【精品课件】生化大实验双向琼脂免疫扩散
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课件：双向琼脂扩散试验
3．加样：于中央孔加入10μl兔抗人IgG（Ab），周 围孔依次加入生理盐水、倍比稀释的人血清 （Ag），每孔10μl。
4．将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中24h，观 察结果。
1:16 0
1:10 Ab 1:80
1:20 1:40
• 生理盐水孔为阴性对照，与中间孔空之间 无沉淀线。
• 周围孔（1:10、1:20、1:40 、1:80、 1:160） 的人血清）与中央孔（兔抗人IgG）之间是 否可出现清晰的乳白色沉淀线。
定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀 线.
1．人血清。 2. 兔抗人 IgG 。 3．1%琼脂糖溶液。 4．其他：加样器、打孔器、湿盒、恒温
箱等。
1．制备琼脂板：标记载玻片，置于水平台上，吸管 吸取4.5ml 1%琼脂糖溶液均匀浇在载玻片上，注 意勿产生气泡。
2. 打孔：待琼脂糖完全凝固后，将琼脂板置于图样 上，用打孔器打孔（梅花孔中1周6，双排孔上下 各6），孔间距为5mm。
• Ab的效价以出现白色沉淀线的Ag的最高稀 释度表示。
ABC DEF
Ag Ab
A: 浓度Ag、Ab及分子量近似； B：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＜ Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＞ Ab ； D：浓度Ag＞Ab，分子量近似； E：浓度Ag＞Ab，分子量Ag＜Ab ； F：浓度Ag＜Ab，分子量Ag＞Ab ；
• 掌握双向琼脂扩散试验的原理 • 掌握抗体效价的测定方法及抗原抗体
性质的分析方法 • 了解双向琼脂扩散实验的应用
• 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在 电解质存在的条件下发生特异性结合 所出现的沉淀现象。
+
可溶性抗原
相应抗体
沉淀物
可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质
4．将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中24h，观 察结果。
1:16 0
1:10 Ab 1:80
1:20 1:40
• 生理盐水孔为阴性对照，与中间孔空之间 无沉淀线。
• 周围孔（1:10、1:20、1:40 、1:80、 1:160） 的人血清）与中央孔（兔抗人IgG）之间是 否可出现清晰的乳白色沉淀线。
定时间后在两孔之间相遇并生成白色沉淀 线.
1．人血清。 2. 兔抗人 IgG 。 3．1%琼脂糖溶液。 4．其他：加样器、打孔器、湿盒、恒温
箱等。
1．制备琼脂板：标记载玻片，置于水平台上，吸管 吸取4.5ml 1%琼脂糖溶液均匀浇在载玻片上，注 意勿产生气泡。
2. 打孔：待琼脂糖完全凝固后，将琼脂板置于图样 上，用打孔器打孔（梅花孔中1周6，双排孔上下 各6），孔间距为5mm。
• Ab的效价以出现白色沉淀线的Ag的最高稀 释度表示。
ABC DEF
Ag Ab
A: 浓度Ag、Ab及分子量近似； B：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＜ Ab ； C：浓度Ag、Ab近似，分子量Ag ＞ Ab ； D：浓度Ag＞Ab，分子量近似； E：浓度Ag＞Ab，分子量Ag＜Ab ； F：浓度Ag＜Ab，分子量Ag＞Ab ；
• 掌握双向琼脂扩散试验的原理 • 掌握抗体效价的测定方法及抗原抗体
性质的分析方法 • 了解双向琼脂扩散实验的应用
• 沉淀反应是可溶性抗原与相应抗体在 电解质存在的条件下发生特异性结合 所出现的沉淀现象。
+
可溶性抗原
相应抗体
沉淀物
可溶性抗原与相应抗体在含适量电解质
单向双向免疫琼脂扩散
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
实验方法
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL），溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 将载玻片置于水平桌面上，倾注已融化1%盐水琼脂，制作琼脂板。 琼脂凝固后，用打孔器打孔，本实验采用梅花型。
实验方法
稀释抗体：用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体，使最终浓度为抗体效 价的一倍，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
制备琼脂板：将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟，再 倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀，取4ml即刻倾注于玻片上，待 凝固后即可。
(1) 沉淀线吻合：
待检抗原与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切：
待检抗原中含有与标准抗原相同的抗 原，还含有另外的抗原与抗血清相对 应。
实验方法
(3) 沉淀线相交：
待检抗原有与抗血清对应的抗原， 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合：
待测抗原和标准抗原性质相同，但 含量较琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
抗原抗体纯度鉴定
“1” 为单一抗原抗体系统。 “n” 为多个抗原抗体系统。 *可以用混合抗原鉴定抗体纯度。 *可以用混合抗体鉴定抗原纯度。
实验方法
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL），溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。 将载玻片置于水平桌面上，倾注已融化1%盐水琼脂，制作琼脂板。 琼脂凝固后，用打孔器打孔，本实验采用梅花型。
实验方法
稀释抗体：用pH7.2的PBS稀释标准兔抗牛IgG血清抗体，使最终浓度为抗体效 价的一倍，其分装量应与2%盐水琼脂量相等。
制备琼脂板：将已稀释的标准兔抗牛IgG血清抗体于56℃水浴中预热半分钟，再 倾注于已溶化并维持56℃的2%盐水琼脂中混匀，取4ml即刻倾注于玻片上，待 凝固后即可。
(1) 沉淀线吻合：
待检抗原与标准抗原完全相同。
(2) 沉淀线相切：
待检抗原中含有与标准抗原相同的抗 原，还含有另外的抗原与抗血清相对 应。
实验方法
(3) 沉淀线相交：
待检抗原有与抗血清对应的抗原， 但和标准抗原不同。
(4) 沉淀线部分吻合：
待测抗原和标准抗原性质相同，但 含量较琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
单向双向免疫琼脂扩散
火箭免疫电泳
单向免疫琼脂扩散
实验原理
将适量的抗体均匀混入琼脂内制成琼脂板，打孔，在孔中加入一定量的待测抗原， 抗原向四周呈辐射状扩散，与抗体相遇，在比例合适时形成白色沉淀环。
实验原理
此方法用已知的抗体测未知的抗原。由于抗体已与凝胶混合，不会再扩散，仅抗 原从小孔向四周扩散，因此称为单向琼脂扩散试验。
实验方法
加样：于中央孔加入牛IgG，周围1-5孔加入倍比稀释不同浓度的标准兔抗牛IgG 血清抗体，6孔加入生理盐水作对照。每孔各加10μl。
将琼脂板平放于湿盒内，置37℃温箱中，分别于24小时观察结果。
实验结果
观察孔间沉淀线的数目及特征。本试验1至5孔与中央孔之间是否可出现清晰的乳 白色沉淀线。
沉淀环直径的大小与抗原含量成正比，用标准抗原制成标准曲线，从标准曲线上， 可以查出待检样品中抗原的含量。
实验原理
标准品抗原浓度测定 1.测定沉淀环直径 2.在标准曲线上查找相应抗原浓度
不同病人抗原浓度测定
绘制标准曲线
实验方法
（一）标准曲线的制备
制作琼脂板所需要的1%盐水琼脂（4mL）。 首先分装其1/2量的2%盐水琼脂，溶化后置56℃水浴中平衡温度备用。
实验
单向、双向免疫琼脂 扩散
沉淀反应
可溶性抗原（如细菌外毒素、血清蛋白等）与相应抗体特异性结合后，在一定条件 （适量电解质、适宜的pH值及温度）下，经过一定时间，在比例适宜处形成肉眼 可见的沉淀现象。
沉淀反应
环状沉淀反应
沉
淀
反
琼脂扩散试验
应
对流免疫电泳
电
双向扩散
＋
单向扩散
泳 技 术
絮状沉淀反应
周围6个孔放不同稀释度的相应Ab。 以出现沉淀线的血清最高稀释倍数为该抗体的效价。 可进行任意稀释。
《双向琼脂扩散试》课件
缺点
影响因素多
双向琼脂扩散试验的结果受到多种因 素的影响，如抗原和抗体的质量、浓 度、扩散速度等，可能导致试验结果 的差异。
试验周期较长
由于抗原和抗体需要在琼脂凝胶中扩 散，因此试验的完成需要一定的时间 。对于快速检测的需求，双向琼脂扩 散试验可能不是最佳选择。
灵敏度与特异性难以平衡
在提高试验的灵敏度的同时，可能会 牺牲部分特异性；反之亦然。因此， 在实际应用中需要权衡灵敏度和特异 性之间的平衡。
主观性较强
试验结果的判断依赖于操作者的主观 观察，因此结果的准确性和可靠性可 能受到操作人员经验和技术水平的影 响。
05
双向琼脂扩散试验的改进与发 展趋势
改进方法与技术
01
02
03
04
优化试验条件
通过调整温度、pH值、离子 强度等参数，提高试验的稳定
性和准确性。
自动化与智能化
引入自动化设备和技术，实现 试验过程的自动化和智能化，
优点
操作简便
灵敏度高
双向琼脂扩散试验是一种经典的血清学检 测方法，操作简便，易于在实验室或临床 环境中实施。
该试验对微量抗原和抗体具有较强的检测 能力，能够检测出低浓度的抗原或抗体。
特异性好
结果直观
由于采用琼脂凝胶作为载体，抗原和抗体 在凝胶中扩散，形成浓度梯度，从而达到 高度特异性识别的效果。
试验结果可以通过观察凝胶上的沉淀线来 直接判断，无需复杂的仪器设备。
食品中病原菌检测
通过双向琼脂扩散试验，可以检测食品中是否存在某些病原菌， 确保食品安全。
食品添加剂检测
该试验也可用于检测食品中是否含有超标的食品添加剂，如防腐剂 、色素等。
食品过敏原检测
免疫扩散实验(双向双扩散)ppt课件
免疫扩散实验双向双扩散4实验材料?生理盐水1琼脂用于制作琼脂扩散试验平板?已知传染性法氏囊病毒抗原待检血清?打孔器微量加样器枪头酒精灯搪瓷盒等免疫扩散实验双向双扩散5实验步骤1
免疫扩散实验（双向双扩散）
2010级生物技术第四组
免疫扩散实验(双向双扩散)
1
实验目的
▪ 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ▪ 掌握抗体效价的测定方法。 ▪ 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。
免疫扩散实验(双向双扩散)
3
实验材料
▪ 生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试 验平板）
▪ 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ▪ 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪
瓷盒等
免疫扩散实验(双向双扩散)
4
实验步骤
1. 制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水， 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。
2. 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内 琼脂。
3. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
免疫扩散实验(双向双扩散)
5
4. 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。
免疫扩散实验(双向双扩散)
2
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
免疫扩散实验（双向双扩散）
2010级生物技术第四组
免疫扩散实验(双向双扩散)
1
实验目的
▪ 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ▪ 掌握抗体效价的测定方法。 ▪ 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。
免疫扩散实验(双向双扩散)
3
实验材料
▪ 生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试 验平板）
▪ 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ▪ 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪
瓷盒等
免疫扩散实验(双向双扩散)
4
实验步骤
1. 制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水， 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。
2. 打孔：待琼脂凝固好后用打孔器打孔，孔径和 孔距依不同疫病检疫规程而定，一般孔径 3~5mm，孔间距4~7mm。孔型多为7孔，中央 1孔，周围6孔（如梅花孔）。用针头挑出孔内 琼脂。
3. 封底：将琼脂板无凝胶面在酒精灯火焰上轻轻 灼烧，用手背感受微烫即可。
免疫扩散实验(双向双扩散)
5
4. 抗体效价测定：用微量加样器于中央孔加 入已知抗原，于周围孔加倍比稀释的血清， 每个稀释度加1孔。加样时不要使样品外 溢或在边缘残存小气泡，以免影响扩散结 果。
免疫扩散实验(双向双扩散)
2
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
医学免疫学：双向免疫扩散
确保每孔的液面基本一致。 • 加样时，不能将样品加到孔的外面。
• 打孔 打梅花孔，各孔间的距离为0.70.8cm。
1
• 倍比稀释抗体 （见表）
• 加样 用微量进样器将各孔加各样品10ul； 中央孔加抗原，周围6孔分别加不同稀释 度的抗体。
• 将玻片放在湿盒中，37℃ 18-24h。
1
2
3
4
5
6
生理盐水
50 50 50 50 50
抗IgG 100 50 50 50 50 50
实验现象
• 在两孔间会看到白色沉淀线的相应孔的抗体的最大 稀释度作为该抗体的效价。
该血清中抗IgG的效价为1：4。
实验结果的记录和判断
• 画出实验结果图并判断效价。
注意事项
• 浇板用的玻片要洁净。 • 制备抗体琼脂板时，琼脂温度要控制在60℃左右。
温度太低会导致琼脂凝固。 • 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，
双向免疫扩散
实验原理
• 双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体 在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一 定类型的特异性沉淀线。
主要的试剂和器材
• 抗体：抗IgG • 抗原：IgG • 巴比妥缓冲液 • 1.5%琼脂（巴比妥缓冲液配制） • 载玻片、打孔器、微量进样器 • 37℃水浴箱
实验步骤
• 制板 用移液管吸取4.5ml的琼脂，将其放 到水平放置的载玻片上，待冷凝。
• 打孔 打梅花孔，各孔间的距离为0.70.8cm。
1
• 倍比稀释抗体 （见表）
• 加样 用微量进样器将各孔加各样品10ul； 中央孔加抗原，周围6孔分别加不同稀释 度的抗体。
• 将玻片放在湿盒中，37℃ 18-24h。
1
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6
生理盐水
50 50 50 50 50
抗IgG 100 50 50 50 50 50
实验现象
• 在两孔间会看到白色沉淀线的相应孔的抗体的最大 稀释度作为该抗体的效价。
该血清中抗IgG的效价为1：4。
实验结果的记录和判断
• 画出实验结果图并判断效价。
注意事项
• 浇板用的玻片要洁净。 • 制备抗体琼脂板时，琼脂温度要控制在60℃左右。
温度太低会导致琼脂凝固。 • 加样孔中的琼脂应挑干净，且不可损坏孔的边缘，
双向免疫扩散
实验原理
• 双向免疫扩散是指可溶性抗原与相应抗体 在琼脂介质中相互扩散,彼此相遇后形成一 定类型的特异性沉淀线。
主要的试剂和器材
• 抗体：抗IgG • 抗原：IgG • 巴比妥缓冲液 • 1.5%琼脂（巴比妥缓冲液配制） • 载玻片、打孔器、微量进样器 • 37℃水浴箱
实验步骤
• 制板 用移液管吸取4.5ml的琼脂，将其放 到水平放置的载玻片上，待冷凝。
生化大实验双向琼脂免疫扩散
可用于大量样本检测
通过优化实验条件，可以同时进行多个样本的检测。
实验优缺点分析
实验周期较长
需要等待蛋白质在琼脂 中扩散，时间较长。
影响因素较多
实验结果受多种因素影 响，如温度、湿度、pH 值等。
定量分析不准确
由于扩散的非均一性和 不稳定性，定量分析不 够准确。
未来研究方向与展望
改进实验方法
进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和特异 性。
加样
将抗原或抗体溶液加入到相应的孔中，并让其扩 散。
加入抗体或抗原
将抗体或抗原溶液加入到凝胶板的另一侧的孔中， 让其扩散。
显色反应
观察凝胶板上是否出现沉淀线，如果出现则说明 抗原和抗体发生了反应。
结果分析
根据沉淀线的位置和清晰度，分析实验结果。
02
生化大实验双向琼脂免疫扩散的应 用
在医学诊断中的应用
应用拓展
将双向琼脂免疫扩散技术应用于更多领域，如疾 病诊断、药物研发等。
技术创新
结合其他技术手段，如纳米技术、生物信息学等， 创新发展新的蛋白质检测方法。
感谢您的观看
THANKS
严格按照实验步骤进行操作， 避免操作失误或遗漏。
注意观察实验过程中出现的异 常情况，如气泡、沉淀等，及 时处理并记录。
在实验过程中保持恒温，避免 温度波动对实验结果的影响。
实验后的处理和结果分析
清洗并整理实验器材，确保实验室整洁。
对实验结果进行记录和分析，确保数据的准确性 和可靠性。
根据实验结果进行总结和归纳，得出结论，为后 续研究提供参考和依据。
食品添加剂和污染物检测
检测食品中的添加剂和污染物，确保食品的质量和安全性。
03
实验操作注意事项
通过优化实验条件，可以同时进行多个样本的检测。
实验优缺点分析
实验周期较长
需要等待蛋白质在琼脂 中扩散，时间较长。
影响因素较多
实验结果受多种因素影 响，如温度、湿度、pH 值等。
定量分析不准确
由于扩散的非均一性和 不稳定性，定量分析不 够准确。
未来研究方向与展望
改进实验方法
进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和特异 性。
加样
将抗原或抗体溶液加入到相应的孔中，并让其扩 散。
加入抗体或抗原
将抗体或抗原溶液加入到凝胶板的另一侧的孔中， 让其扩散。
显色反应
观察凝胶板上是否出现沉淀线，如果出现则说明 抗原和抗体发生了反应。
结果分析
根据沉淀线的位置和清晰度，分析实验结果。
02
生化大实验双向琼脂免疫扩散的应 用
在医学诊断中的应用
应用拓展
将双向琼脂免疫扩散技术应用于更多领域，如疾 病诊断、药物研发等。
技术创新
结合其他技术手段，如纳米技术、生物信息学等， 创新发展新的蛋白质检测方法。
感谢您的观看
THANKS
严格按照实验步骤进行操作， 避免操作失误或遗漏。
注意观察实验过程中出现的异 常情况，如气泡、沉淀等，及 时处理并记录。
在实验过程中保持恒温，避免 温度波动对实验结果的影响。
实验后的处理和结果分析
清洗并整理实验器材，确保实验室整洁。
对实验结果进行记录和分析，确保数据的准确性 和可靠性。
根据实验结果进行总结和归纳，得出结论，为后 续研究提供参考和依据。
食品添加剂和污染物检测
检测食品中的添加剂和污染物，确保食品的质量和安全性。
03
实验操作注意事项
琼脂扩散实验 PPT
花孔型
单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。 将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝 固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入 抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会 向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h －48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓 度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本 中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫 球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
A1：待检抗原；A2：标准抗原
免疫学及免疫学检验
抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。
实验
材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体
操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理
琼脂扩散试验
一、实验目的
学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在 二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下， 可形成肉眼可见的沉淀物的反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自பைடு நூலகம்扩 散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物 分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可 见的带状或线状沉淀带。
盘中，37℃自由扩散24h～48h。
结果判定
．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中 心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻 孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原； 若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇； 若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
单向琼脂扩散试验
单向琼脂扩散试验 是一种常用的定量检测抗原的方法。 将适量稀释后的抗体与等量琼脂混匀，浇注成板，凝 固后，在板上打孔，孔径3mm，孔间距10mm，孔中加入 抗原，每孔10μL，放置湿盒中，37℃温箱，抗原就会 向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。24h －48h后观察结果，在两者比例适当处形成白色沉淀环。 沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。如事先用不同浓 度的标准抗原制成标准曲线，则从曲线中可求出标本 中抗原的含量。本试验主要用于检测标本中各种免疫 球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
A1：待检抗原；A2：标准抗原
免疫学及免疫学检验
抗体效价滴定 用梅花型孔，中间放抗原， 周围孔放下不同稀释度的 相应抗体，以出现沉淀线 的最高稀释倍数为该抗体 的效价。
实验
材料与试剂
1．琼脂粉 2．平皿 3．打孔器 4．生理盐水或其他缓冲液 5. 抗原、抗体
操作方法
1．称取一定量的琼脂粉，按1.5%的比例加入生理
琼脂扩散试验
一、实验目的
学习掌握琼脂扩散试验的原理与应用 熟悉掌握其基本操作方法
二、实验原理
沉淀反应是指可溶性抗原与相应抗体特异性结合，在 二者比例适当并有电解质存在及一定的温度条件下， 可形成肉眼可见的沉淀物的反应。
免疫扩散法就是使抗原与抗体在琼脂糖凝胶中自பைடு நூலகம்扩 散而相遇，从而形成抗原抗体复合物，由于此复合物 分子量增大并产生聚集，不再继续扩散而形成肉眼可 见的带状或线状沉淀带。
盘中，37℃自由扩散24h～48h。
结果判定
．用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血清置中 心孔，将待测抗原或需比较的抗原置于周围相邻 孔。若出现沉淀带完全融合，证明为同种抗原； 若二者有部分相连，表明二者有共同抗原决定簇； 若二条沉淀线相互交叉，说明二者抗原完全不同。
双向琼脂扩散法
双向琼脂扩散法双向琼脂扩散法是一种常用的生物化学实验技术，主要用于分析蛋白质的纯度、浓度和相互作用。
下面将详细介绍双向琼脂扩散法的原理、步骤和应用。
一、原理双向琼脂扩散法是利用琼脂凝胶中分子扩散速率与分子大小成反比的特性来分析蛋白质的性质。
该方法基于两个琼脂凝胶层，其中一个含有待测蛋白质样品，另一个作为对照。
通过扩散的过程，样品中的蛋白质会与对照层中的蛋白质发生相互作用，形成扩散线。
根据扩散线的长度和形状，可以判断蛋白质的纯度和相互作用情况。
二、步骤1. 准备琼脂凝胶：将琼脂粉溶解在适量的缓冲液中，加热至溶解后冷却，倒入扩散皿中。
等待凝胶完全凝固。
2. 加载样品：在琼脂凝胶上制作孔洞，将待测蛋白质样品滴入孔洞中。
3. 制作对照：在另一块琼脂凝胶上制作同样大小的孔洞，不加样品。
4. 扩散过程：将含有样品的琼脂凝胶和对照的琼脂凝胶背靠背放置，放入扩散皿中。
在适当温度下，等待扩散过程完成。
5. 结果分析：观察扩散线的长度和形状，根据标准曲线或参考结果，判断蛋白质的纯度和相互作用情况。
三、应用双向琼脂扩散法在生物化学领域有广泛的应用。
主要应用包括以下几个方面：1. 纯度分析：通过观察扩散线的长度和形状，可以初步判断蛋白质样品的纯度。
如果扩散线较短且形状规则，说明样品纯度较高；反之，若扩散线较长或呈现模糊不清的形态，则说明样品中可能存在杂质。
2. 相互作用研究：在双向琼脂扩散法中，待测蛋白质与对照层中的蛋白质发生相互作用，形成扩散线。
通过观察扩散线的形状和长度变化，可以初步判断蛋白质之间的相互作用情况，如结合、竞争等。
3. 分子量测定：根据琼脂凝胶中分子扩散速率与分子大小成反比的特性，可以通过双向琼脂扩散法初步测定蛋白质的分子量。
一般来说，分子量较大的蛋白质扩散速率较慢，扩散线较短；反之，分子量较小的蛋白质扩散速率较快，扩散线较长。
4. 质量控制：双向琼脂扩散法可以用于检测蛋白质样品的质量，以确保其符合要求。
双向免疫扩散
2009.11.3
实验结论
将出现白色沉淀线的最高血清稀释度作为该抗体 的效价。 例：该血清中抗IgG抗体的效价为1：4。
画出实验结果图并判断效价
2009.11.3
注意事项
玻片要清洁，边缘无破损。 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。 加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果
• 抗体：抗IgG • 抗原：IgG • 巴比妥缓冲液 • 1孔器、微量进样器 • 37℃水浴箱
2009.11.3
实验步骤
制板 用移液管吸取4-4.5ml的琼脂，将其放到 水平放置的载玻片上，待冷凝。
打孔 打梅花孔，各孔间的距离为0.7-0.8cm。
1
2009.11.3
倍比稀释抗体 （见下表） 加样 用微量进样器在各孔加样品10ul，中央孔
加抗原，周围6孔分别加不同稀释度的抗体 将玻片放在湿盒中，37℃ 18-24h
1
2
3
4
5
6
生理盐水
25 25 25 25 25
抗IgG
50 25 25 25 25 25
2009.11.3
实验结果
在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线。
双向免疫扩散试验
2009.11.3
实验原理
指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在比例适当处形成沉淀线。
根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进 行定性分析，也可用于抗体的半定量检测
本次实验利用此原理进行抗体效价的测定。
2009.11.3
2009.11.3
主要的试剂和器材
的准确性。 注意微量进样器每加一个样品之后，就得清洗。
2009.11.3
实验结论
将出现白色沉淀线的最高血清稀释度作为该抗体 的效价。 例：该血清中抗IgG抗体的效价为1：4。
画出实验结果图并判断效价
2009.11.3
注意事项
玻片要清洁，边缘无破损。 浇制琼脂板时要均匀、无气泡。 孔要打得圆整光滑，边缘不要破裂。 加样时应尽量避免气泡或加到孔外，以保证结果
• 抗体：抗IgG • 抗原：IgG • 巴比妥缓冲液 • 1孔器、微量进样器 • 37℃水浴箱
2009.11.3
实验步骤
制板 用移液管吸取4-4.5ml的琼脂，将其放到 水平放置的载玻片上，待冷凝。
打孔 打梅花孔，各孔间的距离为0.7-0.8cm。
1
2009.11.3
倍比稀释抗体 （见下表） 加样 用微量进样器在各孔加样品10ul，中央孔
加抗原，周围6孔分别加不同稀释度的抗体 将玻片放在湿盒中，37℃ 18-24h
1
2
3
4
5
6
生理盐水
25 25 25 25 25
抗IgG
50 25 25 25 25 25
2009.11.3
实验结果
在抗原和抗体孔之间会看到白色的沉淀线。
双向免疫扩散试验
2009.11.3
实验原理
指可溶性抗原与相应抗体在琼脂介质中相互扩散， 彼此相遇，在比例适当处形成沉淀线。
根据沉淀线的有无、形状和位置对抗原或抗体进 行定性分析，也可用于抗体的半定量检测
本次实验利用此原理进行抗体效价的测定。
2009.11.3
2009.11.3
主要的试剂和器材
的准确性。 注意微量进样器每加一个样品之后，就得清洗。
2009.11.3
双向琼脂扩散试验课件
进行相关检测和分析。
02 试验材料与设备
试验材料
抗原和抗体
琼脂糖凝胶
硝酸纤维素膜
缓冲液
根据试验目的选择相应 的抗原和抗体，确保其
质量和纯度。
用于制备凝胶板，选择 适当规格的琼脂糖凝胶，
确保其质量和纯度。
用于固定抗原和抗体， 选择适当规格的硝酸纤
维素膜。
用于调节抗原和抗体溶 液的pH值，选择适当的
行操作。
结果直观
试验结果以抑菌圈的形式呈现，直 观易懂，便于观察和比较。
成本较低
该方法所需材料和试剂相对便宜， 降低了检测成本。
缺点
准确性不足
由于受多种因素影响，如菌种类 型、培养基成分、扩散时间等， 该方法的准确性有时难以保证。
灵敏度不高
对于低浓度的目标物质，该方法 的检测限相对较高，可能会漏检。
原或抗体。
确定抗原与抗体的浓度
02
沉淀线的清晰度和长度可以反映抗原或抗体的浓度，越清晰、
越长的沉淀线表明浓度越高。
确定抗原与抗体的特异性
03
如果不同抗原与抗体之间出现交叉反应，可以通过比较沉淀线
的位置和形状，判断抗原与抗体的特异性。
结果应用与注意事项
结果应用
双向琼脂扩散试验常用于检测体液中的微量蛋白质，如免疫球蛋白、补体、循环 抗原等，也可用于检测与免疫有关的疾病。
试验的应用领域
临床诊断
用于检测和诊断各种感染性疾 病、自身免疫性疾病等，如风 湿性心脏病、系统性红斑狼疮
等。
免疫学研究
用于研究抗原抗体的反应机制 、免疫复合物的形成等，为免 疫学理论提供实验依据。
生物制品检测
用于检测疫苗效价、血液制品 的免疫效果等，确保生物制品 的质量和安全。
02 试验材料与设备
试验材料
抗原和抗体
琼脂糖凝胶
硝酸纤维素膜
缓冲液
根据试验目的选择相应 的抗原和抗体，确保其
质量和纯度。
用于制备凝胶板，选择 适当规格的琼脂糖凝胶，
确保其质量和纯度。
用于固定抗原和抗体， 选择适当规格的硝酸纤
维素膜。
用于调节抗原和抗体溶 液的pH值，选择适当的
行操作。
结果直观
试验结果以抑菌圈的形式呈现，直 观易懂，便于观察和比较。
成本较低
该方法所需材料和试剂相对便宜， 降低了检测成本。
缺点
准确性不足
由于受多种因素影响，如菌种类 型、培养基成分、扩散时间等， 该方法的准确性有时难以保证。
灵敏度不高
对于低浓度的目标物质，该方法 的检测限相对较高，可能会漏检。
原或抗体。
确定抗原与抗体的浓度
02
沉淀线的清晰度和长度可以反映抗原或抗体的浓度，越清晰、
越长的沉淀线表明浓度越高。
确定抗原与抗体的特异性
03
如果不同抗原与抗体之间出现交叉反应，可以通过比较沉淀线
的位置和形状，判断抗原与抗体的特异性。
结果应用与注意事项
结果应用
双向琼脂扩散试验常用于检测体液中的微量蛋白质，如免疫球蛋白、补体、循环 抗原等，也可用于检测与免疫有关的疾病。
试验的应用领域
临床诊断
用于检测和诊断各种感染性疾 病、自身免疫性疾病等，如风 湿性心脏病、系统性红斑狼疮
等。
免疫学研究
用于研究抗原抗体的反应机制 、免疫复合物的形成等，为免 疫学理论提供实验依据。
生物制品检测
用于检测疫苗效价、血液制品 的免疫效果等，确保生物制品 的质量和安全。
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2.凝胶液：5g琼脂糖加500ml上述缓冲液， 微波炉加热煮沸溶解。注意用中小火， 以免暴沸。
3.待测样品：I号峰、II号峰、III号峰
4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗 人apoA-I抗体。
5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养 皿、下口径2mm滴管等
四 操作步骤
1.制板：用移液管吸取热琼脂20ml，平铺 于直径9cm培养皿中。
（3）抗原或抗体相对分子量的估计
双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○○ ○
○○
三孔型
○○ ○○
双孔型
○ ○○○
○
双排孔型
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
三 试剂与器材
1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。
3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打 孔，孔径2mm,孔与孔距离3-4mm。用针 挑去孔内琼脂。
3.用微量加样器将羊抗人IgG抗体、羊抗人 LDL抗体及羊抗人apoA-I抗体各5-10ul加 入周边孔中，中间孔加不同峰的液体。
4.将培养皿置于生化培养箱内，于37℃温 育，隔天观察结果。
五 注意事项
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于:
（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。
（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体）
双向免疫扩散试验
一实验目的
学习双向免疫扩散实验原理 掌握双向免疫扩散实验操作方法
基本概念
抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体 产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生 免疫效应（特异性反应）的物质。
抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗 原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产 生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
3.待测样品：I号峰、II号峰、III号峰
4.羊抗人IgG抗体、羊抗人LDL抗体、羊抗 人apoA-I抗体。
5.生化培养箱、微波炉、刻度吸管、培养 皿、下口径2mm滴管等
四 操作步骤
1.制板：用移液管吸取热琼脂20ml，平铺 于直径9cm培养皿中。
（3）抗原或抗体相对分子量的估计
双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○○ ○
○○
三孔型
○○ ○○
双孔型
○ ○○○
○
双排孔型
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
三 试剂与器材
1.缓冲液：4.65gTris加水溶解，加115ml 0.1 M HCl，最后补水至1000ml，pH为8.2。
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。
3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
2.打孔：待琼脂凝固后，按图1梅花孔型打 孔，孔径2mm,孔与孔距离3-4mm。用针 挑去孔内琼脂。
3.用微量加样器将羊抗人IgG抗体、羊抗人 LDL抗体及羊抗人apoA-I抗体各5-10ul加 入周边孔中，中间孔加不同峰的液体。
4.将培养皿置于生化培养箱内，于37℃温 育，隔天观察结果。
五 注意事项
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于:
（1）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。
（2）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体）
双向免疫扩散试验
一实验目的
学习双向免疫扩散实验原理 掌握双向免疫扩散实验操作方法
基本概念
抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体 产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生 免疫效应（特异性反应）的物质。
抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗 原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产 生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。