实验七、双向琼脂扩散试验

实验七、琼脂扩散试验

一、实验目的

掌握双向琼脂扩散试验的原理、操作方法及结果判定方法。

二、实验原理

可溶性抗原（如蛋白质、多糖、脂多糖、病毒的可溶性抗原、结合蛋白等）与相应抗体在半固体琼脂凝胶内扩散，二者相遇，在比例合适处形成白色沉淀。抗原和抗体加到琼脂板上相对应的孔中，两者各自向四周扩散，如两者相对应，浓度比例合适，则经一定时间后，在抗原、抗体孔之间出现清晰致密的白色沉淀线。每一抗原与其相对应抗体只能形成一条沉淀线，若同时含有若干对抗原抗体系统，因其扩散速度的不同，可在琼脂中出现多条沉淀线。且根据沉淀线融合情况，还可鉴定两种抗原是完全相同还是部分相同。所以，可用此法来分析和鉴定标本中多种抗原或抗体成份，并用以测定抗原或抗体的效价。

三、材料与试剂

传染性法氏囊病毒标准抗原、传染性法氏囊病毒标准阳性抗体，待测鸡血清，精制琼脂粉，生理盐水、载玻片，打孔器（直径3mm）、湿盒、吸管等。

四、操作步骤

1、将琼脂糖1.0克、NaCl 8.0克、蒸馏水100ml装入三角烧瓶，煮沸，然后用吸管吸取7ml 加入平皿内（勿有气泡）使成约3mm厚的凝胶，待冷却凝固后按如下图方式打孔。（注意打孔完毕要封底）

2、加样。中间孔加标准抗原，外周孔加被检血清及阳性血清（如要测被检血清的效价，外周孔可倍比稀释后依次加入）。

3、将加好样品的琼脂板置于湿盒内，于37℃温箱内放置24小时后观察结果。

结果判断：阳性：标准对照孔之间有明显的沉淀线时，受检孔与中央孔之间形成沉淀线并与阳性对照沉淀线融合。阴性：受检孔与中央孔之间无沉淀线。

五、注意事项

1、每个孔的加样量应保持一致，既使每个孔都被加满，又必须不使样品溢出孔外。

2、打孔时注意避免产生裂缝或将琼脂与玻片脱离。

六、实验报告

1、说明环状沉淀试验检测结果；

2、画出双向琼脂扩散试验中你所观察到的沉淀线，并对其进行简要说明。

3、思考题

（1）影响琼脂扩散试验结果的因素有哪些？

（2）若试验结果观察不到沉淀线，可能原因有哪些？