双向琼脂扩散实验

双向琼脂扩散试验

一、实验目的

1、掌握双向琼扩试验的原理和用途

2、掌握双向琼扩试验操作方法

3、观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线

二、原理

血清学反应：

•凝集反应

•沉淀反应

•补体参与的反应

•中和反应

凝集反应：颗粒性抗原，或吸附在颗粒性载体表面的可溶性性抗原，与相应抗体结合，在有适当电解质存在，经过一定时间，成肉眼可见的凝集团块参与凝集反应的抗原称凝集原，抗体称为凝集素

沉淀反应：将可溶性抗原与相应抗体混合，在电解质存在条件下，即可形成肉眼可见的沉淀物沉淀物只在抗原抗体比例合适时才出现

补体参与的反应：补体结合试验是根据补体能与任何抗原抗体复合物结合，但不能单独同抗原或抗体结合的特性，用特定的补体来检测抗原抗体间有无特异性结合中和反应：针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位的抗体

与病毒结合后可以中和病毒的感染性（病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或动物上进行，一般将抗体作稀释，与一定量的病毒混合，然后检测其在细胞培养、鸡胚或动物上的残余感染性）•终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀释度来表示。（中和试验具有很强的特异性，是检测病中和试验具有很强的特异性，毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方法，也可用于检测病毒感染动物血清中的抗体）双向琼脂扩散试验，是将抗原和相应抗体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。两者相互扩散，当扩散到他们的浓度比例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗体复合物的沉淀【可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。】三、实验材料

Ag （实验所提供的抗原）

Ab（实验所提供的抗体血清）

1%琼脂

玻片、打孔器、加样器、tip头等

四、步骤

1、称取1g琼脂粉，加至100ml 8%高渗盐水中，配制1%琼脂凝胶隔水煮沸使其溶化稍冷至55℃后浇板 (用吸管吸取4ml趁热浇于载玻片上，制成琼脂板）注意载玻片应放水平，琼脂勿倒出板外。

2、待凝固后在琼脂上打梅花孔（孔数孔径孔距根据实验情况待定）孔内的琼脂如未吸出，则用注射器针头挑出孔中琼脂。

3、封底：将玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使琼脂与玻片紧贴；

将抗体按二倍比稀释法稀释成1:2，1:4，1:8，1:16，1:32 ，中间孔加抗原，周围孔加倍比稀释抗体，其中一个孔加滴入生理盐水作为对照（小心加样，不要溢出）

4、置37 ℃湿盒24-48h

结果观察：在抗原抗体比例合适处，出现白色沉淀，以出现明显的沉淀线的最高稀释度为该抗体的效价。