细菌内毒素检查法

用水、漩涡混合器、37±1℃试管恒温仪、稀释、移液容器、试管架
或试管浮板、酒精灯、消毒酒精棉球、剪刀、砂轮、镊子、封口胶布 标记纸等。
(3)鲎试剂灵敏度的复核试验
A、复核的条件：本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒
素的最低浓度即为鲎试剂的标示灵敏度，用EU/ml表示。当使用新批 号的鲎试剂或试验条件发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进
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2λ/供试品溶液
——
供试品溶液
——
1 2 4 8
——
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
2
4 4 4 4
C
2λ/检查用水
检查用水
1 2 4 8
2λ 1λ 0.5λ 0.25λ
4 4 4 4
D
无/检查用水
——
——
——
2
干扰试验结果判定
前提：A和D的所有平行管都为阴性，并且系列溶液C的结果在鲎试剂 灵敏度复核范围内时，试验方为有效。 按下列计算系列溶液C和B的反应终点浓度的几何平均值（Es和Et）。 Es=lg-1（ΣXs/4) Et=lg-1（ΣXt/4) 式中 Es、Et分别为系列溶液C和溶液B反应终点浓度的对数值(lg)。 当Es在0.5λ~2λ(包括0.5λ 和2λ）及0.5Es~2Es（包括0.5Es和2Es） 时，认为供试品在该浓度下无干扰作用。若供试品溶液在小于MVD的 稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品溶液进行不超过MVD的进一步 稀释，再重复干扰试验。 注：A为供试品溶液；B为干扰试验系列；C为鲎试剂标示灵敏度的对 照系列；D为阴性对照。
设检品为S，L=1.0EU/ml，选用效价为0.06EU/支、入 =0.06EU/ml的鲎试剂，使用的细菌内毒素的工作标准品的 效价为10 EU/支。参数及MVD已经过预试验验证。 操作步骤（1）取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2 入浓度溶液，即E0.12. （2）计算最大稀释倍数MVD=L/入=1.0/0.06=16倍 （3）取检品S，把它稀释呈SMVD：0.2mlS+3.0ml水→ SMVD16
（4）取鲎试剂8支（0.1ml/支），两支作为样品检 查管(S1、S2)，2支标记为阳性对照，2支为阳性产 品对照，2支标记为阴性对照，如下图所示
s1 s2 阳性对照 阳性产品对照 阴性对照
0.1ml水 0.1ml水 +0.1ml +0.1ml SMVD16 SMVD16
0.1ml水 +0.1ml E2入
毒素的方法。(限量、阳性对照、灵敏度、溶剂、稀释倍数） 内毒素的量用内毒素单位(EU)表示。 该法优点：快速、灵敏。 2.细菌内毒素检查过程中用到的标准品和试剂
①细菌内毒素国家标准品（RSE）：系自大肠杆菌提取精制得到的内
毒素。用于标定细菌内毒素工作标准品的效价、复核、仲裁鲎试剂灵 敏度。
行鲎试剂灵敏度复核试验。
c lg 1 ( X / 4)
B、操作：
4支 4支
0.1ml 0.1ml/ 支 规 格 鲎 试 剂 原 安 瓿 支
内毒素工作标准品或国家标准品 稀 释 内毒素检查用水溶解15min
0.1ml
2.0λ 内毒素溶液
呈阳性
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0.1ml 1.0λ 内毒素溶液 37±1℃ 0.1ml 0.1ml 0.25λ 内毒素溶液 0.1ml 内毒素检查用水
A、除去干扰：试验所用器皿需经处理，以除去可能存在的外源性内
毒素，常用的方法是250℃干烤至少1小时，也可用其它确证不干扰细 菌内毒素的适宜方法。若使用塑料器械，如微孔板和微量加样器配套
的吸头等，应选用标明无内毒素并且对试验无干扰的器械。试验操作
过程应防止微生物的污染。 B、材料与器具：细菌内毒素工作标准品、鲎试剂、细菌内毒素检查
3.什么是鲎试剂？鲎试剂是由海洋生物鲎的血液变形细胞溶解物制成的无菌 冷冻干燥品，含有能被微量细菌内毒素和真菌葡聚糖激活的凝固酶原，凝固 蛋白原，能够准确、快速地定性或定量检测样品中是否含有细菌内毒素和 （1,3）-β-葡聚糖激。
鲎的图片
鲎的长相既像虾又像蟹，人称之为“马蹄蟹”,是一类与三叶虫(现在只有化 石)一样古老的动物。 鲎的血液中含有铜离子，它的血液是蓝色的。这种蓝色血液的提取物——“鲎试 剂”，可以准确、快速地检测人体内部组织是否因细菌感染而致病；在制药和食品 工业中，可用它对毒素污染进行监测。
EU/mg 例如：称取mg供试品 Vml C最大有效 L×m/v=L×c样≥入,c样≥入/L Vml
移取注射液xml
MVD？
L· x/v=L×MVD ≥入,MVD≥入/L EU/ml
3.检查方法
（1）检查程序：①实验试剂、仪器及用具等的准备；（除内毒素）
②确定药品的细菌内毒素限值L； ③选择鲎试剂的灵敏度入；
计算鲎试 剂灵敏度
(4)细菌内毒素检查-凝胶法-干扰试验
按表制备溶液A、B、C和D，使用的供试品溶液应为未检验出内毒素且 不超过最大有效稀释倍数（MVD）的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项 下操作。

编号
内毒素浓度/配制 内毒素的溶液
稀释用液
稀释倍数
所含内毒素 的浓度
平行管数
A
B
无/供试品溶液
生凝集的内毒素的最低浓度，用EU/ml表示，如：入=0.5EU/ml。
⑤细菌内毒素的限值（L）：哺乳动物对细菌内毒素的量有一定的耐 受力，只有内毒素超过一定的限度，才会引起热原反应。因此内毒素
的检查是一个限量检查，只要不超过限值，产品就合格。确定限值的
方法—从质量标准正文中查出。
⑥最大有效稀释倍数（MVD）：供试品溶液被允许稀释的最大倍数， 在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的测定。 MVD=CL/入。 L：内毒素限值；c：供试品溶液浓度，当L以EU/ml表示时， c=1.0ml/ml；当L以EU/mg或EU/u表示时， c的单位为mg/ml或u/ml， 如：供试品为注射用无菌粉末或原料药，则MVD=1
0.1mlE2入 +0.1ml SMVD16
0.2ml水
（5）封闭管口，摇匀，放入37±1℃的恒温水浴保温 60±2分钟，取出观察结果，记录结果。 （6）结果的判断及处理：在阳性对照为阳性，阴性对照
为阴性的情况下，若两支样品管均为阳性，判为不合格；
若两支样品管均为阴性，判为合格；若两支样品管一为阳 性，一为阴性，另取4支供试品复试。 若阳性对照为阴性，或阴性对照为阳性的情况下，应寻找 原因重试。
②细菌内毒素工作标准品（CSE）：系以细菌内毒素国家标准品为基
准进行标定，确定其质量的相当效价。1ng工作标准品效价应不小于
2EU，不大于50EU。用于鲎试剂灵敏度的复核、干扰试验及设臵的各 种阳性对照。
③细菌内毒素检查用水（BET水）：系指内毒素含量小于0.015EU/ml
的灭菌注射用水。是细菌内毒素检查专用水。 ④鲎试剂和鲎试剂灵敏度：a、鲎试剂的生产：利用鲎血制备而成。
c lg 1 ( X / 4)
复溶
内毒素检查用水
4支 4支
0.5λ 内毒素溶液 保温1h
结 果 有 效
2支
当λc在0.5λ～2.0λ时，方可用于内毒 素检查，并以λC 为该批鲎试剂灵敏度
呈阴性
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式中：X为反应终点浓度的对数值(lg)。反应终点浓度是 指系列递减的内毒素浓度中最后一个呈阳性结果的浓度。
④计算供试品的最大有效稀释倍数或最低有效浓度；
⑤鲎试剂灵敏度的复核； ⑥药品与鲎试剂的相容性的初选实验（无干扰浓度初选）； ⑦供试品的干扰实验的验证（正式干扰试验）； ⑧供试品日常的内毒素限量检查。 在实际操作过程中，（1）→（4）顺序可变，（5）→（8）顺序不能 变。
(2)实验准备
鲎试剂的种类：美洲鲎试剂（LAL）、中国鲎试剂（TAL）、圆尾鲎试
剂（CAL）。
B、鲎试剂的规格：是指每支鲎试剂的装量，如：0.1ml、0.5ml。一
般来说，规格是多少就用多少细菌内毒素检查用水复溶。如：0.1ml
就用0.1ml细菌内毒素检查用水复溶。 C、鲎试剂标示灵敏度：细菌内毒素检查的规定条件下，使鲎试剂产
4.检查方法：包括两种方法，即凝胶法和光度测定法，后 者包括浊度法和显色基质法。供试品检测时，可使用其中 任何一种方法进行试验。当测定结果有争议时，除另有规
定外，以凝胶法结果为准。
5.检查的意义：注射剂热原或细菌内毒素检查是保证注射 剂安全性的重要质量指标。
（二）凝胶法
1.原理：通过鲎试剂与内毒素产生凝集反应的原理来检测或半定量内
细菌内毒素检查法
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三、细菌内毒素检查法
（一）概述
1.内毒素(Endotoxin)： 即革兰氏阴性菌细胞壁的脂多糖，其毒性成分为类脂A，菌体死亡崩解后释放 出来。
2.细菌内毒素检查法：本法系利用鲎试剂来检测或量化由革兰氏阴性菌产生 的细菌内毒素，以判断供试品中细菌内毒素的限量是否符合规定的一种方法。
（5）检查方法 ①取内毒素的工作标准品一支，用水稀释至2入浓度溶液 ②取检品S，计算MVD ③把它稀释成SMVD ④取鲎试剂8支（0.1ml/支），2支作为样品检查管(S1、S2)，2支标
记为阳性对照，2支为阳性产品对照，2支标记为阴性对照
举例-清开灵注射液中 细菌内毒素的检查