试验8单向琼脂免疫扩散试验
单相琼脂扩散试验的临床意义
单相琼脂扩散试验的临床意义
引言：
单相琼脂扩散试验是一种常见的临床检测方法，它可以通过测量琼脂扩散的速度来判断人体内某些物质的浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。
本文将从理论原理、实验方法和临床应用三个方面来探讨单相琼脂扩散试验的临床意义。
理论原理：
单相琼脂扩散试验是基于弗里德曼定律的原理而设计的。
弗里德曼定律指出，在一定温度下，溶质在溶剂中的扩散速度与其浓度成正比，与扩散距离成反比。
因此，通过测量琼脂扩散的速度，可以推算出溶质的浓度。
实验方法：
单相琼脂扩散试验的实验方法相对简单，只需要将待测物质加入琼脂中，然后观察琼脂扩散的速度即可。
通常情况下，实验会在恒定的温度和湿度下进行，以保证实验结果的准确性。
此外，实验中还需要控制琼脂的厚度和形状，以确保实验结果的可比性。
临床应用：
单相琼脂扩散试验在临床上有着广泛的应用。
例如，在肝功能检测中，可以通过单相琼脂扩散试验来测量血清中胆红素的浓度，从而判断肝
功能是否正常。
此外，在肾功能检测中，单相琼脂扩散试验也可以用
来测量血清中肌酐的浓度，从而判断肾功能是否正常。
此外，单相琼
脂扩散试验还可以用来检测血液中的葡萄糖、脂肪、蛋白质等物质的
浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。
结论：
单相琼脂扩散试验是一种简单、快速、准确的临床检测方法，它可以
用来测量人体内某些物质的浓度，从而为临床诊断提供重要的参考依据。
在未来，随着科技的不断发展，单相琼脂扩散试验将会有更广泛
的应用，为人类健康事业做出更大的贡献。
免疫及答案
医学检验专业《临床医学检验基础》试题姓名：学校：得分单项选择题，每题2分1 ELISA中最常用的固相载体是A.聚氯乙烯B.聚苯乙烯C.三聚氧胺D.尼龙膜E.硝酸纤维素膜答案：B2. 检测总补体活性，采用50%溶血试验是因为 A.50%溶血试验比100%溶血试验简单 B.以50%溶血作为终点较100%溶血作为终点更敏感C.以50%溶血作为终点较100%溶血作为终点可节约时间D.ABC均不对 E.ABC均对答案：B3. 环状沉淀试验中要求 A.抗原澄清 B.抗体澄清 C.抗原和抗体都必须澄清 D.对抗原和抗体没有特别要求 E.抗原可以不澄清答案：C4. 补体结合试验的指标系统包括 A.特异性抗体和补体 B.特异性抗原和补体 C.红细胞和溶血素 D.加热灭活的病人血清 E.溶血素和人血清答案：C5 血清学试验的前带现象是指 A.抗体过量 B.抗原过量 C.凝集明显 D.沉淀物明显 E.溶血明显答案：A6. 单向琼脂扩散法是将相应的 A.抗体均匀地混入琼脂糖凝胶内制板B.抗原均匀地混入琼脂糖凝胶内制板C.补体均匀地混入琼脂糖凝胶内制板 D.抗原抗体复合物均匀地混入琼脂糖凝胶内制板 E.溶血素均匀地混入琼脂糖凝胶内制板答案：A7单向琼脂扩散试验常用于 A.定性测定 B.定量测定 C.定性和定量测定 D.定性和半定量测定 E.半定量测定答案：B8、成人血清中出现哪一种免疫球蛋白增高提示可能有新近感染（）A、IgGB、IgAC、IgMD、IgEE、IgD 答案 C9. 血清中含量最高的免疫球蛋白是A、IgGB、IgDC、IgMD、IgAE、IgE 答案：A10.抗体一般是BA、单价的B、双价的C、三价的D、四价的答案：B11.须与蛋白质载体结合才具有免疫原性的是A、超抗原B、变应原C、半抗原D、耐受原E、完全抗原答案C12.来源于其他物种的抗原物质称为A、完全抗原B、异种抗原C、同种异型抗原D、自身抗原E、半抗原答案：B13.具有特异杀伤作用的淋巴细胞是 A、NK细胞 B、K细胞 C、B细胞 D、Tc细胞答案：D14．抗原分子诱导社会成员主产生免疫应答的能力称为A．宿主反应性 B．免疫原性 C．免疫反应性 D．抗原刺激性 E．以上均不对【答案】B15．免疫学主要研究的是 A．机体排除抗原性异物的功能 B．机体消除损伤和衰老细胞的功能 C．机体识别、杀灭与消除自身突变细胞的功能 D．机体自我识别和排除抗原性异物的功能 E．A+B+C 【答案】D16．人的IgM分子主要特征是A．通过经典途径激活补体 B．能通过胎盘 C．成人接受抗原刺激后最先出现的抗体 D．比IgG移向阳极快 E．血清含量最高【答案】C17．补体活化经典途径开始于 A．C1的活化 B．C2的活化 C．C3的活化 D．C4的活化 E．C5的活化【答案】A18.凝集反应形成的反应现象A.肉眼可见B.肉眼不可见C.必须用精密仪器测定D.必须染色才可见E.必须借显微镜答案：A19.凝集反应中的抗体称为A.毒素B.溶血素C.沉淀素D.凝集素E.类毒素答案：D20.抗原抗体分子结合的最适比例为最适比，此时A.上清中有少量游离抗体B.上清中有少量游离抗原C.上清中无游离抗原或抗体存在D.出现沉淀物是肉眼不可见的E.A+B均有答案：C21..血清学反应最适宜于的pH为A.2.5~4.5B.5~6C.6~8D.7~9E.不须最适pH答案：C22.Ⅲ型变态反应是由于A.免疫复合物沉积在局部组只引起的免疫反应B.IgG沉积在局部组织引起免疫反应C.补体C3沉积在局部组织引起免疫反应D.细胞黏附分子沉积在局部组织引起免疫反应E.C+D答案：A23.结核菌素皮肤试验用于检测A.Ⅰ型变态反应B.Ⅱ型变态反应C.Ⅲ型变态反应D.Ⅳ型变态反应E.Ⅴ型变态反应答案：D24.用单向琼脂扩散法检测时，沉淀环的大小与样品内抗原的含量成A.反比关系B.对数关系C.直线关系D.正比关系E.正弦关系答案：D25..获得性免疫包括A.吞噬细胞和吞噬作用B.皮肤和黏膜的屏障C.体液免疫和细胞免疫D.体液中的抗微生物物质E.A+B答案：C26.补体结合试验的指示系统包括：（C）A.特异性抗体和补体B.特异性抗原和补体C.红细胞和溶血素D.加热灭活的病人血清E补体和溶血素27.注射破伤风抗毒素属于DA.自动自然免疫，B.自动人工免疫，C.被动自然免疫D.被动人工免疫E.混合免疫28.凝集反应的抗原是（A）A.颗粒性抗原，B.可溶性抗原C.半抗原D.超抗原29.临床进行ABO血型鉴定最常采用的方法为BA.间接凝集反应B.玻片凝集法C.试管凝集法D间接凝集抑制反应30.下列属于沉淀反应的有（A）A.肥达氏反应，B.外-斐氏反应C.抗链球菌“O”试验D.Ascoli试验31.免疫学检验是研究免疫学技术及其在医学领域中的一门AA.应用学科B.研究学科C.基础学科D.临床学科32.RH血型不合的输血反应属于哪一种超敏反应BA.I型超敏反应BⅡ型超敏反应 C.Ⅲ型超敏反应. Ⅳ. 型超敏反应33.介导体液免疫的细胞是：BA..T细胞B.B细胞C.巨噬细胞D.肥大细胞E.NK细胞34.补体活化替代途径开始于BA.C1的活化B. C3的活化C. C2的活化D C4的活化E.C2+C3 的活化35.下列哪种免疫球蛋白特应性过敏症患者血清中浓度可升高（D）A.IgG B IgA C. IgM D. IgE E. IgD36.下列哪一类细胞产生IgG（B）A.T-淋巴细胞B.B 淋巴细胞C巨噬细胞D.嗜碱性细胞E.NK细胞37.将区带电泳和双向琼脂扩散相结合的免疫分析技术称为（C）A.对流免疫电泳B.火箭免疫电泳C.免疫电泳D.免疫转印技术电泳E.凝胶电泳38 临床中进行交叉配血试验常用的方法为（C）A.间接凝集反应B.玻片凝集法C试管凝集法D间接凝集抑制反应E.被动血凝法39.细胞免疫的抗感染作用体现在：AA.对细胞内寄生菌的防御作用B.中和作用C.对细菌的调理和吞噬作用，D对细菌的杀伤作用40.补体参与的反应不包括（D）A.溶菌反应B.溶血反应C.补体结合反应，D.免疫扩散反应41.在诱发抗体合成过程中，免疫记忆由以下细胞显示出来AA.B细胞B. 巨噬细胞CT细胞D.肥大细胞42.下列属于迟发型变态反应（D）A.输血反应B类风湿关节炎C哮喘D接触性皮炎43.间接凝集试验阳性（C）A.红细胞溶解B红细胞不溶解C.红细胞凝集D.红细胞不凝集44.血清学的后带现象是指（B）A.抗体过量B.抗原过量C. 抗体抗原过量D.凝集明显45.体外的抗原抗体反应可以表现为（C）A.吞噬反应B.中和毒素C.沉淀反应D.杀菌反应46.某些抗体虽丐其相应颗粒性抗原结合，但不出现凝集现象，这种抗体称为（D）A.抗抗体B超抗体C.半抗体D不完全抗体47.抗体主要由下面哪种细胞产生BA.嗜酸性粒细胞B.浆细胞C.肥大细胞D.吞噬细胞ET细胞48.具有特异性杀伤作用的淋巴细胞是（D）A.NK细胞B.K细胞C.B细胞D.TC细胞E.吞噬细胞49.．抗原抗体复合物吸引在一起依靠A．分子了间吸引力 B．流体静力吸引力 C．电吸引力 D．A+C E．B+C 【答案】A50.免疫防御功能低下的机体最容易发生BA 移植物排斥反应，B反复感染C自身免疫病D超敏反应E肿瘤。
单向琼脂扩散试验.
①抗原特异性与沉淀线形状的关系：在相邻两完全相同的抗原与抗体反应时，则可出现两单沉淀线的融合。反之，如相邻抗原完全不同时，则出现沉淀线之交叉；两种抗原部分相同时，则出现沉淀线的部分融合。见图2。
图2双扩散试验结果示意图
A：已知抗体a、b：阳性对照
c、d、e、f：被检材料
②抗原浓度与沉淀先导形状的关系：两相邻抗原浓度相同，形成对称相融合的沉淀线；如果两抗原浓度不同，则沉淀线不对称，移向低浓度的一边。见图3。
图3抗原特异性与沉淀线形状的关系
a、b：抗体A、A’、B：抗原
A、B完全不同A、A’部分相同
③温度对沉淀线的影响：在一定范围内，温度扩散快。通常反应在0-37℃下进行。在双向扩散时，为了减少沉淀线变形并保持其清晰度，可在37℃下形成沉淀线，然后置于室温或冰箱（4℃）中为佳。
2．待测血清：兔血清
3．阴性对照血清
4．其它：生理盐水、琼脂粉、载玻片、打孔器、微量进样器等。
四、实验方法
1．取一干净培养皿，倾注3.5—4.0毫升加热熔化的1%食盐琼脂制成琼脂板。
2．凝固后，用直径3毫米打孔Fra bibliotek，孔间距为5毫米。孔的排列方式如图1所示。
图1双向琼脂扩散原抗体孔位置示意图
3．用微量进样器于中央孔加抗体，于周围孔加各种抗原。加样时勿使样品外溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结果。
⑥时间对沉淀线的影响：沉淀线形成一般在1-3天出现，14-21天出现的数目最多。玻片法可在1-2小时出现，一般观察72小时，放量过久可出现沉淀线重合消失。
④琼脂浓度对沉淀线形成速度的影响：一般来说，琼脂浓度越大，沉淀线出现越慢。
⑤参加扩散的抗原与抗体间的距离对沉淀线形成的影响：抗原、抗体相距越远，沉淀线形成的越慢，所以在微量玻片法时，孔间距离以0.25-0.5cm为好，距离远影响反应速度。当然孔距过远，沉淀线的密度过大，容易发生融合，有碍对沉淀线数目的确定。
琼脂免疫扩散试验
目录
• 琼脂免疫扩散试验简介 • 试验材料和步骤 • 结果解读和影响因素 • 琼脂免疫扩散试验的应用 • 琼脂免疫扩散试验的改进和发展
趋势 • 参考文献
01
琼脂免疫扩散试验简介
定义和原理
定义
琼脂免疫扩散试验是一种基于抗原抗体反应的血清学检测方法，用于检测样品 中特定抗原或抗体的存在。
作为扩散介质，用于固定抗原 和抗体。
标记物
用于显示抗原抗体结合的可见 物质，如染料或荧光物质。
试验步骤
3. 加样
2. 凝胶制备
制备琼脂糖凝胶，并在适当位置 放置抗原点。
将抗体溶液加到凝胶的适当位置， 并确保不产生气泡。
4. 扩散
将凝胶在适宜的温度下孵育一定 时间，使抗体在凝胶中扩散。
1. 制备抗原和抗体
根据试验目的制备适量的抗原和 抗体溶液。
5. 结果观察
观察抗原抗体结合形成的可见带， 并根据结果进行解释。
注意事项
确保无菌操作
在试验过程中，应始终保持无菌操作以避免 污染。
避免气泡产生
在加样过程中应避免产生气泡，以免影响试 验结果。
控制温度和时间
确保凝胶孵育在适当的温度下进行，并控制 好时间，以保证试验结果的准确性。
拓展琼脂免疫扩散试验在临床诊断、食品 安全、环境监测等领域的应用范围，满足 更多实际需求。
06
参考文献
参考文献
[1] 赵丽, 赵丹, 赵宏伟,等. 琼脂免疫扩散试验在布鲁氏菌病诊断中的应用[J]. 中国地方病防治杂志, 2014, 29(4):3.
[2] 赵宏伟, 赵丽, 赵丹,等. 琼脂免疫扩散试验在布鲁氏菌病诊断中的应用[J]. 中国地方病防治杂志, 2014, 29(4):3.
免疫扩散技术——IgG测定
注意事项
扩散：
1. 在湿盒中进行。 2. 扩散时琼脂板应保持水平，以免
沉淀环变形，影响结果判定。 3. 若沉淀环不清晰，可用1%鞣酸浸
泡10min后再测量。
测量：
1. 测量沉淀环必须准确，否则会明显影响结果。 2. 当沉淀环不是正圆形时，应量取最大直径和最
小直径后取二者的平均值带入计算。 3. 每批实验均应同步绘制标准曲线。 4. 样品最好做复孔，取直径的平均值带入计算。
实验1: 免疫沉淀凝集技术
抗原-抗体反应
沉淀反应
背景
絮状沉淀试验 液体内沉淀试验
免疫浊度测定
单向扩散试验 凝胶内沉淀试验
双向扩散试验
凝集反应
直接凝集反应
间接血凝试验
间接凝集反应 胶乳凝集试验
明胶凝集试验
免疫扩散技术——IgG测定
实验原理
单向免疫扩散试验（single immunodiffusion test） • 将一定量抗体混匀于琼脂糖凝胶内
• 正常参考值：OD<0.17 • 结果易受多种大分子蛋白质的干扰，特异性差。 • 本试验还受温度变化如离心、洗涤时的温度的影
响很大，重复性差。 • CIC的检出可以为多种与自身免疫相关疾病提供
辅助诊断诊断指标，但由于方法上的问题，其测 定结果尚不能作为诊断疾病的敏感可靠的指标。
实验报告的要求
1. 内容：题目、实验原理、试剂及器材、 实验步骤、实验结果（注明样本编号和 原始数据）、讨论等。
试剂和器材
• RF检测试剂（商品化试剂） • RF阴性血清和阳性血清（试剂盒自带） • 黑色反应板、滴管、搅拌棒等
操作方法
1. 在黑色反应板上取3格，用滴管分 别加待测血清、阳性血清和阴性 血清各1滴，然后每格加入1滴致敏 胶乳颗粒试剂。
琼脂扩散试验的实验报告
琼脂扩散试验的实验报告实验目的：本实验旨在通过琼脂扩散试验来研究不同浓度的抗生素对细菌生长的影响，以及评估抗生素的抗菌活性。
实验原理：琼脂扩散试验是一种常用的抗菌活性测定方法。
在该试验中，细菌被接种到琼脂平板上，随后在平板上打孔并加入不同浓度的抗生素。
随着抗生素在琼脂中扩散，其周围的细菌生长受到抑制，形成透明或半透明的抑菌圈。
抑菌圈的直径可以作为抗生素抗菌活性的指标。
实验材料：1. 细菌培养物（大肠杆菌或金黄色葡萄球菌）2. 抗生素溶液（如青霉素、链霉素等）3. 琼脂培养基4. 培养皿5. 打孔器6. 移液枪7. 无菌操作器材实验步骤：1. 制备琼脂培养基，并在培养皿中倒入适量的培养基，待其凝固。
2. 将细菌培养物稀释至适当的浓度，然后均匀涂抹在琼脂平板上。
3. 使用打孔器在琼脂平板上打孔，孔的间距应保持一致。
4. 使用移液枪将不同浓度的抗生素溶液加入到孔中。
5. 将培养皿倒置，放入恒温培养箱中培养24-48小时。
6. 观察并记录抑菌圈的直径。
实验结果：实验结果显示，随着抗生素浓度的增加，抑菌圈的直径也相应增大。
这表明高浓度的抗生素具有更强的抗菌活性。
此外，不同种类的抗生素对同一细菌的抗菌效果也存在差异。
实验讨论：本实验结果与预期相符，说明琼脂扩散试验是一种有效的抗菌活性测定方法。
然而，实验中也存在一些局限性，例如抗生素的扩散速率可能受到琼脂厚度和孔间距的影响。
因此，在进行实验设计时，需要考虑这些因素以确保结果的准确性。
结论：通过本次琼脂扩散试验，我们成功地评估了不同浓度抗生素的抗菌活性，并观察到抑菌圈直径与抗生素浓度之间的正相关关系。
本实验为抗生素的筛选和抗菌效果评估提供了一种简单而有效的方法。
参考文献：[1] 张三. 微生物学实验技术[M]. 北京：科学出版社，2010.[2] 李四. 抗生素的抗菌活性测定方法[J]. 微生物学报，2015,55(3): 345-350.注：以上内容为示例文本，实际实验报告应根据实验结果和具体实验过程进行撰写。
单向双向免疫琼脂扩散
火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上， 可以查出待检样品中抗原的含量。
实验原理
标准品抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
不同病人抗原浓度测定
绘制标准曲线
实验方法
（一）标准曲线的制备
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。
实验
单向、双向免疫琼脂 扩散
沉淀反应
可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件 （适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼 可见的沉淀现象。
沉淀反应
环状沉淀反应
沉
淀
反
琼脂扩散试验
应
对流免疫电泳
电
双向扩散
＋
单向扩散
泳 技 术
絮状沉淀反应
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
实验-免疫沉淀反应简写版
Immunology
4. 小心打孔，勿使琼脂层脱离玻片，或底 层开裂；打孔要一次打到底，挑胶时要 细心，最好一次性挑出。
5. 加样加满即可，勿使液体溢出。 6. 为使沉淀线保持清晰度，可将已形成的
沉淀线琼脂板放在4℃冰箱。
Immunology
21
双向免疫扩散--人IgG检测
结果描述与分析
该法常用于分析血清蛋白种类。
Immunology
(immunoelectrophoresis)
3.
Immunology
免疫比浊(immunonephelometry)
一定量抗体中分别加入递增量的抗原， 经一定时间形成免疫复合物，液体混 浊。用浊度计测量反应体系的浊度， 可绘制标准曲线并依据浊度推算样品 中抗原含量。
几分钟至十几分钟 凝集块
沉淀反应 可溶性抗原 数小时至数天
沉淀物
Immunology
原理：
凝胶内沉淀试验
将可溶性抗原与相应分别放入凝胶（如琼脂、 琼脂糖等）内进行扩散，形成浓度梯度，在抗 原抗体浓度比例恰当的位置，形成肉眼可见的 免疫沉淀线、沉淀环。
分类：
①单向琼脂扩散试验(single gel diffusion test) ②双向琼脂扩散试验(double gel diffusion test）
将抗原和抗体分别加入琼脂板相对应的小孔 中，二者相互扩散、相遇，在比例合适处形成可 见的沉淀线。
Immunology
(double immunodiffusion)
Immunology
对流免疫电泳
当抗原和抗体在琼脂介质中电泳时 ， 由于抗体的 PI 比较高，在适当的 pH 值下， 抗体带正电荷而抗原带负电荷，故在电场中 抗体向阴极方向移动而抗原向阳极运动，直 至相遇后形成沉淀线
琼脂扩散实验
液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约2～3mm厚 的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打 孔器准确打孔，加热封底。
实验步骤
2．检测血清抗体时，中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗 原，周边孔滴加待检血清，但至少一孔加阳性血清，抗原和血 清的加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后，将琼脂平皿加 盖后平放于加盖的湿盒内，37℃温箱中孵育8～24h，观察并记 录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血 清最大稀释度为抗体效价。
实验原理
沉淀线的特征与位置： 1 2 3 抗原、抗体的特异性和浓度 抗原、抗体分子的大小 扩散率
实验原理
a.如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定 于两者的扩散系数。 b.如果抗原过多，则沉淀带向抗体偏移，反之亦然。
实验原理
c.
抗原分子量> 抗原分子量>抗体分子量
抗原分子量= 抗原分子量=抗体分子量
实验二 马立克氏病 琼脂扩散实验
鸡马立克氏病是由 鸡 马 立 克 氏 病 病 毒 MDV） （ MDV ） 引起的鸡的一种 肿瘤性传染病。 肿瘤性传染病。临床上以 消瘦、麻痹、皮肤和内脏 消瘦、麻痹、 出现肿瘤为主要特征。 出现肿瘤为主要特征。可 造成严重的经济损失， 造成严重的经济损失，是 世界养鸡业的主要疾 病之一。 病之一。
实验原理
A. B. C. D. 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移； 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀； 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动； 沉淀带一经形成，就像一道特异性的屏障一样，继续扩散而 来的相同的抗原抗体，只能是沉淀带加浓加厚，而不能再向 外扩散，但对其他抗原抗体系统则无屏障作用。
目的要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断的操作和结果判定方法 仪器与材料 器材：琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。 试剂：马立克氏病标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。 实验类型 单向单扩散、单向双扩散、双向单扩散、双向双扩散 双向双扩散
医学免疫学实验： 琼脂免疫扩散实验
第二次实验1：琼脂免疫扩散实验一、实验目的了解并掌握单向琼脂免疫扩散法和双向琼脂免疫扩散法。
二、实验原理1.网格学说可溶性抗原与相应抗体以合适的比例发生特异反应时，在一定温度和电解质存在的条件下，经过一定的时间，形成肉眼可见的沉淀物，称为沉淀反应。
沉淀反应的抗原可以是多糖、蛋白质、脂类等。
当抗原过剩或者抗体过剩时，只能形成微小的沉淀物。
2.单向琼脂免疫扩散法的基本原理在含有特异抗体的琼脂板中打孔，并在孔中加定量的抗原，抗原向周围扩散后与琼脂中抗体相结合，即形成白色沉淀环，其直径或面积与抗原浓度呈正相关。
同时，用标准抗原或国际参考蛋白制成标准曲线，可用以定量检测未知标本的抗原浓度（mg / ml 或IU / ml )。
3.双向琼脂免疫扩散法的基本原理双向扩散法是指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散而形成一定类型沉淀线的方法。
沉淀线的特征与位置不仅取决于抗原和抗体的特异性及相互间浓度比例，而且与其分子大小及扩散速度有关。
当抗原抗体存在多种系统时，可呈现多条沉淀线以至交叉反应。
三、实验材料1.单向琼脂免疫扩散法实验材料2％离子琼脂，载玻片，标准马抗人IgG 血清（抗体，工作标准参考蛋白，PBS ( pH 7.2,0.01M)，打孔器（孔径3mm）及打孔模板，微量加样器，湿盒（容器内湿纱布或泡沫塑料），单人份待检血清标本（浓度分别为1/30、1/40和1/50)2.双向琼脂免疫扩散法实验材料1％琼脂（生理盐水配制）管，每管约4ml载玻片；打孔器及打孔模板微量加样器及塑料吸头；抗原：0.5ug/ ml 牛血清白蛋白(BSA )、0.5ug/ ml 人血清白蛋白(HSA )；抗体：兔抗人血清白蛋白、兔抗牛血清白蛋白湿盒。
四、实验步骤（1）单向琼脂免疫扩散1按照玻片的大小，准备制作琼脂板所需要的1％离子琼脂，融化后置于56-60℃水浴锅中待用。
（分装其1/2量的2％盐水琼脂）。
稀释抗体，用pH7.2的PBS 稀释标准抗人IgG 抗体，终浓度为抗体效价的一倍。
教案第八章免疫学应用
抗原抗体反应的类型
1、凝集反应 ⑴直接凝集反应 ：颗粒性抗原与抗体直 接结合的反应。包括：玻片凝集反应、 试管凝集反应、微量凝集反应 抗原与抗体的含量用效价或滴度表示，抗原 抗体反应时， ⑵间接凝集反应 ：可溶性抗原与抗体的 结合不出现凝集现象，可事先将抗原或 抗体吸附在颗粒性载体表面，再与相应 抗体或抗原结合，就可出现凝集现象。
淋巴母细胞显微镜
2、体内免疫测定
1、Ⅰ型超敏反应皮 肤试验。 2、迟发型超敏反应 皮肤试验 阳性：机体免疫细胞正 常。阴性：细胞免疫 功能低下。 诊断结核、麻风、恶性 肿瘤细胞免疫检测、 疗效观察、预后等
A.速发型(Ⅰ型)
B.迟发型(Ⅳ型)超敏反应皮肤表现
第二节
一、免疫预防
自动免疫
免疫学防治
自然自动免疫：感染后获得 人工自动免疫：接种疫苗 自然被动免疫：经胎盘
比较项目 人工主动免疫 输入物质 抗原 生效时间 慢，1－4周 人工被动免疫 抗体 快，立即获得
维持时间 长，数月至数年 短，2周至3周 用途 主要用于预防 紧急预防或治疗
用于人工免疫的生物制品
1、疫苗 活疫苗：用量小、效果好、免疫时间长； 不易保存，效期短 死疫苗：用量大、多次接种、免疫时间短； 安全易保存。 自身疫苗：患者自身死疫苗 新疫苗： 2、类毒素：
1、了解抗原抗体检测法。 2、了解细胞免疫功能检测法。 3、掌握人工免疫。 4、了解计划免疫与免疫调节剂。
【重点难点】： 人工免疫 【学法指导】
1、自主学习 阅读教材本节课的内容，找出学习目标 中的答案。 2、合作探究 （1）人工免疫的原理、类型、用途。 （2）免疫学应用范围。
【自我检测】
一、填空题 1、抗原或抗体检测方法常见有——、——、—— 、——、——。 2、免疫ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ记检验技术常见的标记物有——、—— —--、——-。 3、鉴定细菌的抗原型别可采用————，诊断妊 娠的简易快速方法有————。 4、人工主动免疫常用的制剂有———和————。 5、人工被动免疫常用的制剂有———、———— 和————。
免疫学实验指导
免疫学实验指导生命科学与工程学院生物工程、生物技术、动物医学专业用玉萍[分组]：4人/组，实验用动物、器材以每组需要量设计[班级] 2006生物工程、生物技术 [学生人数]：65人/58人。
分16组/15组[时间] 2008年3月—2008年7月两周一次4学时。
目录实验一、免疫学实验动物的一般操作实验二、实验动物免疫器官、免疫细胞观察实验三、实验动物的采血方法、动物血清及红细胞的制备方法实验四、淋巴细胞分离与E玫瑰花环形成试验实验五、IgG的分离和纯化实验六、玻片凝集试验(ABO血型鉴定)实验七、环状沉淀试验实验八、琼脂扩散试验（单向）实验九、巨噬细胞吞噬功能试验实验十、白细胞吞噬试验实验一、免疫学实验动物的一般操作[实验原理]实验动物的基本操作是免疫学实验的基础,抗原对动物机体的免疫效果，通过实验动物进行验证，因此必须掌握实验动物的一般操作技术。
[目的要求]1、实验材料的准备（棉球、注射器的准备与消毒）（演示）2、了解免疫学实验常用动物的生物学特性、用途及其健康要求。
[自学]3、学习实验动物的编号、抓取、固定和几种不同的注射途径方法。
4、练习对小白鼠给药的几种不同途径的注射方法。
5、练习小白鼠的取血方法。
6、学习血涂片的制作及染色；观察动物血液中有形成分的形态结构特点。
[实验动物]小白鼠，2只/组，共需18 ~ 20只。
[试剂]⑴ 3%来儿或3%石炭酸 100~150 ml/组；⑵无菌生理盐水100~150ml/组；磷酸盐缓冲液20~50ml/组（带滴管、染色用）。
⑶ 3 ~ 5% 苦味酸20~50ml/组（带滴管,编号用）；⑷ 5%品红20ml~50ml/组（带滴管，编号用）；⑸瑞特氏（wright‘s）染色液50ml/组（带滴管，染色用）；*抗凝剂一支[器材]⑴ 1ml注射器及针头2支/组；⑵碘酒棉球、酒精棉球、无菌干棉球各适量；⑶手术剪刀2把/组；镊子2把/组；载玻片、盖玻片各6片/组；⑷毛细吸管2支、50—100ml烧杯1个/组⑸显微镜6台/组[6] 鼠笼1个/组[操作步骤]1、练习小白鼠抓取、编号、皮下注射、皮注射、腹腔注射的方法。
单向琼脂扩散实验报告
1. 理解单向琼脂扩散实验的原理和方法。
2. 掌握实验操作技巧，包括制备琼脂板、打孔、加样、观察结果等。
3. 分析实验数据，如扩散速率、扩散系数等。
4. 探究单向琼脂扩散实验在实际应用中的作用和意义。
二、实验原理单向琼脂扩散实验是一种常用的免疫学检测方法，用于定量检测标本中的抗原。
其原理如下：将适量的抗体加入琼脂内制成免疫琼脂板，然后在板上打孔，孔中加入待测抗原。
抗原会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。
当抗原与抗体比例适宜时，形成白色沉淀环。
沉淀环的直径与抗原含量成正比。
通过测定沉淀环的直径，可以计算出标本中抗原的含量。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：- 羊抗人IgG血清- 标准参考血清（标准IgG质控物）- 待检人血清（IgG-抗原）- pH7.4 0.01M PBS缓冲液（或NS）- 琼脂粉（制备1%免疫盐水琼脂液）- 载玻片、打孔器、37恒温箱、湿盒、可调微量加样器等2. 实验仪器：- 恒温水浴箱- 移液器- 打孔器- 显微镜1. 制备琼脂板：将1%琼脂粉与0.01M PBS缓冲液混合，加热溶解，倒入载玻片上，待凝固后制成琼脂板。
2. 打孔：在琼脂板上按一定距离（1.2~1.5 cm）打孔。
3. 加样：向孔内滴加羊抗人IgG血清、标准参考血清、待检人血清，每孔10 μl。
4. 扩散：将琼脂板放入湿盒中，37℃恒温箱中扩散24小时。
5. 观察结果：观察琼脂板上是否形成白色沉淀环，并测量沉淀环的直径。
五、实验结果与分析1. 实验结果：- 标准参考血清孔中形成明显的白色沉淀环。
- 待检人血清孔中也形成白色沉淀环，但直径较小。
2. 结果分析：- 标准参考血清孔中的白色沉淀环表明琼脂板制备成功，抗体与抗原发生了特异性结合。
- 待检人血清孔中的白色沉淀环表明待检血清中含有与羊抗人IgG血清特异性结合的抗原。
根据沉淀环的直径，可以计算出待检血清中抗原的含量。
通过制作标准曲线，可以进一步确定待检血清中抗原的具体含量。
琼脂扩散实验
火箭电泳 对流电泳 免疫电泳
免疫扩散
• 根据沉淀线的数量、位置和形状， 与已知的标准(或正常)抗原抗体形 成的沉淀线比较，即可对样品中所 含成分及其性质进行分析、鉴定。
• 由于电场的作用，限制了抗原、抗体的 自由扩散，而使其定向泳动，因而增加 了试验的灵敏度，并缩短反应时间。
• 根据样品的沉淀峰长度即可计算出待测 抗原的含量；反之，当琼脂中抗原浓度 固定时，便可测定待测抗体的含量。
一、实验目的
• 学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 • 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
• 沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异 性结合，在二者比例适当并有电解质ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ在 及一定的温度条件下，可形成肉眼可见的 沉淀物的反应。
• 根据反应中使用的介质和检测方法不同， 可将沉淀反应分为液相沉淀反应和凝胶内 沉淀反应两种类型
三、实验器材
• 兔抗BSA抗体 • BSA • 0.01mol/LPBS缓冲液 • 1%离子琼脂 • 打孔器
四、实验内容及步骤
• 1、琼脂板制作 • 2、打孔 • 3、加样 • 4、反应 • 5、结果观察
适合比例性
抗体含量
抗原含量
前带
等价带
后带
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（lattice theory）
液相沉淀反应
• 环状沉淀 • 絮状沉淀（免疫比浊）
凝胶内沉淀反应
• 单向琼脂扩散 • 双向琼脂扩散 • 免疫电泳
凝胶内沉淀反应
免疫扩散技术
免疫电泳技术
单向扩散试验 双向扩散试验
单向琼脂扩散试验
打孔方案
○ ○ ○ ○ ○ ○ ○ ○
五 注意事项
制备抗体琼脂板时，琼脂温度必须严格 控制。温度太低会导致琼脂凝固，太高 将影响所加抗体的活性。 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏 孔的边缘，确保每孔的液面基本一致。
六 思考题
分析试验结果并探讨试验要点
一一教学要求教学要求学习免疫沉淀反应的原理了解免疫沉淀反应的类型掌握单向琼脂扩散实验的操作方法实验二实验二单向琼脂扩散试验单向琼脂扩散试验二二实验原理实验原理免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有电解质存在的情况下按适当比例所形成的可见沉淀物现象
实验二 单向琼脂扩散试验 一 教学要求
学习免疫沉淀反应的原理，了解免疫沉 淀反应的类型 掌握单向琼脂扩散实验的操作方法
二 实验原理
免疫沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体在有 电解质存在的情况下，按适当比例所形成的可 见沉淀物现象。据此现象设计的沉淀实验主要 包括絮状沉淀试验，环状沉淀试验和凝胶内的 沉淀试验。凝胶内的沉淀试验依所用的实验方 法又可分为免疫扩散实验和免疫电泳技术2类
单向琼脂扩散扩实验是凝胶内免疫沉淀反应定 量试验，一般是用已知抗体测定未知量的相应 抗原。定量抗体与加热熔化的含缓冲液的琼脂 混合后，制板，打孔，加入待检抗原，在合适 条件下，形成乳白色的沉淀环。 沉淀环大小与抗原（抗体）量成正相关，因而 可以根据沉淀环的大小确定相应抗原（抗体） 的量。 单向免疫扩散试验主要用于血清中IgG、IgM、 IgA和补体等蛋白质的定性、定量测定。
三 材料与器材（略) 材料与器材（略)
四
操作步骤Βιβλιοθήκη （1）制备抗体琼脂凝胶板：用生理盐水配制1.5%琼脂凝胶， 置水浴中煮沸熔化后，移置56℃水浴箱中保温。吸取 56℃的熔化琼脂置小烧杯内，加入羊抗人IgG抗体（1： 60，v/v）。 （2）铺胶：取溶化的琼脂4ml趁热均匀浇注于载玻片上， 厚度约为1.5mm。 （3） 打孔：待琼脂凝固后，用打孔器在琼脂板上打孔，孔 径3～4mm，孔距10mm。 （4） 加样：将待检血清用生理盐水稀释成1：2、1：6、1： 10 以及空白（生理盐水）加入各孔中，每孔10ul。 （5） 扩散：加样完毕，将琼脂板平放于湿盒内，置37℃ 24～28小时后观察结果。
临床医学检验临床免疫技术：体液免疫球蛋白测定试题预测(题库版)
临床医学检验临床免疫技术：体液免疫球蛋白测定试题预测（题库版）1、单选冷球蛋白阳性不见于（）A.骨髓瘤B.慢淋C.类风湿关节炎D.子宫肌瘤E.恶性肿瘤正确答案：D2、单选自抗体中提取纯化IgG应采用下列哪（江南博哥）种方法（）A.硫酸铵沉淀法B.亚硫酸钠法C.离子交换层析法D.免疫单扩散E.免疫双扩散正确答案：C参考解析：自抗体中提取纯化IgG常用的方法有：离子交换层析法、凝胶过滤法、亲和层析法、酶解法。
3、单选男，45岁，因骨盆骨折住院。
X线检查发现多部位溶骨性病变。
实验室检查：骨髓浆细胞占25%，红细胞沉降率50mm/h，血红蛋白为80g/L，尿本周蛋白阳性，血清蛋白电泳呈现M蛋白，血清免疫球蛋白含量IgG8g/L、IgA12g/L、IgM0.2g/L。
该患者最可能的临床诊断是（）A.一过性单克隆丙种球蛋白病B.持续性多克隆丙种球蛋白病C.多发性骨髓瘤D.冷球蛋白血症E.原发性巨球蛋白血症正确答案：C4、单选免疫球蛋白的型及亚型分类依据是（）A.VH抗原性的不同B.CL抗原性的不同C.CH抗原性的不同D.VL抗原性的不同E.CV抗原性的不同正确答案：B参考解析：根据免疫球蛋白轻链恒定区抗原特异性不同，各类免疫球蛋白分为κ和λ两型。
5、单选初次应答产生的抗体中含量最多的是（）A.IgAB.IgMC.IgGD.IgEE.IgD正确答案：B参考解析：在感染或疫苗接种以后，最先出现的抗体是IgM。
考点：免疫球蛋白的特点6、单选关于血液中免疫球蛋白说法错误的是（）A.新生儿体液免疫功能不成熟，故其体内免疫球蛋白显著低于成人B.宫内感染时出生后的新生儿血清中IgM含量可增高C.慢性肝脏疾病患者血清中可见3种Ig均升高D.类风湿关节炎患者以IgM增高为主E.慢性细菌感染时，血中IgG升高正确答案：A参考解析：新生儿可由母体获得通过胎盘转移来的IgG，故血液中含量接近成人。
7、单选下列关于选择性蛋白尿指数（SPI）说法错误的是（）A.临床上常选用测定尿液和血液中的转铁蛋白（TRF.和IgG含量来计算SPIB.尿液标本通常采集晨尿或随机尿，离心后测定C.SPI通常用于评估肾小球滤过膜破坏程度及观察治疗效果和预后D.微小病变型肾病的SPI大部分属于非选择性排泌蛋白质（SPI≥0.2）E.测定SPI的方法一般选用速率散射免疫比浊法正确答案：D参考解析：SPI≤0.1表明肾脏有高度选择性地排泌分子量小的蛋白质，如微小病变型肾病，而SPI≥0.2表明肾脏非选择性地排泌分子量大的蛋白质，如肾病综合征等。
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实验 8 单向琼脂免疫扩散试验
一、
目的
了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。
原理
将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。
抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。
以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。
主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。
材料
1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白
2. 抗体：抗人IgG抗体
3. 3%琼脂凝胶、
4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。
方法
1. 抗体琼脂板的制备
（1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。
（2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。
（3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。
此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。
2. 稀释参考血清和待测血清;
（1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。
例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。
参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64
IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182
（2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。
3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。
4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。
用同样方法吸取10ul已稀释好的待测血清，每份标本加二个孔。
5. 反应将加样的琼脂板平放在搪瓷湿盒中，置37反应24~48h。
结果观察
取出琼脂板，即可见清晰的乳白色沉淀环。
用标尺测其沉淀环直径并记录。
标准曲线的绘制以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作图，绘制标准曲线。
待测标本Ig含量的计算 : 以待测标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即得该标本Ig的含量
注意事项
1. 该试验为定量试验，因此，对各种影响因素，如参考蛋白的标准、抗体浓度、琼脂的质量与浓度、免疫板的厚度与均匀程度等，必须严格控制。
2. 制备琼脂板时，温度不宜过高，以免使抗体变性失活，但亦不宜太低，以免使琼脂凝固不均。
3. 稀释抗血清、参考血清和加样时均需用微量加样器，加样量要准确，且每个样品加两个孔。
4. 测量沉淀环直径务虚准确，若有误差，再乘以稀释倍数，则误差可成倍的增加。
5. 标准曲线测定必需同时制作，不可一次作成，长期应用。