分光光度法的特点
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SO42-、Hg2+---6) 药物含量测定—比吸光系数定量；荷移
光谱法测定. 7) 紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、
SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、蛋白质等。
18
2. 多组分的测定
a) 在1处测组分x, 在2处测组分y
b) 在1处测组分x; 在2处测总吸
收,扣除x吸收,可求y
c) x,y组分不能直接测定
A1=x1bcx+ y1bcy(在1处测得A1) A2 =x2bcx+ y2bcy(在2处测得A2)
x1, y1, x2, y2由x,y标液 在1, 2处分别测得
19Байду номын сангаас
3. 光度滴定
NaOH滴定 对硝基酚 间硝基酚
O
助色团－NH2，－OH，－X （孤对电子）ne
5
： ：： ：
OO型：
有机显色剂
OH COOH
磺基水杨酸
SO3H
NN型：
邻二 CH3－C＝－＝C－CH3 丁二
N
N
氮菲
HO－N N－OH 酮肟
ON型：
NN
N
OH PAR
S型：
OH NH NH
S NN
双硫腙
6
显色反应的选择
*灵敏度高，一般ε>104
*选择性好 *显色剂在测定波长处无明显吸收。
例1 邻二氮菲光度法测铁
(Fe)=1.0mg/L, b=2cm , A=0.38
计算 和
E 1% 1cm
解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3/55.85 =1.8×10-5mol/L
=
0.38 2 1.8 ×10-5
= 1.1104L
mol-1
cm-1
1
A
=
E 1% 1cm
4. 干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时： 1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比. 2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.
16
8.5 吸光光度法的应用
1. 单一组分测定
1) 金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟, Co-钴试剂
2) 磷的测定: DNA中含P～9.2%, RNA中含P～9.5%,
8
2. 显色反应酸度（c(M)、 c(R)一定）
pH pH1<pH<pH2
9
邻二氮菲－亚铁反应完全度与pH的关系
Fe2++3R β3
柠檬酸 A H＋ H＋
FeR3
β3＝1021.3
c(R)≈[R´]=10-4mol·L-1
3'
[FeR3 ] [Fe'][R']3
3 3
Fe(A) R(H)
bc
c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4g/100mL
E11c%m = 0.38/2.010-4 = 1.9103
or
E1% 1cm
=
10
/M
=
1.1105
/55.85
=
1.9
103
2
二. 准确度—仪器测量误差
光度计的读数误 差一般为 0.2～2％(ΔT), 由于T与浓度c 不是线性关系， 故不同浓度时 的ΔT引起的误 差不同。
Ni2+, Fe2+
NiR,FeR
Ni2+ , Fe2+
测Fe3＋:(控制pH)
pH 2.5 Fe3+, Cu2+
SS FeSS （紫红） Cu2+
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰， 则需采取分离法。
14
2. 物理法
—选择适当的测定波长
钍-偶氮砷III A
钴-亚硝基红盐 A
试剂
络合物
络合物
试剂
0.434
实际工作中，应控制T在10～70％,
A在0.15～1.0之间 (调c, b, )
4
8.4 显色反应与分析条件的选择
8.4.1 显色剂与显色反应
无机显色剂: SCN- [Fe(SCN)]2+
H2O2 [TiO·H2O2]2+
有机显色剂:
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N （共轭双键）πe
可得核酸量.
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄(小)
Sn2+
磷钼(V)蓝(大)
17
3) 蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等 4) 氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物) 5) 水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、
lg
[FeR3 [Fe']
]
lg
3
lgFe(A)
3
lgR(H)
3 lg[R']
10
lg [FeR3 ] [Fe]
pH3～8为适宜 的酸度范围
11
3. 显色温度及显色时间
A
T2(℃)
T1(℃)
t(min)
另外，还有介质条件、有机溶剂、 表面活性剂等
12
8.4.3 干扰及消除
1.化学法
测Co2＋(含Fe3+) : (掩蔽法)
Co2＋, Fe3+
⑴NaF
Co2+ FeF63-
SCN－ Co(SCN)2 (蓝)
(2)Sn2+
Co2+ Fe2+,Sn4+
SCN－ Co(SCN)2
13
测Co2＋ :(生成络合物性质不同)
Co2+, Zn2+, 钴试剂R CoR,ZnR H+ CoR, Zn2+ ,
515 655
415 500
15
-- 选择适当的参比溶液
1. 仅络合物有吸收，溶剂作参比。 如 phen—Fe2+ 标准曲线
2.待测液也有吸收，被测液作参比。 如 测汽水中的 Fe
3. 显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。
pKa=7.15 pKa=8.39
pKa =1.24
间硝基酚 对硝基酚
酸形均 无色.
碱形均 黄色
V1
V2
V(NaOH)/mL
20
典型的光度滴定曲线
依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。
滴定剂吸收
被滴物吸收
Vsp
滴定剂与待 测物均吸收
T%
c1 c1
>
c2 c2
<
c3 c3
100
T-透光率读数误差
80
60
40 T
20
0
T
c1
c2
c c3
3
浓度测 Er 10
量的相
8
对误差
与T(或A) 6
的关系
4
c 0.434T Er c T lgT (T 0.01)
2
0
20(36.8)40 60 80 T%
0.7 0.4 0.2 0.1 A
对照性好, λmax>60 nm .
*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。 *显色条件易于控制，重现性好。
7
8.4.2 显色条件的确定 1. 显色剂用量（c(M)、pH一定）
c(R)
c(R)
Mo(SCN)32+ 浅红 Mo(SCN)5 橙红 Mo(SCN)6- 浅红
c(R)
Fe(SCN)n3-n
光谱法测定. 7) 紫外吸收(UV): NO2-、NO3-、SO42-、
SO32-、CO32-、SCN-、酪氨酸、色氨酸、 苯丙氨酸、蛋白质等。
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2. 多组分的测定
a) 在1处测组分x, 在2处测组分y
b) 在1处测组分x; 在2处测总吸
收,扣除x吸收,可求y
c) x,y组分不能直接测定
A1=x1bcx+ y1bcy(在1处测得A1) A2 =x2bcx+ y2bcy(在2处测得A2)
x1, y1, x2, y2由x,y标液 在1, 2处分别测得
19Байду номын сангаас
3. 光度滴定
NaOH滴定 对硝基酚 间硝基酚
O
助色团－NH2，－OH，－X （孤对电子）ne
5
： ：： ：
OO型：
有机显色剂
OH COOH
磺基水杨酸
SO3H
NN型：
邻二 CH3－C＝－＝C－CH3 丁二
N
N
氮菲
HO－N N－OH 酮肟
ON型：
NN
N
OH PAR
S型：
OH NH NH
S NN
双硫腙
6
显色反应的选择
*灵敏度高，一般ε>104
*选择性好 *显色剂在测定波长处无明显吸收。
例1 邻二氮菲光度法测铁
(Fe)=1.0mg/L, b=2cm , A=0.38
计算 和
E 1% 1cm
解： c(Fe)=1.0 mg/L=1.0×10-3/55.85 =1.8×10-5mol/L
=
0.38 2 1.8 ×10-5
= 1.1104L
mol-1
cm-1
1
A
=
E 1% 1cm
4. 干扰组分与显色剂有反应,又无法掩蔽消除时： 1）掩蔽被测组分，再加入显色剂，作参比. 2）加入等量干扰组分到空白溶液中,作参比.
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8.5 吸光光度法的应用
1. 单一组分测定
1) 金属离子: Fe-phen, Ni-丁二酮肟, Co-钴试剂
2) 磷的测定: DNA中含P～9.2%, RNA中含P～9.5%,
8
2. 显色反应酸度（c(M)、 c(R)一定）
pH pH1<pH<pH2
9
邻二氮菲－亚铁反应完全度与pH的关系
Fe2++3R β3
柠檬酸 A H＋ H＋
FeR3
β3＝1021.3
c(R)≈[R´]=10-4mol·L-1
3'
[FeR3 ] [Fe'][R']3
3 3
Fe(A) R(H)
bc
c =1.0mg/L=1.0×10-3 g /1000mL = 1.0×10-4g/100mL
E11c%m = 0.38/2.010-4 = 1.9103
or
E1% 1cm
=
10
/M
=
1.1105
/55.85
=
1.9
103
2
二. 准确度—仪器测量误差
光度计的读数误 差一般为 0.2～2％(ΔT), 由于T与浓度c 不是线性关系， 故不同浓度时 的ΔT引起的误 差不同。
Ni2+, Fe2+
NiR,FeR
Ni2+ , Fe2+
测Fe3＋:(控制pH)
pH 2.5 Fe3+, Cu2+
SS FeSS （紫红） Cu2+
如不能通过控制酸度和掩蔽的办法消除干扰， 则需采取分离法。
14
2. 物理法
—选择适当的测定波长
钍-偶氮砷III A
钴-亚硝基红盐 A
试剂
络合物
络合物
试剂
0.434
实际工作中，应控制T在10～70％,
A在0.15～1.0之间 (调c, b, )
4
8.4 显色反应与分析条件的选择
8.4.1 显色剂与显色反应
无机显色剂: SCN- [Fe(SCN)]2+
H2O2 [TiO·H2O2]2+
有机显色剂:
生色团：－N＝N－，－N＝O，
O
C=S,－N （共轭双键）πe
可得核酸量.
H3PO4+12(NH4)2MoO4+21HNO3
=(NH4)3PO4·12MoO3+12NH4NO3+12H2O
磷钼黄(小)
Sn2+
磷钼(V)蓝(大)
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3) 蛋白质测定—溴甲酚绿、考马司亮蓝等 4) 氨基酸测定—茚三酮(紫色化合物) 5) 水质检测: NH4+、NO2-、Mn2+、Fe2+、
lg
[FeR3 [Fe']
]
lg
3
lgFe(A)
3
lgR(H)
3 lg[R']
10
lg [FeR3 ] [Fe]
pH3～8为适宜 的酸度范围
11
3. 显色温度及显色时间
A
T2(℃)
T1(℃)
t(min)
另外，还有介质条件、有机溶剂、 表面活性剂等
12
8.4.3 干扰及消除
1.化学法
测Co2＋(含Fe3+) : (掩蔽法)
Co2＋, Fe3+
⑴NaF
Co2+ FeF63-
SCN－ Co(SCN)2 (蓝)
(2)Sn2+
Co2+ Fe2+,Sn4+
SCN－ Co(SCN)2
13
测Co2＋ :(生成络合物性质不同)
Co2+, Zn2+, 钴试剂R CoR,ZnR H+ CoR, Zn2+ ,
515 655
415 500
15
-- 选择适当的参比溶液
1. 仅络合物有吸收，溶剂作参比。 如 phen—Fe2+ 标准曲线
2.待测液也有吸收，被测液作参比。 如 测汽水中的 Fe
3. 显色剂或其他试剂也有吸收，空白溶液作参比 例:邻二氮菲光度法测Li2CO3中的 Fe，
参比溶液为不含Li2CO3样品的所有试剂。
pKa=7.15 pKa=8.39
pKa =1.24
间硝基酚 对硝基酚
酸形均 无色.
碱形均 黄色
V1
V2
V(NaOH)/mL
20
典型的光度滴定曲线
依据滴定过程中溶液吸光度变化来确定终点的滴定分析方法。
滴定剂吸收
被滴物吸收
Vsp
滴定剂与待 测物均吸收
T%
c1 c1
>
c2 c2
<
c3 c3
100
T-透光率读数误差
80
60
40 T
20
0
T
c1
c2
c c3
3
浓度测 Er 10
量的相
8
对误差
与T(或A) 6
的关系
4
c 0.434T Er c T lgT (T 0.01)
2
0
20(36.8)40 60 80 T%
0.7 0.4 0.2 0.1 A
对照性好, λmax>60 nm .
*反应生成的有色化合物组成恒定，稳定。 *显色条件易于控制，重现性好。
7
8.4.2 显色条件的确定 1. 显色剂用量（c(M)、pH一定）
c(R)
c(R)
Mo(SCN)32+ 浅红 Mo(SCN)5 橙红 Mo(SCN)6- 浅红
c(R)
Fe(SCN)n3-n