琼脂扩散实验 PPT
免疫扩散实验(双向双扩散) PPT
实验材料
▪ 生理盐水、1%琼脂（用于制作琼脂扩散试 验平板）
▪ 已知传染性法氏囊病毒抗原、待检血清 ▪ 打孔器、微量加样器、枪头、酒精灯、搪
瓷盒等
实验步骤
▪ 制板：称取1g琼脂粉，加入100ml生理盐水， 煮沸使之溶解。待溶解的琼脂温度降至60℃左 右时倒入平皿中，厚度为2-3mm。注意勿产生 气泡。
大家有疑问的，可以询问和交流
可以互相讨论下，但要小声点
9
结果判定
用梅花孔检测抗血清的效价，操作时将抗原置 于中心孔，抗血清倍比稀释后置于周围孔，以 出现沉淀带的血清最高稀释倍数为该血清的琼 扩效价。
若凝胶中抗原、抗体是特异性的，则形成抗原 抗体复合物，在两孔之间出现清晰致密的白色 沉淀线，为阳性反应。若在72小时内仍未出现 沉淀线则为阴性反应。实验时至少要做一阳性 对照。出现阳性对照与备检样品的沉淀线发生 融合，才能确定待检样品为真正阳性。
▪ 扩散：加样完毕后，将琼脂板放于湿盒内， 保持一定的湿度，置于37℃温箱中扩散 24~48小时观察结果。
图1
结果判定ห้องสมุดไป่ตู้
▪ 用以检测抗原或比较抗原差异时，将抗血 清置中心孔，将待测抗原或需比较的抗原 置于周围相邻孔。若出现沉淀带完全融合， 证明为同种抗原；若二者有部分相连，表 明二者有共同抗原决定簇；若二条沉淀线 相互交叉，说明二者抗原完全不同。
免疫扩散实验（双向双扩散）
2010级生物技术第四组
实验目的
▪ 了解双向琼脂扩散的原理和用途。 ▪ 掌握抗体效价的测定方法。 ▪ 观察抗原、抗体在琼脂板中形成的沉淀线。
实验原理
▪ 双向双扩散简称双扩散，此法是一种定性 试验。可溶性抗原与相应的抗体在琼脂凝 胶中各自向四周扩散，如果抗原和抗体相 对应，则在二者比例适当处形成白色沉淀 线；若抗原和抗体无关就不会出现沉淀线。 此试验可以检测抗原或抗体的纯度，滴定 抗体的效价，以及用已知抗原（抗体）检 测和分析未知抗体（抗原）。
双向琼脂扩散试验
三、步骤
• • • • • • • • 称取1g琼脂粉，加至100ml 8%高渗盐水中，配制1%琼脂凝胶； 稍冷至55 ℃却后浇板(4ml/块)，注意载玻片应放水平，琼脂勿倒出板外； 待凝固后在琼脂上打梅花孔(孔径2mm,孔距3mm)，孔内的琼脂如未吸出 则用注射器针头挑出 封底：将玻片于酒精灯上烘烤背面（温度不宜过高，以不烫手为宜），使 琼脂与玻片紧贴； 将抗体按二倍比稀释法稀释成1:2，1:4，1:8，1:16，1:32 中间孔加抗原，周围孔加倍比稀释抗体，其中一个 孔加滴入生理盐水作 为对照（小心加样，不要溢出） 置37 ℃湿盒24-48h 结果观察：在抗原抗体比例合适处，出现白色沉淀，以出现明显的沉淀线 的最高稀释度为该抗体的效价
中和反应
• 针对病毒的一些蛋白质抗原或抗原表位 的抗体与病毒结合后可以中和病毒的感 染性。 • 病毒中和试验可以在细胞培养、鸡胚或 动物上进行，一般将抗体作稀释，与一 定量的病毒混合，然后检测其在细胞培 养、鸡胚或动物上的残余感染性。
• 终点是以抑制细胞病变（细胞培养）或 病毒复制（鸡胚或动物）的抗体最高稀 释度来表示。 • 中和试验具有很强的特异性，是检测病 毒和新分离病毒毒株的鉴定最经典的方 法，也可用于检测病毒感染动物血清中 的抗体。
四、作业
• 实验报告（画图并解释实验结果） • 琼扩试验应注意哪些事项？ • 琼扩试验有何意义？
• 单向琼脂扩散试验：指可溶性抗原在相 应抗体的琼脂介质中的扩散，可定性、 定量抗原
• 双向琼脂扩散试验，是将抗原和相应抗 体分别加入同一凝胶板内的相邻小孔中。 两者相互扩散，当扩散到他们的浓度比 例合适的部位相遇时，就会形成抗原抗 体复合物的沉淀
二、实验材料
• • • • 法氏囊病毒琼扩抗原 法氏囊琼扩阳性血清 1%琼脂 玻片、打孔器、加样器、tip头等
实验七琼脂免疫扩散试验
THANKS
感谢观看
04
结果分析
结果判读
阳性结果
如果抗原和抗体在琼脂板中扩散，形成一条清晰的沉淀线，说明 抗原和抗体发生了特异性结合，为阳性结果。
阴性结果
如果抗原和抗体在琼脂板中扩散后，没有形成明显的沉淀线，说明 抗原和抗体没有发生特异性结合，为阴性结果。
干扰因素
在结果判读时，需要注意排除非特异性结合、沉淀物干扰等因素的 干扰，确保结果的准确性。
合，从而确定待测物的含量。
实验优缺点分析
优点
本实验操作简便，结果直观，可用于大量样品的快速检测。 同时，琼脂免疫扩散技术具有较高的特异性，能够有效地排 除非特异性干扰。
缺点
由于本实验依赖于抗原与抗体之间的特异性结合，因此对于 某些抗原或抗体，可能存在交叉反应或假阳性结果。此外， 琼脂免疫扩散技术灵敏度相对较低，对于低浓度待测物的检 测可能会出现误差。
实验改进和拓展建议
改进建议
可以采用双抗体夹心法等技术提高实验的灵敏度和特异性，减少交叉反应和假阳性结果的出现。同时 ，可以通过优化实验条件，提高实验的准确性和可靠性。
拓展建议
将琼脂免疫扩散技术应用于其他生物学领域，如病毒学、细菌学、免疫学等，以进一步拓展其应用范 围。同时，可以结合现代生物学技术，如基因工程、蛋白质工程等，对实验进行改进和优化。
结果解释
确定抗原和抗体的
关系
通过琼脂免疫扩散试验，可以确 定抗原和抗体之间的亲和力和特 异性关系，有助于进一步了解抗 原和抗体的性质。
检测抗原或抗体的
存在
通过琼脂免疫扩散试验，可以检 测样本中抗原或抗体的存在，有 助于疾病的诊断和免疫状态的评 估。
抗体效价的测定
通过琼脂免疫扩散试验，可以测 定抗体效价，了解机体对某种抗 原的免疫应答强度。
生化大实验双向琼脂免疫扩散
五 注意事项
1.用琼脂浇培养皿时，培养皿必须保持水平位置。
2.每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被 加满，又必须不使样品溢出孔外。 3.打孔时注意不要将孔弄破。
六 复习题
1.什么是抗原？ 2.什么是抗体？ 3.双向免疫扩散的原理及应用。
2用已知抗血清或抗原检测未知抗原或抗双向免疫扩散常见孔型有三孔型双孔型双排孔型梅花孔型见图1双向免疫琼脂扩散孔型双向免疫琼脂扩散孔型三孔型双孔型梅花孔型双排孔型双排孔型1
纯度检测方法二：
双向免疫扩散试验
一实验目的
学习双向免疫扩散实验原理 掌握双向免疫扩散实验操作方法
基本概念
抗原：抗原（antigenicity）是指能够刺激机体 产生（特异性）免疫应答，并能与免疫应答 产物抗体和致敏淋巴细胞在体外结合，发生 免疫效应（特异性反应）的物质。 抗体：抗体(antibody)指机体的免疫系统在抗 原刺激下，由B淋巴细胞分化成的浆细胞所产 生的、可与相应抗原发生特异性结合反应的 免疫球蛋白。
二 实验原理
双向免疫扩散是一种定性试验。将抗原、抗体分 别加入琼脂板相对应的小孔中，使两者互相扩散， 在比例适当处形成可见的沉淀线。观察沉淀线的 位置、数量、形状，以及对比关系，可对抗原或 抗体进行定性分析，常用于: （ 1 ）抗原或抗体的纯度鉴定。也可对抗体效价进行 初步估算。 （ 2 ）用已知抗血清（或抗原）检测未知抗原（或抗 体） （3）抗原或抗体相对分子量的估计 双向免疫扩散常见孔型有三孔型、双孔型、双排 孔型、梅花孔型（见图1）
○ ○ ○ 三孔型
○ ○
双孔型
○ ○ ○ ○ 双排孔型
○ ○○○ ○
梅花孔型
图1 双向免疫琼脂扩散孔型
药敏试验(扩散法)操作方法PPT课件
敏感（S）：表示该药物对细菌的MIC值低于常规剂量下的抗菌 药物血液浓 度或组织浓度4-8倍，可以用常规剂量治愈。
中介（I）：表示该药物对细菌的MIC值接近于常规剂量给药后的血药浓度 或组织药物浓度，细菌对该药的敏感性降低，但仍可用于生理性浓集部位的 感染或使用高剂量药物进行治疗（注：必须考虑高剂量的安全性）。
二、常用的药敏测定方法
1、扩散法：纸片法、牛津杯法、打孔法等。
纸片法 手工测试的方法，通过测试药物纸片在固体培养基 上的抑菌圈的大小，判断细菌对该种药物是否敏感。目前临床上 广泛使用此法。定性
2、稀释法：琼脂稀释法、液体稀释法（试管、微量）
通过测试细菌在含不同浓度药物培养基内的生长情况，判断 其最低抑菌浓度（MIC）。自动化仪器均采用液体稀释法为药敏 试验的方法。 定量
2、药片吸水量的测定 在上述药片用微量移液器进行滴 加蒸馏水，最可使药片完全浸透又不滴水为宜，最终计 算出每片药片的吸水量。一般常用直经6mm的定性滤纸 药片吸水量为0.01ml。
药液的制备（用于商品药的试验）：
按兽药说明书(或标签)上标明的治疗量的10-20倍比例配制药液。 如某药品：100g兑水100kg，表明该药治疗量为1ห้องสมุดไป่ตู้兑水1L，配制 药液时就是1g加50-100ml水或1L水加10-20g药品，即为配制药敏 片所用的药液浓度。
2、成药（复方成分） 多种联合 的抗菌药物制剂应以其成分中某种 含量最高的抗菌药物为标准稀释成 有效浓度。但多数厂家由于产品配 方机密，多按产品用量进行配制。 药敏片可由厂家提供，也可自制。
试验8单向琼脂免疫扩散试验
实验 8 单向琼脂免疫扩散试验一、目的了解单向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。
原理将某种特异性抗体混合于琼脂中，制成含抗体的琼脂板，再于琼脂板上打孔，并将一定量的抗原加入孔中。
抗体与琼脂混合后，不会再扩散，只有孔中抗原向四周呈辐射状扩散，如抗原与已知的抗体相对应，在两者比例适合处即出现由免疫复合物所形成的白色沉淀环，沉淀环的大小（直径或面积）与抗原浓度成正比。
以不同浓度的标准抗原与固定浓度的抗血清反应后测得沉淀环直径，然后从标准曲线中求得其含量。
主要用于测定血清IgG、IgM、IgA和补体成分的含量。
材料1. 抗原：待测人血清、已知含量的IgG参考蛋白2. 抗体：抗人IgG抗体3. 3%琼脂凝胶、4.5ⅹ10cm塑料板、直径3mm打孔器、注射器针头、定量加样器、湿盒（盒内铺有湿纱布）、半对数坐标纸。
方法1. 抗体琼脂板的制备（1）将3%琼脂置沸水浴加热溶化，吸取6ml加至试管内，置56水浴保温。
（2）用 0.9%生理盐水将抗人IgG抗体作适当稀释，吸取稀释好的抗人IgG6ml加至另一试管，置56℃水浴保温。
（3）将上述在56℃中保温的琼脂和已稀释好的抗体充分混匀，立即将此12ml含抗体的琼脂倾注于放在水平台上的塑料板上，待板冷却。
此抗体琼脂板的厚度为2mm，琼脂浓度为1.5%。
2. 稀释参考血清和待测血清;（1）稀释参考血清：每支冻干参考血清中加入蒸馏水0.5ml，待完全溶解后，用生理盐水稀释成几个不同稀释度。
例如参考血清IgG含量为11.66mg/ml。
参考血清稀释度1：10 1：16 1：20 1：32 1：40 1：64IgG相应含量为1166 728 583 364 291 182（2）待测血清用生理盐水作1：40稀释。
3. 打孔用打孔器在琼脂板上打孔，孔径3mm，孔间距15mm，用注射器针头挑出孔中琼脂，不可损坏孔缘。
4. 加样打孔后立即用微量加样器分别吸取各种稀释度参考血清10ul，准确地加到琼脂板孔中，每种稀释度加二个孔。
试验9双向琼脂扩散试验
实验9双向琼脂扩散试验目的了解双向琼脂免疫扩散试验的原理和操作过程。
原理将可溶性抗原和抗体分别加到琼脂板上相应的小孔中，使两者各自向四周扩散，如抗原与抗体相对应，两 者相遇即发生特异性结合，并在比例适合处形成白色沉淀线。
如果所加抗原和抗体标本中分别含有若干与 血清学反应无关的抗原抗体，则因各种抗原的扩散系数和各对抗原抗体间的最适比例不同，以及抗原抗体 复合物所形成的沉淀线具有选择性渗透屏障作用，扩散后可以形成若干条沉淀线，一条沉淀线代表一对抗 原抗体。
因此，通过双向免疫扩散试验，可用已知抗体（或抗原）检测未知抗原（抗体），可鉴定抗原性 物质性或免疫血清的浓度、纯度及比较抗原之间的异同点。
主要用于分析抗原或抗体成分定性鉴定；抗原、 抗体的纯度以及抗体效价的测定。
本实验以检测血清甲胎蛋白（AFP ）为例。
材料1. 1.2%生理盐水琼脂。
2. 待检血清、肝癌病人AFP 阳性血清（或脐带血）。
3. AFP 诊断血清（抗AFP 抗体）。
4. 载玻片、琼脂板打孔器、微量加样器、吸管等。
方法1. 琼脂板的制备将载玻片置于水平桌面上，取已溶化的盐水琼脂3.5ml,倾注于载玻片上，使其自 然流成水平面。
待琼脂凝固后，用打孔器按图打孔，孔径3mm,孔距5mm,挑出孔中琼脂。
2. 加样 于中央孔加入AFP 诊断血清，周围1、4孔加入已知AFP 阳性对照，2、3、5、6孔分别加 入待检血清。
（不同样本应更换吸头）3. 反应 将琼脂板放入湿盒内置37温箱中，24h 后取出观察结果。
结果观察观察孔间沉淀线的数目及特征。
本试验1、4两孔（AFP 阳性血清）与中央孔（抗AFP 抗体）之 间应出现清晰的乳白色沉淀线。
其余各孔 则根据与中央孔之间有无沉淀线的特征判 断结果。
如图所示，2孔待检血清标本与中 央孔产生沉淀线，并与相邻阳性对照所产 生的沉淀线互相融合，则表示阳性：3、5、 6孔与7孔间无沉淀线，为实验阴性。
注意事项1. 加样时不要将琼脂划破，以免影响沉淀线的形成。
《双向琼脂扩散试》课件
缺点
影响因素多
双向琼脂扩散试验的结果受到多种因 素的影响，如抗原和抗体的质量、浓 度、扩散速度等，可能导致试验结果 的差异。
试验周期较长
由于抗原和抗体需要在琼脂凝胶中扩 散，因此试验的完成需要一定的时间 。对于快速检测的需求，双向琼脂扩 散试验可能不是最佳选择。
灵敏度与特异性难以平衡
在提高试验的灵敏度的同时，可能会 牺牲部分特异性；反之亦然。因此， 在实际应用中需要权衡灵敏度和特异 性之间的平衡。
主观性较强
试验结果的判断依赖于操作者的主观 观察，因此结果的准确性和可靠性可 能受到操作人员经验和技术水平的影 响。
05
双向琼脂扩散试验的改进与发 展趋势
改进方法与技术
01
02
03
04
优化试验条件
通过调整温度、pH值、离子 强度等参数，提高试验的稳定
性和准确性。
自动化与智能化
引入自动化设备和技术，实现 试验过程的自动化和智能化，
优点
操作简便
灵敏度高
双向琼脂扩散试验是一种经典的血清学检 测方法，操作简便，易于在实验室或临床 环境中实施。
该试验对微量抗原和抗体具有较强的检测 能力，能够检测出低浓度的抗原或抗体。
特异性好
结果直观
由于采用琼脂凝胶作为载体，抗原和抗体 在凝胶中扩散，形成浓度梯度，从而达到 高度特异性识别的效果。
试验结果可以通过观察凝胶上的沉淀线来 直接判断，无需复杂的仪器设备。
食品中病原菌检测
通过双向琼脂扩散试验，可以检测食品中是否存在某些病原菌， 确保食品安全。
食品添加剂检测
该试验也可用于检测食品中是否含有超标的食品添加剂，如防腐剂 、色素等。
食品过敏原检测
双向琼脂扩散试验课件
在疫苗研制中的应用
疫苗有效性评估
通过检测免疫后机体的抗体反应，评 估疫苗的保护效果和免疫原性。
疫苗质量监控
在疫苗生产过程中，通过检测抗原含 量和纯度，确保疫苗的质量和安全性 。
在抗体检测中的应用
免疫状态评估
检测机体的抗体水平，评估个体的免疫状态和免疫保护能力 。
疫苗接种效果监测
通过检测疫苗接种后机体产生的抗体，监测疫苗的免疫效果 和接种率。
单向琼脂扩散试验
将抗原或抗体固定在琼脂 凝胶的一侧，扩散后与相 应的抗体或抗原反应，形 成沉淀线。
对流琼脂扩散试验
将抗原和抗体分别加在琼 脂凝胶的相对两侧，使两 者在琼脂中相互扩散并反 应，形成沉淀环。
双向琼脂扩散试验
在琼脂凝胶中同时加入抗 原和抗体，两者在琼脂中 扩散并反应，形成沉淀线 或沉淀环。
THANKS
感谢观看
法性和合规性。
结果误差分析
误差来源分析
01
对试验过程中可能产生的误差来源进行分析，包括仪器误差、
操作误差、环境误差等。
误差传递分析
02
对试验误差进行传递分析，了解误差对试验结果的影响程度。
误差控制措施
03
根据误差分析结果，采取相应的控制措施，减小误差对试验结
果的影响，提高试验结果的准确性和可靠性。
02
试验材料与设备
试验材料
琼脂糖凝胶
用于制备凝胶板，选择适当的 琼脂糖类型和浓度。
标记笔
用于标记抗原和抗体位置，需 选择不脱色的标记笔。
抗原和抗体
选择适当的抗原和抗体是试验 成功的关键，需确保质量和纯 度。
硝酸纤维素膜
用于固定抗原和抗体，选择适 当的规格和品牌。
缓冲液
生化大实验双向琼脂免疫扩散
通过优化实验条件，可以同时进行多个样本的检测。
实验优缺点分析
实验周期较长
需要等待蛋白质在琼脂 中扩散，时间较长。
影响因素较多
实验结果受多种因素影 响，如温度、湿度、pH 值等。
定量分析不准确
由于扩散的非均一性和 不稳定性，定量分析不 够准确。
未来研究方向与展望
改进实验方法
进一步优化实验条件，提高实验的灵敏度和特异 性。
加样
将抗原或抗体溶液加入到相应的孔中，并让其扩 散。
加入抗体或抗原
将抗体或抗原溶液加入到凝胶板的另一侧的孔中， 让其扩散。
显色反应
观察凝胶板上是否出现沉淀线，如果出现则说明 抗原和抗体发生了反应。
结果分析
根据沉淀线的位置和清晰度，分析实验结果。
02
生化大实验双向琼脂免疫扩散的应 用
在医学诊断中的应用
应用拓展
将双向琼脂免疫扩散技术应用于更多领域，如疾 病诊断、药物研发等。
技术创新
结合其他技术手段，如纳米技术、生物信息学等， 创新发展新的蛋白质检测方法。
感谢您的观看
THANKS
严格按照实验步骤进行操作， 避免操作失误或遗漏。
注意观察实验过程中出现的异 常情况，如气泡、沉淀等，及 时处理并记录。
在实验过程中保持恒温，避免 温度波动对实验结果的影响。
实验后的处理和结果分析
清洗并整理实验器材，确保实验室整洁。
对实验结果进行记录和分析，确保数据的准确性 和可靠性。
根据实验结果进行总结和归纳，得出结论，为后 续研究提供参考和依据。
食品添加剂和污染物检测
检测食品中的添加剂和污染物，确保食品的质量和安全性。
03
实验操作注意事项
琼脂扩散
（3）置于湿盒，放在恒温培养箱中，37℃、 24h-48h。判定依据，周围1-5孔与中心孔之间出 现沉淀线，且与第6孔与中心孔形成的沉淀线发 生融合，结果为阳性，以最高稀释度的孔为反应 滴度。见图片。 6、注意事项 （1）琼脂凝胶的厚度及孔间距要适当，否则， 结果会受影响。 （2）最好选用优质琼脂糖，制备的凝胶更透明。
3.主要实验仪器及材料 恒温培养箱，微量加样器，琼脂糖，1%硫 柳汞，鸡传染性法氏囊病琼扩抗原和鸡传 染性法氏囊病参考阳性血清。 0.1mol/L、pH7.2PBS，生理盐水。 血清的稀释；结果判定和分析。
5.实验方法 （1）1.2%琼脂糖凝胶板的制备 称取1.2g优质琼脂糖，8g氯化钠，加120ml 蒸馏水，在微波炉中加热，使之完全溶化， 待水蒸发到100ml刻度处时停止加热。加 1ml 1%硫柳汞，混匀，分装，直径6cm的平 皿加9ml，冷却。
（2）用打孔器按适当间距打孔，如下图， 每组中心1孔加周围6孔，在酒精灯上烘 烤封底。在微量反应板上加生理盐水或 0.1mol/L、pH7.2PBS，对待检血清进行 倍比稀释。加样，周围5孔加倍比稀释的 待检血清，第6孔加鸡传染性法氏囊病参 考阳性血清，中心孔加鸡传染性法氏囊 病琼扩抗原，均加满。
实验二
双向双扩散试验
1.目的和要求 通过本次实验，可了解双向琼脂扩散试验 的原理和用途，掌握沉淀抗体效价的测定 方法，观察抗原和抗体在琼脂凝胶中形成 的沉淀线。
2.原理 10g/L琼脂糖凝胶呈多孔结构，孔径大约 80nm，各种抗原、抗体分子可以在里面自 由扩散。在琼脂糖凝胶板上，相距适当距 离打小孔，小孔内分别加适量的抗原和抗 体。将抗原液和抗体液分别加入同一琼脂 糖凝胶板内的相邻小孔中，抗原和抗体分 子在凝胶中顺浓度梯度自由扩散。
琼脂免疫扩散试验
目录
• 琼脂免疫扩散试验简介 • 试验材料和步骤 • 结果解读和影响因素 • 琼脂免疫扩散试验的应用 • 琼脂免疫扩散试验的改进和发展
趋势 • 参考文献
01
琼脂免疫扩散试验简介
定义和原理
定义
琼脂免疫扩散试验是一种基于抗原抗体反应的血清学检测方法，用于检测样品 中特定抗原或抗体的存在。
作为扩散介质，用于固定抗原 和抗体。
标记物
用于显示抗原抗体结合的可见 物质，如染料或荧光物质。
试验步骤
3. 加样
2. 凝胶制备
制备琼脂糖凝胶，并在适当位置 放置抗原点。
将抗体溶液加到凝胶的适当位置， 并确保不产生气泡。
4. 扩散
将凝胶在适宜的温度下孵育一定 时间，使抗体在凝胶中扩散。
1. 制备抗原和抗体
根据试验目的制备适量的抗原和 抗体溶液。
5. 结果观察
观察抗原抗体结合形成的可见带， 并根据结果进行解释。
注意事项
确保无菌操作
在试验过程中，应始终保持无菌操作以避免 污染。
避免气泡产生
在加样过程中应避免产生气泡，以免影响试 验结果。
控制温度和时间
确保凝胶孵育在适当的温度下进行，并控制 好时间，以保证试验结果的准确性。
拓展琼脂免疫扩散试验在临床诊断、食品 安全、环境监测等领域的应用范围，满足 更多实际需求。
06
参考文献
参考文献
[1] 赵丽, 赵丹, 赵宏伟,等. 琼脂免疫扩散试验在布鲁氏菌病诊断中的应用[J]. 中国地方病防治杂志, 2014, 29(4):3.
[2] 赵宏伟, 赵丽, 赵丹,等. 琼脂免疫扩散试验在布鲁氏菌病诊断中的应用[J]. 中国地方病防治杂志, 2014, 29(4):3.
琼脂扩散试验
琼脂扩散试验利用可溶性抗原与抗体在半固体琼脂内进行扩散，若抗原与抗体对应，并且比例适当，就会出现白色沉淀线，此为阳性反应.琼脂扩散试验可在试管内、平皿中以及玻片上的琼脂中进行。
又可分为单向琼脂扩散试验和双向琼脂扩散试验两类。
单向琼脂扩散试验是一种常用的定量检测抗原的方法.将适量抗体与琼脂混匀,浇注成板，凝固后,在板上打孔，孔中加入抗原，抗原就会向孔的四周扩散，边扩散边与琼脂中的抗体结合。
一定时间后，在两者比例适当处形成白色沉淀环.沉淀环的直径与抗原的浓度成正比。
如事先用不同浓度的标准抗原制成标准曲线,则从曲线中可求出标本中抗原的含量.本试验主要用于检测标本中各种免疫球蛋白和血清中各种补体成分的含量，敏感性很高。
双向琼脂扩散试验是将半固体琼脂倾注于平皿内或玻片上,待其凝固后,在琼脂板上打孔，将抗原、抗体分别注入小孔内，使两者相互扩散。
如果抗原、抗体相互对应，浓度、比例适当，则一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰可见的沉淀线。
双向琼脂扩散法可用来分析溶液中的多种抗原。
一对抗原、抗体系统只能形成一条沉淀线，不同的抗原抗体系统在琼脂中扩散的速度不同，可在琼脂中形成不同的沉淀线.本法主要是用于检测血清中各种免疫球蛋白、甲胎蛋白、乙肝表面抗原等。
缺点是需要时间过长，灵敏度不高。
琼脂免疫扩散试验材料与试剂1．琼脂粉2．平皿3．打孔器4．生理盐水或其他缓冲液，可加1/万的硫柳汞或叠氮钠防腐。
操作方法1．称取一定量的琼脂粉，按1％左右（0.8％～1。
5%）的比例加入生理盐水或缓冲液，水浴煮沸融化20min。
2．将融化的琼脂倒入平皿内，使厚度2mm～3mm。
自然冷却。
3．根据要求（孔径即孔的直径,孔距即两孔圆心之间的距离，包括两孔的半径）按模板打孔。
也可直接用组合打孔器打孔。
现在一般多打成梅花形孔图。
4．挑出孔内琼脂,注意不要挑破孔缘。
5．在火焰上缓缓加热，使孔底边缘的琼脂少许熔化，以封底，以免加样后液体从孔底渗漏。
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实验原理
利用可溶性抗原和抗体在半固体凝胶中进行相向扩散反应， 当抗原抗体分子相遇并达到适当比例时，就会互相结合、凝集， 在两孔之间比例最合适的位置上出现白色沉淀带，从而判定相应 的抗体和抗原。
可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓抗原检测和1月龄以上 鸡血清抗体检测。
阴性、不出现或不清楚。 3、加样时，注意不要产生气泡，以加满为度。 4、每加完不同的样后要更换枪头，以免造成污染。
实验步骤
抗原检测
Ag+
2
6
Ab+
3
5
Ag+
检测羽髓抗原
2，3，5，6孔分别 加入倍比稀释的待检羽髓浸液
抗体检测
1
2
6
Ag+
3
5
4
检测待检血清
1~5孔分别加入倍比稀释的待测效 价的血清，6孔加PBS
实验步骤
2．检测血清抗体时，中央孔内滴加马立克氏病病毒标准琼扩抗 原，周边孔滴加待检血清，但至少一孔加阳性血清，抗原和血 清的加入量以加满而不溢出为度。样品加毕后，将琼脂平皿加 盖后平放于加盖的湿盒内，37℃温箱中孵育8～24h，观察并记 录结果。测定抗体效价时可倍比稀释血清，以出现沉淀带的血 清最大稀释度为抗体效价。
实验步骤
3．检测抗原时，中央孔加马立克氏病标准阳性血清，周边1、4 孔加马立克氏病标准琼扩抗原，周边2、3、5、6孔加待检羽髓 浸液，即在试管内加入1～2滴PBS然后将羽髓在其中挤压而成。 加样后将琼脂平皿置湿盒内，于37℃温箱孵育，8～24h内观察 结果。
注意事项
1、切勿剧烈振荡融化后的琼脂糖，防止气泡的出现。 2、反应时间要适宜，时间过长，沉淀线可解离而导致假
实验二 马立克氏病 琼脂扩散实验
鸡马立克氏病是由 鸡马立克氏病病毒 （MDV）引起的鸡的一种 肿瘤性传染病。临床上以 消瘦、麻痹、皮肤和内脏 出现肿瘤为主要特征。可 造成严重的经济损失，是 世界养鸡业的主要疾 病之一。
鸡马立克氏病引起的劈叉姿势
马立克氏病诊断主要根据
➢ 流行病学 ➢ 临床症状 ➢ 病理组织学检查 ➢ 病毒分离鉴定 ➢ 血清学试验: ① 琼脂扩散实验(OIE推荐的替代试验方法)
大家应该也有点累了，稍作休息
大家有疑问的，可以询问和交
实验步骤
琼脂平板制备
0.01M PBS
1%琼脂粉
1／万硫柳汞
水浴加热融化
封底
实验步骤
鸡群马立克氏病感染情况的监测通常采用琼脂扩散试验， 检测对象包括：血清中马立克氏病病毒特异抗体或感染鸡羽髓 中马立克氏病病毒抗原。其操作方法如下： 1．琼脂糖平板制备 用0.01M pH7.4的PBS配制1％琼脂糖溶 液，水浴加温充分溶化后，加入培养皿，制成厚度约2～3mm厚 的琼脂糖凝胶板；置于室温下冷却凝固后，用7孔（梅花孔）打 孔器准确打孔，加热封底。
实验原理
沉淀线的特征与位置： 1 抗原、抗体的特异性和浓度 2 抗原、抗体分子的大小 3 扩散率
实验原理
a.如抗原抗体的浓度基本平衡时，此沉淀带的位置主要决定 于两者的扩散系数。
b.如果抗原过多，则沉淀带向抗体偏移，反之亦然。
实验原理
c.
抗原分子量>抗体分子量
抗原分子量=抗体分子量
抗原分子量<抗体分子量
实验原理
❖ 琼脂糖的疏散网状结构有利于大分子的自由迁移； ❖ 合适比例的抗原抗体结合后聚集形成沉淀； ❖ 沉淀的产生阻止抗原抗体复合物的自由运动； ❖ 沉淀带一经形成，就像一道特异性的屏障一样，继续扩散而
来的相同的抗原抗体，只能是沉淀带加浓加厚，而不能再向 外扩散，但对其他抗原抗体系统则无屏障作用。
标准琼扩抗原
待检羽髓浸液
此沉淀带的基本形式分为3种。
思考题
试分析在抗原和抗体分子量相同时，以下六种情况中抗原和 抗体的浓度差异以及在凝胶中的扩散率大小（用＞、＜、≈ 表示）
A BCDEF
Ag Ab
结果判定
当被检样品孔与中心孔之间形成清晰的沉淀线，并与周边已 知抗原孔的沉淀线互相融合时判为阳性；不出现沉淀线者判为 阴性
结果判定
已知抗原与阳性血清之间所产生的沉淀线末端弯向 被检样品孔内侧时，则该被检样品判为弱阳性。
Ab+
待检血清
Ag+
结果判定
被检材料可能出现两条以上沉淀线，其中一条与已知抗原和 阳性血清的沉淀线融合者判为阳性。当抗原存在多种成分时，将 呈现多条沉淀线以至交叉反应线，因此可用来检查抗原和免疫血 清的特异性、纯度或浓度，比较抗原之间的异同点，因而应用范 围较广。
AGP可用于20日龄以上马立克氏病鸡羽髓 抗原检测和1月龄以上鸡血清抗体检测。
② 酶联免疫吸附实验
实验目的要求、类型、仪器与材料
目的要求 了解琼脂扩散试验进行疾病诊断的操作和结果判定方法
仪器与材料 器材：琼脂打孔器、微量移液器或带胶乳头滴管、平皿等。 试剂：马立克氏病标准抗原、标准阳性血清和标准阴性血清。