试验8单向琼脂免疫扩散试验

实验 8 单向琼脂免疫扩散试验

一、

目的

了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。

原理

将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。

材料

1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白

2. 抗体：抗人IgG抗体

3. 3%琼脂凝胶、

4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。

方法

1. 抗体琼脂板的制备

（1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。

（2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。

（3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。

2. 稀释参考血清和待测血清;

（1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。

参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64

IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182

（2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。

3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。

4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。用同样方法吸取10ul已稀释好的待测血清，每份标本加二个孔。

5. 反应将加样的琼脂板平放在搪瓷湿盒中，置37反应24~48h。

结果观察

取出琼脂板，即可见清晰的乳白色沉淀环。用标尺测其沉淀环直径并记录。

标准曲线的绘制以所加各种浓度参考血清的沉淀环直径为纵坐标，相应孔中IgG浓度为横坐标，在半对数纸上作图，绘制标准曲线。

待测标本Ig含量的计算 : 以待测标本孔的沉淀环直径查标准曲线，将查得的Ig含量乘以标本的稀释倍数，即得该标本Ig的含量

注意事项

1. 该试验为定量试验，因此，对各种影响因素，如参考蛋白的标准、抗体浓度、琼脂的质量与浓度、免疫板的厚度与均匀程度等，必须严格控制。

2. 制备琼脂板时，温度不宜过高，以免使抗体变性失活，但亦不宜太低，以免使琼脂凝固不均。

3. 稀释抗血清、参考血清和加样时均需用微量加样器，加样量要准确，且每个样品加两个孔。

4. 测量沉淀环直径务虚准确，若有误差，再乘以稀释倍数，则误差可成倍的增加。

5. 标准曲线测定必需同时制作，不可一次作成，长期应用。