弹性蛋白酶
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（—）原料
利用微生物生产酶制剂的主要原料为碳源和氮源， 此外还有无机盐、生长因素和产酶促进剂等。
如果添加少量某种物质就能明显增加酶的产量时， 这类物质通称为产酶促进剂。它们大多属于酶的诱导 物或表面活性剂。
1、固体培养法
固体培养法亦称麸曲培养法 ，该法是利用麸皮 或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼 等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基 。
（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即 取材。
从动物或植物中提取酶受到原料的限制，随着酶 应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已 逐渐转向微生物。用微生物发酵法生产药用酶，不 受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高， 成本低，能大规模生产。
13.4.1.2微生物酶制剂高产菌株的选育
13.4 酶类药物
13.4.1 酶类药物的原料来源 13.4.1.1原料选择
选用原料应注意以下几点: （1）不同酶的用料选择：
（2）注意不同生长发育情况及营养状况, 用微生 物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。用动物器官 提取酶，则与动物年龄及饲养条件有关。
（3）从原料来源是否丰富考虑；
（4）从简化提纯步骤着手
酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、 多糖、脂类和核酸等 。
（1）pH和加热沉淀法
（2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的 差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡， 可以除去杂蛋白。
（3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。
甚至可用2.5%三氯乙酸处理。 （4）核酸沉淀剂法
13.4.2酶类药物的提取和纯化 13.4.2.1生物材料的预处理 （一）动物材料的预处理
1、机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎 。有的酶必须细胞
破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆 器和组织捣碎器。
2、反复冻融 冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多
次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度 的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使 某些酶释放出来。
（2）pH 可用糖或淀粉调节，pH低则可用氨来调节。
（3）通气（供氧）临界氧浓度 。氧必须是溶解 于培养基中的氧 。
（4）搅拌 增加液体湍流速度 ，减少气泡周围液 膜厚度 。有利于促进细胞的新陈代谢。
（5）泡沫和消沫剂 由于培养基中蛋白质分子排 在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故 。
（6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶的合成， 诱导酶是该酶作用底物或者是其类似物。抑制剂 促进酶的形成 。加入适量表面活性剂 。
用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便 于离心分离。
用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸 链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。
（四）有机溶剂法 有机溶剂沉淀蛋白质的能力为丙酮＞异丙醇＞乙
醇＞甲醇 。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。 （五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂
喷雾干燥用于干燥菌体，药用酶常用冷冻干燥。
13.4.2.4、酶的纯化
评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活 力回收。
酶在纯化过程中的一些技术难点：
（一）杂质的除去
盐浓度一般以等渗为好，相当于0.15mol／L NaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。
2、有机溶剂法
某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂 质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶 变性，最常用的有机溶剂是丁醇。
3、表面活性剂法
表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故 可用于提取结合酶。
菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。与增加品 种、缩短生产周期、改进发酵和提炼工艺条件等密切 相关。
优良菌种的获得有三条途径：
①是从自然界分离筛选：
②是用物理或化学方法处理、诱变；
③是用基因重组与细胞融合技术。因此微生物的分离 筛选是一切工作的基础。
13.4.1.3微生物酶制剂生产的发酵技术
首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、 pH和通气量等。还要研究酶的分离提纯技术和制备 工艺。
（二）微生物的预处理
要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵 液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁， 制成无细胞的悬液后再行提取。
菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存。
干燥法，因为干燥常能导致细胞自溶，增加酶的 释放，从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期 目的。
1、干燥法： ①空气干燥 25～30℃ ②真空干燥 还 原剂作保护剂 ③冷冻干燥对较敏感的酶宜 用此法。
Baidu Nhomakorabea 3、丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减 少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎使蛋白质与 脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到 溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于 0.0lmol／L，pH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅 拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃无水丙酮内，10 分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次， 真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。
2、机械法：常用的方法有研磨法，组织匀浆法， 超声波法，高压匀浆法等。
3、酶法处理
用得最多的是溶菌酶，如在37℃，pH8.0下对小 球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核酸酶。 也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。
13.4.2.2酶的提取
1、水溶液法
常用稀盐溶液或缓冲液提取。一般在低温下操作。 在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。一般来 说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性 溶液提取。
13.4.2.3酶制剂的工业提取法
（一）发酵液的预处理及过滤 微生物发酵液的分离，过滤，发酵液中加絮凝剂
或凝固剂 。絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷 氨酸 。 （二）酶液的脱色
活性炭、脱色树脂 。 （三）盐析法
用得最多的是（NH4）2SO4，在常温下不会造成 酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。
2、液体培养法
液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁 殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液 体表面培养和液体深层培养两种。
3、影响酶产生的一些因素
菌种的产酶性能是决定发酵效果的重要因素，但 是发酵工艺条件对产酶的影响也是十分明显的。
（1）温度 一般发酵温度比种子培养时略高些，这 样对产酶有利。
利用微生物生产酶制剂的主要原料为碳源和氮源， 此外还有无机盐、生长因素和产酶促进剂等。
如果添加少量某种物质就能明显增加酶的产量时， 这类物质通称为产酶促进剂。它们大多属于酶的诱导 物或表面活性剂。
1、固体培养法
固体培养法亦称麸曲培养法 ，该法是利用麸皮 或米糠为主要原料，另外视需要添加其它谷糠、豆饼 等，加水拌成含水适度的半固态物料作为培养基 。
（5）如用动物组织作原料，则此动物宰杀后应立即 取材。
从动物或植物中提取酶受到原料的限制，随着酶 应用日益广泛和需求量的增加，工业生产的重点已 逐渐转向微生物。用微生物发酵法生产药用酶，不 受季节、气候和地域的限制，生产周期短，产量高， 成本低，能大规模生产。
13.4.1.2微生物酶制剂高产菌株的选育
13.4 酶类药物
13.4.1 酶类药物的原料来源 13.4.1.1原料选择
选用原料应注意以下几点: （1）不同酶的用料选择：
（2）注意不同生长发育情况及营养状况, 用微生 物制酶，故需测其活力来决定取酶阶段。用动物器官 提取酶，则与动物年龄及饲养条件有关。
（3）从原料来源是否丰富考虑；
（4）从简化提纯步骤着手
酶提取液中，除所需酶外，还含有大量的杂蛋白、 多糖、脂类和核酸等 。
（1）pH和加热沉淀法
（2）蛋白质表面变性法 利用蛋白质表面变性性质的 差别，也可除去杂蛋白，加入氯仿和乙醇进行震荡， 可以除去杂蛋白。
（3）选择性变性法 利用蛋白质稳定性的不同，除去杂蛋白。
甚至可用2.5%三氯乙酸处理。 （4）核酸沉淀剂法
13.4.2酶类药物的提取和纯化 13.4.2.1生物材料的预处理 （一）动物材料的预处理
1、机械处理 用绞肉机绞，一般细胞并不破碎 。有的酶必须细胞
破碎后才能有效地提取，在实验室常用的是玻璃匀浆 器和组织捣碎器。
2、反复冻融 冷到-10℃左右，再缓慢溶解至室温，如此反复多
次。由于细胞中冰晶的形成，及剩下液体中盐浓度 的增高，能使细胞中颗粒及整个细胞破碎，从而使 某些酶释放出来。
（2）pH 可用糖或淀粉调节，pH低则可用氨来调节。
（3）通气（供氧）临界氧浓度 。氧必须是溶解 于培养基中的氧 。
（4）搅拌 增加液体湍流速度 ，减少气泡周围液 膜厚度 。有利于促进细胞的新陈代谢。
（5）泡沫和消沫剂 由于培养基中蛋白质分子排 在气泡表面形成一层吸附膜，聚集成泡沫层之故 。
（6）添加诱导剂和抑制剂 诱导酶诱导酶的合成， 诱导酶是该酶作用底物或者是其类似物。抑制剂 促进酶的形成 。加入适量表面活性剂 。
用核酸酶，将核酸降解成核苷酸，使粘度下降便 于离心分离。
用核酸沉淀剂如三甲基十六烷基溴化铵、硫酸 链霉素、聚乙烯亚胺、鱼精蛋白和二氯化锰等。
（四）有机溶剂法 有机溶剂沉淀蛋白质的能力为丙酮＞异丙醇＞乙
醇＞甲醇 。工业上通常采用乙醇作为沉淀剂。 （五）喷雾干燥直接制备粉末酶制剂
喷雾干燥用于干燥菌体，药用酶常用冷冻干燥。
13.4.2.4、酶的纯化
评价纯化工艺主要看二个指标，一是酶比活，二是总活 力回收。
酶在纯化过程中的一些技术难点：
（一）杂质的除去
盐浓度一般以等渗为好，相当于0.15mol／L NaCl的离子强度是最适宜于酶的提取。
2、有机溶剂法
某些结合酶如微粒体和线粒体膜的酶，由于和脂 质牢固结合，为此必须除去结合的脂质，且不能使酶 变性，最常用的有机溶剂是丁醇。
3、表面活性剂法
表面活性剂能与蛋白质结含而分散在溶液中，故 可用于提取结合酶。
菌种是工业发酵生产酶制剂的重要条件。与增加品 种、缩短生产周期、改进发酵和提炼工艺条件等密切 相关。
优良菌种的获得有三条途径：
①是从自然界分离筛选：
②是用物理或化学方法处理、诱变；
③是用基因重组与细胞融合技术。因此微生物的分离 筛选是一切工作的基础。
13.4.1.3微生物酶制剂生产的发酵技术
首先要合理选择培养方法、培养基、培养温度、 pH和通气量等。还要研究酶的分离提纯技术和制备 工艺。
（二）微生物的预处理
要是酶是胞外酶，则可除去菌体后再直接从发酵 液中吸附提取酶。但对胞内酶则需将菌体细胞破壁， 制成无细胞的悬液后再行提取。
菌体用生理盐水洗涤除去培养基后，应深冻保存。
干燥法，因为干燥常能导致细胞自溶，增加酶的 释放，从而在后处理中破壁不必太剧烈就能达到预期 目的。
1、干燥法： ①空气干燥 25～30℃ ②真空干燥 还 原剂作保护剂 ③冷冻干燥对较敏感的酶宜 用此法。
Baidu Nhomakorabea 3、丙酮粉
组织经丙酮迅速脱水干燥制成丙酮粉，不仅可减 少酶的变性，同时因细胞结构成份的破碎使蛋白质与 脂质结合的某些化学键打开，促使某些结合酶释放到 溶液中，常用的方法是将组织糜或匀浆悬浮于 0.0lmol／L，pH6.5的磷酸缓冲液中，在0℃下一边搅 拌，一边徐徐倒入10倍体积的-15℃无水丙酮内，10 分钟后，离心过滤取其沉淀物，反复用冷丙酮洗几次， 真空干燥即得丙酮粉。丙酮粉在低温下可保存数年。
2、机械法：常用的方法有研磨法，组织匀浆法， 超声波法，高压匀浆法等。
3、酶法处理
用得最多的是溶菌酶，如在37℃，pH8.0下对小 球菌进行破壁处理，历时15分钟，即可提取核酸酶。 也有用脱氧核糖核酸酶处理，操作与溶菌酶同。
13.4.2.2酶的提取
1、水溶液法
常用稀盐溶液或缓冲液提取。一般在低温下操作。 在酸性条件下稳定的酶要在酸性条件下提取。一般来 说，碱性蛋白酶用酸性溶液提取，酸性蛋白酶用碱性 溶液提取。
13.4.2.3酶制剂的工业提取法
（一）发酵液的预处理及过滤 微生物发酵液的分离，过滤，发酵液中加絮凝剂
或凝固剂 。絮凝剂有聚丙烯酰胺、右旋糖酐和聚谷 氨酸 。 （二）酶液的脱色
活性炭、脱色树脂 。 （三）盐析法
用得最多的是（NH4）2SO4，在常温下不会造成 酶的失活，若分级沉淀应用得当，杂蛋白杂质也较少。
2、液体培养法
液体培养法是利用液体培养进行微生物的生长繁 殖和产酶。根据通气（供氧）方法的不同，又分为液 体表面培养和液体深层培养两种。
3、影响酶产生的一些因素
菌种的产酶性能是决定发酵效果的重要因素，但 是发酵工艺条件对产酶的影响也是十分明显的。
（1）温度 一般发酵温度比种子培养时略高些，这 样对产酶有利。