磷脂组成的分析方法

磷脂组成的分析方法

1 适用范围

本方法适用于含油磷脂，脱油磷脂，磷脂组分中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的测定。

本方法不适合溶血磷脂酰胆碱及溶血磷脂酰乙醇胺的测定。

2 主要内容

本方法采用高效液相色谱法同时测定磷脂中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇三种组分的含量。

3 原理

根据磷脂中不同组分与硅胶材料的结合能力差异，用多元流动相进行等度洗脱，紫外检测器在线检测，与标准系列比较定量。

4 试剂

4.1 丙酮：分析纯。

4.2 正己烷：色谱纯。

4.3 异丙醇：色谱纯。

4.4 水：色谱纯。

4.5 冰醋酸：色谱纯。

4.6 1%冰醋酸溶液：1mL冰醋酸用色谱纯水定容到100mL。

4.7 磷脂酰胆碱：标准物质，纯度≥99%。

4.8 磷脂酰乙醇胺：标准物质，纯度≈99%。

4.9 磷脂酰肌醇：标准物质，纯度≥98%。

4.10 流动相：正己烷/异丙醇/1%冰醋酸溶液(8:8:1，V/V/V)。

5 仪器与设备

实验室常用仪器及下述特殊设备：

5.1 分析天平：精度为0.001 g。

5.2 旋涡振荡器。

5.3 台式离心机。

5.4 充了氮气的氮气瓶。

5.5 刻度吸管：0.1mL，0.5mL。

5.6 容量瓶：5mL，10mL，100mL。

5.7 10mL带塞刻度试管。

5.8 液相色谱仪，带进样系统、紫外检测器和数据处理器。

5.9 液相色谱柱：Si-60柱子，填料粒度为5μm。长度200-250mm，直径4-4.6mm。

6 分析步骤

6.1 液相系统的平衡

进样分析前，用流动相平衡液相系统，控制流速为 0.2mL/min ，保证基线平稳，样品的保留时间稳定。

6.2 标准溶液的配制

准确取20mg 磷脂酰胆碱、20mg 磷脂酰乙醇胺与10mg 磷脂酰肌醇，用正己烷/异丙醇/1%冰醋酸溶液(8:8:1,V/V/V)溶解并定容到10mL ，配制磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的混合标准溶液，使溶液中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇浓度分别的2mg/mL 、2mg/mL 、1mg/mL 。准确吸取此溶液0.25、1.25、2.50、3.75、5.00mL ，并用正己烷/异丙醇/1%冰醋酸溶液(8:8:1，V/V/V)定容到5mL ，使溶液中磷脂酰胆碱的最终浓度为0.1~2.0mg/mL ，磷脂酰乙醇胺的最终浓度为0.1~2.0mg/mL ，磷脂酰肌醇的最终浓度为0.05~1.0mg/mL 。-20℃保存备用，保存时注意容器口的密封。

注：假如标样为氯仿或甲醇的溶液，必须将其中的溶剂用氮气小心吹干，再用流动相溶解定容。

6.3 标准曲线的制作

以微量注射器分别取不同浓度的磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇混合标准溶液10μL 注入液相色谱中。以样品各组分浓度为横坐标，各组分峰面积为纵坐标，分别绘制磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇三种组分的标准工作曲线。

6.4 样品前处理

测试样品应放在密闭和防潮的容器内。取样后剩余样品应储存在同样的容器中，以备下次测试时再取。样品在使用前需充分混匀。

准确称取样品30 mg (称量精确至0.001 g)于10mL 带塞刻度离心管中，加入丙酮8mL ，旋涡振荡2min ，3000r/min 离心10min ，使不溶于丙酮的磷脂组分完全沉淀。小心倾出上层液体，并用氮气吹干剩余残液，用正己烷/异丙醇/1%冰醋酸溶液(8:8:1，V/V/V)溶解并定容到5mL 。-20℃保存备用，保存时注意容器口的密封。

6.5 测定

6.5.1 色谱条件：Lichrosorb Si-60柱子（250×4.6mm i.d.），填充物粒度5μm 。流动相流速 1mL/min ，柱温35℃，紫外检测波长205nm 。不同系统、不同型号柱子调整流速，达到最佳工作条件。

6.5.2 进样：准确取10μL 测定液，注入液相色谱仪，取试样的面积与工作曲线比较定量。对同一样品至少进行两次测定。

7 结果计算

试样中磷脂酰胆碱、磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇的含量以各组分的质量与试样原有质量的质量百分比表示，其计算公式为：

X （%）=

式中：X 是样品中磷脂酰胆碱（或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）的含量；

C 是由磷脂酰胆碱（或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）工作曲线上查出的试样测定

液中磷脂酰胆碱（或磷脂酰乙醇胺、磷脂酰肌醇）的浓度，单位为mg/ mL ；

5是样品的体积，单位为mL ；

m 是样品的总质量，单位为mg 。

如果两次测定的结果符合8.1中给定的重复性要求，则取两次测定的算术平均值作为结果。如果不符合重复性要求，需对同一样品重新进行两次测定。

C×5 m ×100%

8 精密度与回收率

8.1 重复性

同一个分析者使用同样的方法在同一个实验室内使用同样仪器设备对同一试样同时或

连续进行两次测定的结果相对偏差不得大于5%。

8.2 再现性

不同的分析者使用同样的方法在不同的实验室内使用不同的仪器设备对同样的样品进

行两次测定的结果之差应不超过10%。

8.3 回收率实验

定量移取PC标样10μL于刻度试管中，N2吹干后加入1mg PI 标样与1mg PE标样，然后定

量加入已处理完毕并已知PC、PE、PI浓度的样品2.5mL，用正己烷/异丙醇/1%冰醋酸溶液(8:8:1，V/V/V)定容到5mL。混匀后在相同的色谱条件下进样10μL，测定PC、PE、PI的回收率。

测定的PC(或PE、PI)的质量

回收率（%）= ×100% 已知的原样中PC(或PE、PI)的质量＋加入的PC(或PE、PI)的质量