 变化而测定内毒素含量的方法。根据检测原理，可分为终 点浊度法和动态浊度法。 显色基质法系利用检测鲎试剂与内毒素反应过程中产 生的凝固酶使特定底物释放出呈色团的多少而测定内毒素 含量的方法。根据检测原理，分为终点显色法和动态显色 法。
试。复试时，溶液A需做4支平行管，若所有平行管均为阴性，判定供试品 符合规定；否则判定供试品不符合规定。
技能点：凝胶限度试验操作规程
4、阳性对照结果出现阴性，可能是由于内毒素工作品效价标 示不准确或效价衰退或失败；稀释内毒素没有使用旋涡混合器或 稀释操作不当；鲎试剂效价标示不准确或效价衰退或失效；反应 试管放入水浴保温前试管中内容物没有摇匀造成。阴性对照出现 阳性结果可能是由于鲎试剂或者水污染，试验器具污染，试验过 程操作不当污染造成。
A：没有超过MVD并且通过干扰试验的供试品系列稀释液。 B：供试品阳性对照。（为确证不存在干扰作用） C：标准内毒素系列。（为确证本次试验的操作和环境都符合要求。）D：阴性对照。
药典三部版通则细菌内毒素检查法
药典三部版通则细菌内毒素检查法标准化工作室编码[XX968T-XX89628-XJ668-XT689N]1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检测法----凝胶法一、准备材料：试剂及耗材名称用量细菌标准品（10EU/ml）1支细菌内毒素检查用水(2ml) 3支鲎试剂（0.1ml）4支15ml离心管3个1.5ml EP管2个1000µl枪头6个200µl枪头5个二、相关定义：1.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂与细菌内毒素产生凝集反应的机理，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法，内毒素的量用内毒素单位（EU）表示。
2.细菌内毒素国家标准品：系自大肠杆菌精制得到的内毒素，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度和标定细菌内毒素工作标准品的效价。
3.细菌内毒素工作标准品：系以细菌内毒素国家标准品为基准进行标定，确定其重量相当效价，每1ng工作标准品效价应不小于2EU，不大于50EU。
细菌内毒素工作标准品用于试验中鲎试剂灵敏度复核干扰试验及设置的各种对照。
4.细菌内毒素检查用水：系指与灵敏度为0.03EU/ml或更高灵敏度的鲎试剂24小时不产生凝集反应的灭菌注射用水。
三、内毒素标准品稀释：10EU/ml的标准品加1ml细菌检查用水溶解，在涡旋仪上振荡15min。
箭头上方表示内毒素，箭头下方表示检查用水。
10EU/mL→稀释至2EU/mL→稀释至1EU/mL四、样品内毒素检测操作步骤1、样品阳性管：加样品液0.5ml+2EU/ml内毒素0.5ml，涡旋仪上混匀30s。
做内毒素检测用。
（为了核实样品中是否有抑制鲎试剂凝聚的物质，防止样品管出现假阴性导致误判，以证明供试品溶液的结果准确）。
2、阳性对照：1EU/ml内毒素0.1ml。
3、阴性对照：细菌内毒素检查用水0.1ml。
4、样品管：样品液0.5ml+细菌内毒素检查用水0.5ml，涡旋仪上混匀30s，做内毒素检测用。
5、鲎试剂的准备：每支鲎试剂用0.1ml检查用水溶解。
6、以上准备完成后，从1、2、3、4管中分别取0.1ml加到溶解好的鲎试剂中，封口膜封口，37度孵育1h。
细菌内毒素检查法
细菌内毒素检查法1 简述1.1 本规范适用于细菌内毒素检查法——凝胶法和光度测定法。
后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行实验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
1.2 供试品细菌内毒素限值的确定1.2.1 药典中有规定的，按供试品各论中规定限值；1.2.2 尚无标准规定的，按以下公式确定供试品内毒素限值：L=K／M式中L为供试品的细菌内毒素限值，以EU／ml、EU／mg、EU／U表示。
K为按规定的给药途径，人用每公斤体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU／(k g•h)表示。
其中注射剂，K=5EU／(k g•h)；放射性药品注射剂，K=2．5EU ／(k g•h)；鞘内用注射剂，K=0.2EU／(k g•h)。
M为人用每公斤体重每小时的最大供试品剂量，以m1／(k g•h)、mg／(k g•h)、U／(k g•h)表示。
药品人用最大剂量可参阅国家批准的药品说明书和《临床用药须知》等权威著作，中国人均体重按60kg计算，注射时间小于l小时的按l小时计。
若供试品按体表面积给药，供试品每平方米体表面积计量乘以0.027即可转换为每千克体重计量［即M=(最大给药剂量/(m2·h)×1.62m2)/60kg］。
1.3 供试品最大有效稀释倍数的确定供试品的最大有效稀释倍数(MVD)按下式计算：MVD＝CL/λL为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度。
当L以EU／ml表示时，C等于1.0ml／m1；当L的单位以EU／mg或EU／U表示时，C为供试品制备成溶液后的浓度，单位为mg／m1或U／m1。
作业指导书指导书编号TYFDC-SOP-FF-073细菌内毒素检查法第2页共18页第二版批准李忠华初审吴雅凝起草吴雅凝λ在凝胶法中为鲎试剂的标示灵敏度，在光度测定法中为所使用的标准曲线中的最低内毒素浓度。
如供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD取1，可计算供试品的最小有效稀释浓度C：λ／L。
药典三部-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公式确定：L=K/M式中 L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U （活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（k g·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
药典三部(2015版)-通则-1143细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法.细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法.供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时,除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准.本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位(EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价,用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验.细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0。
005EU/ml（用于光度测定法）,且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上)去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6。
0～8.0的范围内为宜,可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值.酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制.缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值(L）一般按以下公式确定:L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示;K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量,以EU/（kg·h)表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2。
药典三部(2015版)-通则-细菌内毒素检查法
1143 细菌内毒素检查法本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰阴性菌产生的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
细菌内毒素检查包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后者包括浊度法和显色基质法。
供试品检测时，可使用其中任何一种方法进行试验。
当测定结果有争议时，除另有规定外，以凝胶限度试验结果为准。
本试验操作过程应防止内毒素的污染。
细菌内毒素的量用内毒素单位（EU）表示，1EU与1个内毒素国际单位（IU）相当。
细菌内毒素国家标准品系自大肠埃希菌提取精制而成，用于标定、复核、仲裁鲎试剂灵敏度、标定细菌内毒素工作标准品的效价，干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素工作标准品系以细菌内毒素国家标准品为基准标定其效价，用于干扰试验及检查法中编号B和C溶液的制备、凝胶法中鲎试剂灵敏度复核试验、光度测定法中标准曲线可靠性试验。
细菌内毒素检查用水应符合灭菌注射用水标准，其内毒素含量小于0.015EU/ml（用于凝胶法）或0.005EU/ml（用于光度测定法），且对内毒素试验无干扰作用。
试验所用的器皿需经处理，以去除可能存在的外源性内毒素。
耐热器皿常用干热灭菌法（250℃、30分钟以上）去除，也可采用其他确证不干扰细菌内毒素检查的适宜方法。
若使用塑料器皿，如微孔板和与微量加样器配套的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器具。
供试品溶液的制备某些供试品需进行复溶、稀释或在水性溶液中浸提制成供试品溶液。
必要时，可调节被测溶液（或其稀释液）的pH值，一般供试品溶液和鲎试剂混合后溶液的pH值在6.0～8.0的范围内为宜，可使用适宜的酸、碱溶液或缓冲溶液调节pH值。
酸或碱溶液须用细菌内毒素检查用水在已去除内毒素的容器中配制。
缓冲液必须经过验证不含内毒素和干扰因子。
内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值（L）一般按以下公L=K/M式中L为供试品的细菌内毒素限值，一般以EU/ml、EU/mg或EU/U（活性单位）表示；K为人每千克体重每小时最大可接受的内毒素剂量，以EU/（kg·h）表示，注射剂K=5 EU/（kg·h），放射性药品注射剂K=2.5 EU/（kg·h），鞘内用注射剂K=0.2 EU/（kg·h）；M为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以ml/（kg·h）、mg/（kg·h）或U/（kg·h）表示，人均体重按60kg计算，人体表面积按1.62㎡计算。
光度法细菌内毒素检查实验方法
光度法细菌内毒素检查实验方法
光度法细菌内毒素检查实验方法主要包括以下步骤:
1.准备试剂和样品:准备所需的宣试剂、内毒素标准品、样品等。
2.加样:按照实验要求，将室试剂、内毒索标准品和样品加入反应管中。
3.孵育:将反应管放入恒温箱中，在适宜的温度下进行孵育。
4.检测:在孵育结束后，使用光度计检测反应管中的吸光度或透光率。
5.结果分析:根据检测结果，计算样品中的内毒素含量，并与标准品进行比较，判断样品是否合格。
需要注意的是。
光度法细菌内毒索检查实验方法的具体操作步骤可能因不同的实验条件和仪器而有所差异。
因此，在进行实验前，应仔细阅读实验说明书，了解实验原理和操作步骤，并严格按照实验要求进行操作。
同时，为了保证实验结果的准确性和可靠性，还应进行必要的实验质星控制和验证。
细菌内毒素检查法应用指导原则
细菌内毒素检查法应用指导原则细菌内毒素检查法是一种常用的检测细菌内毒素含量的方法，以下是其应用指导原则：1. 临床应用：细菌内毒素检查法主要用于临床诊断中，可以辅助判断细菌感染的程度和危险程度，对临床治疗方案的选择和预后评估具有重要意义。
2. 检测细菌内毒素：细菌内毒素检查法可以检测细菌体内产生的内毒素，包括脂多糖、肽、毒菌素等，可以提供关于感染病原体的重要信息。
3. 适用菌种：该检查法主要适用于产生内毒素的细菌，如大肠杆菌、肺炎克雷伯菌、金黄色葡萄球菌等。
不同菌种产生的内毒素种类和水平可能有所不同，需要根据具体情况选择合适的检测方法。
4. 适用样本：内毒素检查法适用于各种临床样本，如血液、尿液、体液等。
不同样本中的内毒素含量可能有差异，需要根据具体情况选择合适的样本。
5. 检测方法选择：目前常用的细菌内毒素检测方法包括酶联免疫吸附试验（ELISA）、质谱法（Mass Spectrometry）和生物活性检测法等，选择合适的检测方法需要考虑其敏感性、特异性、操作简便性和成本等方面的因素。
6. 结果解读：细菌内毒素检查结果应综合临床表现和其他检查结果进行解读，单一的内毒素检测结果并不能确定感染的严重程度和预后情况。
在临床应用中，需要综合患者的临床症状、实验室检查和影像学等多方面信息进行综合评估。
7. 质量控制：在使用细菌内毒素检查法时，需要进行质量控制，确保检测结果的准确性和可靠性。
这包括实验室操作规范、标准品的选择和存储、仪器的检验和维护等方面。
总之，细菌内毒素检查法在临床应用中有着重要的意义，可以提供有关感染病原体的重要信息，但需要根据临床情况综合判断和解读结果。
质量控制也是使用该检查法时需要注意的重要方面。
2020药典细菌内毒素检查法
2020年的药典中有多种方法可用于检测细菌内毒素，以下是其中一些常见的方法：
杂交酶联免疫吸附试验（ELISA）：ELISA是一种常用的定性和定量检测方法，可以用于测定细菌内毒素的存在和浓度。
该方法利用特异性抗体与目标内毒素结合，并通过酶标记来检测反应的产物。
液相色谱-质谱联用（LC-MS）：LC-MS是一种高灵敏度和高选择性的分析技术，可用于细菌内毒素的检测和鉴定。
该方法将样品通过液相色谱分离，然后与质谱仪相连，通过质谱仪的检测来确定内毒素的存在和浓度。
生物学方法：一些生物学方法也可用于检测细菌内毒素，如小鼠致死试验和细胞毒性试验。
小鼠致死试验通过注射待测样品到小鼠体内，观察小鼠的生存情况来判断内毒素的存在。
细胞毒性试验则使用细胞培养体外模型，通过观察细胞的存活情况来评估内毒素的毒性。
凝胶凝集试验：凝胶凝集试验是一种常用的定性检测方法，通过将内毒素与抗体反应，在凝胶中观察反应的凝胶凝集情况来判断内毒素的存在与否。
《细菌内毒素检查法》课件
本课程将介绍细菌内毒素检查法的原理、种类、检测方法、应用领域、优势 和局限性以及实施过程，以及其在研究领域中的发展趋势。
细菌内毒素的危害
1 健康危害
因某些细菌种群大量滋生 释放内毒素而导致食物中 毒、中毒性休克等健康问 题。
2 环境危害
有些细菌内毒素难以处理 且对环境造成危害，例如 鱼类致病性细菌产生的内 毒素对水质造成危害。
3 经济危害
某些细菌内毒素对食品安 全造成威胁，导致企业经 济损失。
检测方法
酶联免疫吸附法
基于免疫抗原抗体对，可检测 极低浓度内毒素。
化学检测法
基于内毒素的化学性质，但存 在交叉反应等缺点。
电子显微镜法
可直接观察细胞内毒素的形态 和分布，但检测精度较低。
生物学检测法
基于细胞生物活性特性，能够 反映细胞内毒素的毒性，但耗 时、费力。
应用领域
食品安全
应用于食品卫生监测和食品 安全评价，确保食品安全。
环境监测
帮助研究水质、土壤污染、 制药废水等环境问题的解决。
医疗诊断
辅助疾病的早期诊断和治疗， 特别是针对慢性病。
优势和局限性
优势
• 检测灵敏度高 • 检测方法多样化 • 结果直观、准确
局限性
• 样品处理条件严格 • 存在交叉反应 • 检测过程较复杂
新材料技术
开发出更为灵敏、可靠、高通量、 低成本的检测材料。
实施过程
1
样品处理
对待检样品进行预处理，获取检测样品。
2
检测方法选择
根据不同检测目的，综合选择检测方法。
3
试剂准备
选择合适的试剂，按照比例配制好所需试剂。
4仪器操作使用合源自的仪器，操作细菌内毒素检测。发展趋势
《细菌内毒素检查法》课件
结论
根据实验结果得出结论，对样品中是 否存在内毒素进行评估，并提出建议 和改进措施。
报告实例分析
实例一
某药品细菌内毒素检查报告，通过采用鲎试剂法进行实验，得出阴性结果，证明 该药品中不存在内毒素。
实例二
某注射用水细菌内毒素检查报告，通过采用鲎试剂法进行实验，得出阳性结果， 证明该注射用水中存在内毒素，可能对使用者产生毒性作用。
内毒素可刺激机体产生炎症反 应，导致发热、白细胞反应和 组织损伤等。
内毒素还可诱导机体产生细胞 因子、补体成分和急性期蛋白 等生物活性物质。
内毒素的检测原理
细菌内毒素检测基于鲎试剂与内 毒素的凝集反应，通过检测凝集 反应的产物来反映内毒素的浓度
。
鲎试剂是一种天然的生物试剂， 具有灵敏度高、特异性强、操作
简便等优点。
检测原理基于鲎试剂与内毒素反 应后产生的凝固酶，通过比浊法 或显色法测定其浓度，从而推算
出内毒素的浓度。
03
细菌内毒素检查法实验操作流 程
样品采集与处理
样品采集
采集具有代表性的样品，确保样品无菌，避免外界污染。
样品处理
将采集的样品进行稀释、离心、过滤等处理，以去除杂质和 干扰物质。
试剂与器材准备
特点
具有灵敏度高、特异性好、操作 简便、快速等特点，是国际上普 遍采用的检测方法。
历史与发展
历史
细菌内毒素检查法自20世纪初开始 研究，经过近百年的发展，已经成为 一种成熟的检测技术。
发展
随着科学技术的发展，细菌内毒素检 查法不断改进和完善，检测灵敏度和 特异性不断提高。
应用领域
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在生物制品领域，细菌内毒素检查可以用于检测疫苗 、抗体、细胞培养物等生物制品中是否存在细菌内毒 素，确保产品的安全性和有效性。
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移取注射液xml
MVD？
L· x/v=L×MVD ≥入,MVD≥入/L EU/ml
3.检查方法
（1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素）
②确定药品的细菌内毒素限值L； ③选择鲎试剂的灵敏度入；
毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数） 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 该法优点：快速、灵敏。 2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂
①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内
毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵 敏度。
c lg 1 ( X / 4)
复溶
内毒素检查用水
4支 4支
0.5λ 内毒素溶液 保温1h
结 果 有 效
2支
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒 素检查，并以λC 为该批鲎试剂灵敏度
呈阴性
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式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是 指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
（4）取鲎试剂8支（0.1ml/支），两支作为样品检 查管(S1、S2)，2支标记为阳性对照，2支为阳性产 品对照，2支标记为阴性对照，如下图所示
s1 s2 阳性对照 阳性产品对照 阴性对照
0.1ml水 0.1ml水 +0.1ml +0.1ml SMVD16 SMVD16
0.1ml水 +0.1ml E2入
3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固 蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
鲎的图片
鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化 石)一样古老的动物。 鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试 剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品 工业中，可用它对毒素污染进行监测。
细菌内毒素检查法
药分教研室 丁晓红 Logo
三、细菌内毒素检查法
（一）概述
1.内毒素(Endotoxin)： 即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放 出来。
2.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生 的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
②细菌内毒素工作标准品（CSE）：系以细菌内毒素国家标准品为基
准进行标定，确定其质量的相当效价。1ng工作标准品效价应不小于
2EU，不大于50EU。用于鲎试剂灵敏度的复核、干扰试验及设臵的各 种阳性对照。
③细菌内毒素检查用水（BET水）：系指内毒素含量小于0.015EU/ml
的灭菌注射用水。是细菌内毒素检查专用水。 ④鲎试剂和鲎试剂灵敏度：a、鲎试剂的生产：利用鲎血制备而成。
用水、漩涡混合器、37±1℃试管恒温仪、稀释、移液容器、试管架
或试管浮板、酒精灯、消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布 标记纸等。
(3)鲎试剂灵敏度的复核试验
A、复核的条件：本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒
素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批 号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进
A、除去干扰：试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内
毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细 菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套
的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作
过程应防止微生物的污染。 B、材料与器具：细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查
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鲎试剂的种类：美洲鲎试剂（LAL）、中国鲎试剂（TAL）、圆尾鲎试
剂（CAL）。
B、鲎试剂的规格：是指每支鲎试剂的装量，如：0.1ml、0.5ml。一
般来说，规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶。如：0.1ml
就用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。 C、鲎试剂标示灵敏度：细菌内毒素检查的规定条件下，使鲎试剂产
生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。
⑤细菌内毒素的限值（L）：哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐 受力，只有内毒素超过一定的限度，才会引起热原反应。因此内毒素
的检查是一个限量检查，只要不超过限值，产品就合格。确定限值的
方法—从质量标准正文中查出。
⑥最大有效稀释倍数（MVD）：供试品溶液被允许稀释的最大倍数， 在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定。 MVD=CL/入。 L：内毒素限值；c：供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时， c=1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时， c的单位为mg/ml或u/ml， 如：供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD=1
4.检查方法：包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后 者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中 任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规
定外，以凝胶法结果为准。
5.检查的意义：注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射 剂安全性的重要质量指标。
（二）凝胶法
1.原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内
0.1mlE2入 +0.1ml SMVD16
0.2ml水
（5）封闭管口，摇匀，放入37±1℃的恒温水浴保温 60±2分钟，取出观察结果，记录结果。 （6）结果的判断及处理：在阳性对照为阳性，阴性对照
为阴性的情况下，若两支样品管均为阳性，判为不合格；
若两支样品管均为阴性，判为合格；若两支样品管一为阳 性，一为阴性，另取4支供试品复试。 若阳性对照为阴性，或阴性对照为阳性的情况下，应寻找 原因重试。
（5）检查方法 ①取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2入浓度溶液 ②取检品S，计算MVD ③把它稀释成SMVD ④取鲎试剂8支（0.1ml/支），2支作为样品检查管(S1、S2)，2支标
记为阳性对照，2支为阳性产品对照，2支标记为阴性对照
举例-清开灵注射液中 细菌内毒素的检查
行鲎试剂灵敏度复核试验。
c lg 1 ( X / 4)
B、操作：
4支 4支
0.1ml 0.1ml/ 支 规 格 鲎 试 剂 原 安 瓿 支
内毒素工作标准品或国家标准品 稀 释 内毒素检查用水溶解15min
0.1ml
2.0λ 内毒素溶液
呈阳性
0.1ml 1.0λ 内毒素溶液 37±1℃ 0.1ml 0.1ml 0.25λ 内毒素溶液 0.1ml 内毒素检查用水
④计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度；
⑤鲎试剂灵敏度的复核； ⑥药品与鲎试剂的相容性的初选实验（无干扰浓度初选）； ⑦供试品的干扰实验的验证（正式干扰试验）； ⑧供试品日常的内毒素限量检查。 在实际操作过程中，（1）→（4）顺序可变，（5）→（8）顺序不能 变。
(2)实验准备
计算鲎试 剂灵敏度
(4)细菌内毒素检查-凝胶法-干扰试验
按表制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且 不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项 下操作。
编号
内毒素浓度/配制 内毒素的溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素 的浓度
平行管数
A
B
无/供试品溶液
设检品为S，L=1.0EU/ml，选用效价为0.06EU/支、入 =0.06EU/ml的鲎试剂，使用的细菌内毒素的工作标准品的 效价为10 EU/支。参数及MVD已经过预试验验证。 操作步骤（1）取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2 入浓度溶液，即E0.12. （2）计算最大稀释倍数MVD=L/入=1.0/0.06=16倍 （3）取检品S，把它稀释呈SMVD：0.2mlS+3.0ml水→ SMVD16
2λ/供试品溶液
——
供试品溶液
——
1 2 4 8
——
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
2
4 8
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
4 4 4 4
D
无/检查用水
——
——
——
2
干扰试验结果判定
前提：A和D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂 灵敏度复核范围内时，试验方为有效。 按下列计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es=lg-1（ΣXs/4) Et=lg-1（ΣXt/4) 式中 Es、Et分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值(lg)。 当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ 和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es） 时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的 稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步 稀释，再重复干扰试验。 注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对 照系列；D为阴性对照。